2009年新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的进化及NA基因编码蛋白抗原性、酶活性位点、糖基化位点变异情况。方法:从NCBI基因库检索获得43株不同年代不同地域甲型流感病毒NA基因序列,用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA 4.0）软件进行基因进化分析和氨基酸序列分析。结果:2009年新型甲型H1N1流感病毒与禽H5N1流感病毒NA基因的同源性达到85％,潜在抗原位点氨基酸分布相同;所有毒株的酶活性中心位点高度保守,但糖基化位点有变异。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒的NA基因可能来源于禽H5N1流感病毒;神经氨酸酶抑制剂治疗有效。     

甲型H1N1流感病毒神经氨酸酶基因遗传进化分析

【目的】 了解季节性H1N1流感病毒与2009年新型H1N1流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的遗传进化关系,探讨甲型H1N1流感病毒的遗传变异规律｡【方法】 分别从2006年和2009年流感病人标本中分离并鉴定出季节性HIN1流感病毒和新型H1N1流感病毒,用RT-PCR技术扩增了病毒NA基因全序列,并对其分子进化和重要功能位点的遗传变异进行了分析｡ 【结果】 2009年新型H1N1流感病毒与2006年季节性HIN1流感病毒比较,NA基因的同源性较低(77.9% ~ 78.8 %),与世界各地不同年代代表株及WHO推荐的1979 ~ 2010年季节性流感疫苗株比较,NA基因的同源性也较低(78.1% ~ 79.3%),但与WHO推荐的2009年新型H1N1流感疫苗株比较同源性则高达99%以上;系统进化分析结果表明,2009年新型H1N1流感病毒NA基因与欧亚猪流感病毒株A/swine/Belgium/1/1983的亲缘关系最近;并发现自2005年以来季节性H1N1流感病毒NA基因的某些抗原位点和神经氨酸酶活性位点已发生了变异｡【结论】 2009年新型H1N1流感病毒NA基因可能来源于欧亚猪流感病毒;接种季节性流感疫苗不能对本次流行的新型流感产生有效的免疫保护作用;季节性H1N1流感病毒在流行过程中NA基因已发生了一定的变异,有必要持续跟踪和监测病毒的变异情况｡     

绵马贯众中间苯三酚类化合物抗H1N1流感病毒神经氨酸酶的活性成分筛选

目的研究绵马贯众中间苯三酚类化合物对H1N1流感病毒神经氨酸酶（NA）的抑制作用。方法通过检索建立了由34个间苯三酚类化合物组成的配体库,从ProteinDataBank中下载的Xray晶体三维结构文件,采用AutoDockVina软件及LigPlot+软件筛选出与NA结合能较低且与NA形成氢链作用较强的分子;采用荧光法检测化合物对NA活性的作用。结果通过分子对接筛选出4个（绵马酸ABA、绵马酸ABB、绵马酸ABP、绵马贯众素ABBA）与NA有较好结合的化合物,并对这4个化合物进行活性验证,结果表明绵马贯众素ABBA对NA抑制作用最强,IC50值为（26.73±0.57）μmol/L。结论绵马贯众中绵马贯众素ABBA具有较好的抗H1N1流感病毒NA的作用,为开发新的抗流感病毒药物奠定了基础。     

禽流感病毒H5N1基因突变对神经氨酸酶抑制剂敏感性和神经氨酸酶活性的影响

目的 研究感染人的禽流感病毒H5N1神经氨酸酶突变I117V,I314V,I117V+I314V对神经氨酸酶抑制剂(NAIs)敏感性和神经氨酸酶(NA)活性的影响.方法 定点突变技术将变异位点引入禽流感病毒株A/Vietnam/1203/04(H5N1)(VN1203)的NA基因中,以A/WSN/33(H1N1)为背景,通过反向遗传学方法构建重组流感病毒,鸡胚传代增殖病毒,荧光定量评估病毒对NAIs的敏感性和NA活性(IC50值和Km,Ki值).结果 与野生株VN1203相比,I117V使NA对奥司他韦敏感性降低(IC50值升高了17倍,Ki值升高了20倍),对扎那米韦敏感性无明显影响(IC50值升高了2倍,Ki值升高了3倍),NA活性降低(Km值升高了23倍).I314V对NAIs敏感性和NA活性均无明显影响.结论 初步结果认为NA突变I117V和I314V对感染人的禽流感病毒H5N1并不产生NAIs耐药,临床上仍然可以用奥司他韦或扎那米韦抗病毒治疗.     

