恶性疟原虫var基因相关研究新进展

本文通过对恶性疟原虫变异抗原基因var基因家族的相关变异机制,在7号染色体var基因区域(pfemp1)和抗药基因pfcrt的特定区域的相关研究报道,以及变异var基因与妊娠感染疟疾的相关致病机制进行综述。     

恶性疟原虫海南株节结相关组氨酸富集蛋白基因的克隆及序列分析

目的 克隆恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）节结相关组氨酸富集蛋白（KAHRP）基因，并进行序列分析。方法 采用PCR技术分两段从FCC1／HN株基因组A趸扩增出部分序列重叠的KAHRP基因片段，分别克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测定这2个片段的序列，从而得到全长KAHRP基因序列。应用AnthProt、DNAstar软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果 恶性疟原虫FC1/HN KAHRP全基因长2358个核苷酸，在112至564位核苷酸是内含子，全基因编码634个氨基酸残基，其中赖氨酸含量为14．35％，丙氨酸含量为9．15％，组氨酸含量为7．72％；分子量为69．37kDa。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的3D7、FCR3、India-1、India-2、NF17、Palo-alto,PUPSP株KAHRP基因编码的氨基酸残残留基有52个氨基酸残基替代位点，并存在氨基酸残基序列的增加和缺失。经多参数综合分析，可能有5个潜在的抗原表位区。结论 克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株KAHRP基因。序列测定及同源性分析表明，FCC1／HN株与其它分离株KAHRP基因编码的氨基酸序列存在一定差异。     

云南省不同地理株恶性疟原虫的MSP-2基因多态性研究

目的研究云南省不同地理株恶性疟原虫的裂殖子表面抗原蛋白基因2(MSP-2)的多态性，探索其多态性的地域特征，为鉴定不同地理株恶性疟原虫提供重要的科学依据。方法使用随机扩增多态DNA-多聚酶链反应(RAPD-PCR)为主的分子生物学方法。结果分析云南不同疟疾流行区的169份样本，PCR扩增获得6个不同大小的MSP-2基因片段，600bp片段占多，其频度为34．8％，540bp片段其次，占28．3％；同时显示具有一定的地理分布差异。结论研究证实云南不同地区恶性疟原虫的MSP-2具有较为明显的地理多态性特征。     

恶性疟原虫Pf332基因片段的克隆及表达

[目的]构建含恶性疟原虫Pf332抗原基因片段的重组质粒，并检测在大肠杆菌BL21/DE3中的表达情况。[方法]应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNAS中扩增Pf332基因（Pf332)片段，P332-R0、P332-R2，并分别插入pGEX4T-1原核表达载体，阳性克隆的重组质粒DNA经酶切及PCR扩增鉴定，用DNAstar软件对FCC1/HN株与3D7株Pf332和P332-R1、P332-R2片段进行同源性比较，由IPTG诱导在大肠杆菌BL21/DE3中表达重组蛋白。[结果]PCR扩增得到特异的FCC1/HN株Pf332片段，P332-R0、P332-R1、P332-R2，大小分别为489，429和393bp。酶切及PCR鉴定获得了正确的pGEX-P332-R0,pGEX-P332-R1,pGEX-P332-R2重组质粒，序列分析结果显示，与3D7株相比，FCC1/HN株P332-R1、P332-R2片段编码多肽分别缺少2、4个相应的重复单元，在大肠杆菌BL21/DE3中表达出3个重组蛋白，相对分子质量分别为46、44和42。[结论]扩增、克隆了恶性疟原虫Pf332片段，P332-R0、P332-R1、P332-R2，并在大肠杆菌BL21/DE3中成功表达，FCCl/HN株与3D7株的P332-R1、P332-R2片段编码多肽所包含的重复单元数目不同。     

恶性疟原虫海南、云南、安徽株裂殖子表面抗原MSA2基因的克隆和序列分析

应用ＰＣＲ技术扩增并克隆了恶性疟原虫海南、云南、安徽三个地理株的ＭＳＡ２基因，测定并分析了全基因序列。结果表明，海南、云南、安徽株ＭＳＡ２基因序列完全相同，全长为７９５ｂｐ，编码２６４个氨基酸，与ＦＣＱ－２７／ＰＮＧ株ＭＳＡ２高度同源。对抗原表位进行多参数综合分析表明，我国虫株除具有国外已确定的抗原表位ＳＴＮＳ、ＤＴＰＴＡＴＥ外，在第５３—７２位氢基酸间可能具有一个新的抗原表位。     