甲型H1N1流感病毒HA1、NAe重组蛋白的表达及纯化效率研究

目的研究甲型H1N1流感病毒血凝素HA1及神经氨酸酶NAe重组蛋白的表达效率及纯化方法。方法在2009年广东省首株甲型H1N1流感病毒的HA和NA全长基因克隆的基础上,去除其信号肽（或信号锚定序列）和跨膜结构,在原核表达体系中表达HA1和NAe蛋白,采用SDS-PAGE和Western-blot法研究蛋白的表达效率、IPTG诱导作用及His Bind树脂纯化对蛋白免疫活性的影响。结果获得了具有免疫活性的高浓度和高纯度的HA1-57 290 Mr及NAe-69 280 Mr重组蛋白。结论截短优化的甲型H1N1流感病毒HA1、NAe重组基因经IPTG诱导可在原核表达体系中高效表达且纯化后具有较好的免疫活性。     

江苏省2013年甲型H1N1(09pdm)流感病毒血凝素和神经氨酸酶分子特征分析

目的:分析江苏省2013年甲型H1N1(09pdm)流感病毒血凝素(hemagglutinin,HA)和神经氨酸酶(neuraminidase,NA)变异情况,分析其遗传进化特征?方法:按照流感样病例定义,收集江苏省各哨点医院流感样病例标本,阳性样本经病毒分离培养及亚型鉴定?选取2013年不同时间段?不同地区具有代表性的14株甲型H1N1(09pdm)阳性毒株,利用特异性引物扩增HA?NA基因,测序并分析其遗传进化特征?结果:14株分离毒株与疫苗株A/California/07/2009(H1N1)的HA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为97.6%~98.4%和96.5%~98.0%?NA基因核苷酸和氨基酸同源性分别为98.4%~98.9%和97.0%~98.5%?遗传进化分析表明,14株分离株HA和NA基因分属于不同的进化谱系?分子特征表现为HA氨基酸序列出现D114N?K300E?E516K的变异,NA分子特征表现为N44S位点变异?从2013年左右开始甲型H1N1(09pdm)流感基因多样性增加;通过FEL模型得到一个正向压力选择HA氨基酸位点310,一个正向压力选择NA氨基酸位点4,通过REL模型得到9个正向压力选择HA氨基酸位点179?180?239?301?303?310?311?312?313(含位点310),5个正向压力选择NA氨基酸位点4?23?52?287?374(含位点4)?HA蛋白具有9个潜在糖基化位点,7个位于HA1上,2个位于HA2上;NA蛋白共有9个潜在糖基化位点?14株分离毒株在NA蛋白酶活性中心及周围辅助位点上均未发现变异?结论:2013年江苏省甲型H1N1(09pdm)流感HA?NA基因变异加快,遗传多样性增加,未来的遗传进化值得进一步关注?     

中国2009年甲型H1N1流感病毒进化分析

目的研究2009年中国甲型H1N1流感病毒的进化特性和变异情况,为甲型H1N1流感的监控和防治提供科学依据。方法利用ClustaX进行序列比对,以Bioedit软件进行序列同源性分析,使用Mega 4.0软件采用邻位相连算法构建进化树,对2009年登录在Genbank数据库中的中国甲型H1N1流感病毒的HA、NA、M蛋白的氨基酸序列进行系统进化分析。结果中国2009年甲型H1N1流感病毒分离株与美国分离株[A/California/04/2009（H1N1）]具有很近的亲缘关系,不同省份分离株之间的HA、NA、M蛋白相互交叉渗透,但同时各个省份间暴发的H1N1流感病毒的HA蛋白又具有一定的聚集性。香港分离株[A/Hong Kong/2369/2009（H1N1）]和上海分离株[A/Shanghai/LWS1/2009（H1N1）]产生了对达菲的耐药性,其他毒株仍然敏感;上海分离株[A/Shanghai/LWS1/2009（H1N1）]对金刚烷胺类药物敏感,其余毒株均对其耐药。结论本研究表明,中国2009年甲型H1N1流感病毒不仅具有很强的保守性,同时又具有一定的区域特异性,毒株相对稳定,没有出现大的变异。     

新型甲型H7N9流感病毒神经氨酸酶基因进化分析

目的探讨2013年新型甲型H7N9流感病毒神经氨酸酶(NA)基因的进化,及其编码蛋白重要氨基酸位点的变异情况。方法从美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库和全球禽流感基因共享数据库(GISAID)下载不同年代、不同地区甲型流感病毒N9亚型的NA基因序列,利用MEGA 5.05和BioEdit软件对基因的核苷酸序列和氨基酸序列进行分析。结果 2013年新型甲型H7N9流感病毒NA基因与2010年捷克共和国H11N9禽流感病毒的相似性达到96%;新型流感病毒存在5个氨基酸的缺失;其中1株新型病毒可能的酶活性位点发生了变异。结论 2013年新型甲型H7N9流感病毒的NA基因可能是由H11N9进化而来;氨基酸的缺失可能是造成人感染和较高病死率的原因。     

2009年至2011年新甲型H1N1流感病毒HA基因同源性比较与进化分析

[目的]分析杭州市2009年1月至2011年1月新甲型H1N1流感病毒血凝素（HA）的基因序列,探讨该病毒的遗传变异和分子特性。[方法]应用RT-PCR的方法从临床标本中扩增新甲型H1N1流感病毒HA基因片段并测序。利用DNAMAN和Sequencher4.7软件对HA基因序列进行分析,比较HA基因氨基酸亲缘系数并绘制进化树。[结果]成功地对15例新甲型H1N1病毒的HA基因进行扩增并测序,2009年1月至2011年1月新甲型H1N1流感病毒的HA基因的氨基酸序列与参考株具有高度的同源性,其亲缘系数为98.9%~100%,且HA基因氨基酸序列发生了一定的变异。[结论]2009年至2011年新甲型H1N1流感病毒的基因组HA序列与我国和其他国家的新甲型H1N1流感病毒具有高度的同源性,但HA基因的氨基酸序列发生了变异,可能与患者的病情有关,因此需密切关注新甲型H1N1流感病毒的流行情况。     

人流感病毒H1N1与禽流感病毒H5N1感染人神经胶质细胞的实验研究

目的：研究人流感病毒（H1N1）及禽流感病毒（H5N1）感染人神经胶质细胞后,促炎症因子的分泌特点。方法：分离培养人胶质细胞,用H1N1及H5N1分别感染刺激人胶质细胞;用RT-PCR技术探求白细胞介素（IL）-1β、-6和肿瘤坏死因子（TNF）-α变化。结果：与阴性对照比,H1N1和H5N1感染人神经胶质细胞IL-1β、-6和TNF-α的表达量均增高,且H5N1的表达量多于H1N1。结论：H1N1与H5N1可体外感染人神经胶质细胞,并诱导其分泌大量促炎症因子,提示此与流感病毒感染中枢神经系统所致的功能紊乱及免疫病理损伤有关。     

重庆市2009～2014年甲型 H1N1流感病毒分离株 HA基因变异分析

目的：对2009～2014年分离得到的甲型H1N1流感病毒进行血凝素（HA）基因测序分析,与世界卫生组织（WHO）推荐疫苗株A／California／07／2009（H1N1）比对,研究其基因变异情况。方法按分离时间及地点不同,选取47株2011～2014年分离得到的甲型H1N1流感病毒进行测序,同时选取既往已有的25株2009年甲型H1N1流感病毒的序列结果,经分子生物学软件进行核苷酸及氨基酸序列分析,并绘制系统进化树。结果2009、2011～2014年的新型甲型 H1N1流感病毒与疫苗株均位于一个大的分枝下,各病毒间的关系均较近。72株分离株的 H A基因总的核苷酸差异在0～2．7％之间,氨基酸差异在0～3．1％之间;与疫苗株A／California／07／2009（H1N1）的核苷酸差异在0．4％～2．4％之间,氨基酸差异在0．9％～3．1％之间。氨基酸变异情况随着年份增加累积得更多,但在氨基酸序列上仍显示为低致病性流感病毒特征;2009年有9株病毒株丢失481位的糖基化位点,2013年有6株病毒株增加位于162位的糖基化位点。结论 WHO推荐的甲型 H1N1疫苗总体上对重庆地区的人群仍有较好的保护作用,但随着时间推移,部分甲型 H1N1流感病毒株可能已发生抗原漂移,需继续对其监测。     

2009年新型甲型H1N1流感病毒血凝素基因进化分析

目的:探讨2009年新型甲（A）型H1N1流感病毒血凝素（HA）基因与世界各地不同年代分离的A/H1N1代表株HA基因的进化关系。方法:从NCBI数据库下载2009年新型A/H1N1亚型流感病毒的HA基因序列以及以往流行的人、猪和禽的A/H1N1亚型流感病毒参考序列,采用Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0（MEGA4.0）软件进行序列比对和构建系统进化树,并分别比较2009年新型甲型H1N1流感病毒HA基因与北美地区、欧洲地区、亚洲地区A/H1N1流感病毒HA基因编码蛋白的氨基酸序列。结果:不同时期人A/H1N1亚型流感病毒代表株HA基因进化分析显示：2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因与1976~2007年北美地区分离的7株人A/H1N1亚型流感病毒具有较高的同源性,与欧洲和亚洲地区的同源性较低。不同种属间A/H1N1亚型流感病毒HA基因进化分析显示：2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因与1998和2007年北美地区分离的A/H1N1猪流感病毒的HA基因进化关系较近,与欧洲及亚洲地区分离的A/H1N1猪流感病毒及A/H1N1禽流感病毒进化关系较远。氨基酸比对结果显示2009年新型A/H1N1流感病毒HA基因的重要抗原位点与北美地区分离的A/H1N1猪流感病毒相近,与欧洲和亚洲地区分离的A/H1N1猪流感病毒及人类流感病毒疫苗株相比变化较大。结论:2009年新型甲型H1N1流感病毒HA基因可能是北美地区甲型H1N1猪流感病毒长期进化并与该地区人A/H1N1流感病毒部分基因片段重排的结果,对人H1N1甲型流感病毒疫苗可能并不敏感。     

江门市新会区居民甲型H1N1流感病毒抗体水平调查

目的了解新会区居民对甲型H1N1流感的免疫水平。方法采用多阶段分层随机抽样方法,三次分别在新会区的城镇和农村对不同年龄人群进行问卷调查并采集血清检测甲型H1N1流感病毒抗体。结果三轮调查共抽样480人,抗体阳性107人,阳性率为22.29%。不同年龄组中4~6和7~19岁阳性率分别为30.00%和31.77%,高于其他年龄组（χ2=26.75,P〈0.05）。疫苗接种组抗体阳性率高于未接种疫苗组。有症状和无症状者的抗体阳性分别为25.72%和18.83%,差异无统计学意义（χ2=3.47,P〉0.05）,抗体阳性者中42.06%没有出现过任何流感症状。结论新会区已经有22.29%人群具有甲型H1N1流感病毒抗体,人群中已经建立一定的免疫屏障。     

H5N1高致病性禽流感病毒HA基因在昆虫细胞中的表达

目的:扩增高致病性禽流感H5N1亚型病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因,并进行真核表达?方法:抽提毒株A/Jiangsu/08-6基因组RNA,反转录为cDNA,用特异性引物扩增HA基因?HA经BamHⅠ/XhoⅠ双酶切后克隆到pFastBac-GP67B载体上,筛选出阳性重组转座质粒pFastBac-GP67B-HA,并将其进一步转化DH10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定后,获得重组穿梭载体(rBacmid-HA),再通过Cellfectin Ⅱ试剂转染rBacmid-HA至对数生长期的sf9昆虫细胞,进行目的蛋白的真核表达?分别用SDS-PAGE?Western blot?血凝试验以及质谱分析对其进行鉴定?结果:HA基因在sf9细胞表达的蛋白分子量约70 000?血凝试验表明重组HA蛋白可使鸡红细胞发生凝集?质谱分析鉴定该重组蛋白为HA 蛋白?结论:重组HA 蛋白具有天然HA蛋白的活性,为亚单位疫苗的研制及中和抗体的筛选奠定了基础?     

H1N1流感病毒D151G突变株对奥司他韦的抗药性研究及药物筛选

目的:观察H1N1流感病毒D151G突变株对奥司他韦的抗药性,筛选对D151G突变神经氨酸酶具有抑制作用的化合物.方法:采用分子动力学模拟和MM-GBSA自由能计算方法判断H1N1流感病毒D151G突变株对奥司他韦的抗药性;应用分子对接软件Autodoek从ZINC数据库筛选与D151G突变神经氨酸酶结合能力较强的化合...     

甲型H1N1流感病毒裂解疫苗与流行性感冒裂解疫苗同期接种不良反应的对比分析

目的通过比较甲型H1N1流感病毒裂解疫苗(甲流疫苗)和流行性感冒裂解疫苗(普流疫苗)同期接种的不良反应,分析甲流疫苗的安全性。方法收集2种疫苗接种记录,对其中记录的不良反应进行流行病学统计分析。结果甲流疫苗接种156 738人次,发生不良反应18人,发生率11.48/10万;普流疫苗接种116994人,发生不良反应7人,发生率5.98/10万。分析发现,甲流疫苗接种的不良反应发生率与全国水平、普流疫苗相当;此外2种疫苗接种的不良反应在职业、年龄及性别分布上相同;2种疫苗的不良反应发生率在16～25岁年龄段、学生中较高,且有随着年龄段的升高,发生率有下降的趋势(rs=-0.999,P<0.001)。此外,2种疫苗接种后发生不良反应的临床症状除肌肉痛外,其余症状的发生无统计学差别。结论综上所述,甲流疫苗临床观察时间短、接种后有发生不良反应的可能,但总体来看,接种甲流疫苗是安全有效的,能有效保护甲流的易感人群。