恶性疟原虫海南株（FCC1／HN）谷氨酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

目的 了解恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）谷氨酸脱氢酶（GDH）基因全编码区核苷酸序列变异情况。方法 PCR扩增恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）GDH基因全编码区,产物经EcoRI SalI酶切后,定向克隆至pGEX-4T-1质粒,采用Sanger双脱氧链末端终止法测序,与其它生物GDH进行同源性分析。结果 成功扩增了恶性疟原虫海南株（FCC1/HN）GDH编码基因,大小为1410bp,无内含子,与Thailand株GDH基因相比,两有2个碱基不同,推导的氨基酸序列完全相同;与蓝氏贾第鞭毛虫,克鲁氏锥虫和梭状芽孢杆菌GDH的同源性分别为57.90%(260/449),56.51%(243/430),42.05%(164/390);与人的GDH-1,GDH-2的同源性分别为29.02%（101/348）,28.73%(100/348)。结论 FCC1/HN株与Thailand株GDH高度同源,疟原虫GDH明显不同于其它生物GDH。     

恶性疟原虫Pf332基因片段的克隆及表达

【目的】构建含恶性疟原虫Pf332抗原基因片段的重组质粒 ,并检测在大肠杆菌BL2 1/DE3中的表达情况。【方法】应用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增Pf332基因 (Pf332 )片段 ,P332 R0、P332 R1、P332 R2 ,并分别插入pGEX 4T 1原核表达载体 ,阳性克隆的重组质粒DNA经酶切及PCR扩增鉴定。用DNAstar软件对FCC1/HN株与 3D7株Pf332的P332 R1、P332 R2片段进行同源性比较。由IPTG诱导在大肠杆菌BL2 1/DE3中表达重组蛋白。【结果】PCR扩增得到特异的FCC1/HN株Pf332片段 ,P332 R0、P332 R1、P332 R2 ,大小分别为 489、42 9和 393bp。酶切及PCR鉴定获得了正确的 pGEX P332 R0、pGEX P332 R1、pGEX P332 R2重组质粒。序列分析结果显示 ,与 3D7株相比 ,FCC1/HN株P332 R1、P332 R2片段编码多肽分别缺少 2、4个相应的重复单元。在大肠杆菌BL2 1/DE3中表达出 3个重组蛋白 ,相对分子质量分别为 46、44和 42。【结论】扩增、克隆了恶性疟原虫Pf332片段 ,P332 R0、P332 R1、P332 R2 ,并在大肠杆菌BL2 1/DE3中成功表达。FCC1/HN株与 3D7株的P332 R1、P332 R2片段编码多肽所包含的重复单元数目不同。     

恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)EBA-175Ⅱ区F2结构域基因的克隆与表达

目的 构建EBA-175Ⅱ区F2结构域基因的原核表达载体。方法采用PCR的方法从恶性疟原虫基因组DNA中扩增出EBA-175Ⅱ区F2结构域856～1848bp基因,定向克隆入PMD18-T质粒,再经BamHI和XhoI酶切亚克隆人高效表达载体pET23a( )。重组质粒经PCR、酶切、测序鉴定后,在BL21(DE3)菌株中进行IPTG诱导表达。结果重组质粒经序列测定证实插入基因为目的基因,符合表达框架,经IPTG诱导,在BL21(DE3)菌株中以非融合蛋白形式表达,SDS-PAGE电泳显示在约36．4kDa处可见明显蛋白增粗条带,与预期结果一致。结论成功构建了重组EBA～175Ⅱ区F2结构域基因表达载体,并在BL21(DE3)中有效表达。     

恶性疟原虫子孢子表面蛋白2基因的克隆与序列分析

目的：克隆恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)子孢子表面蛋白2(PfSSP2)基因，并进行序列分析。方法：根据PfSSP2基因已知序列设计合成一对引物，用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出PfSSP2基因，并克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测序，用DNAstar软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果：PCR扩增得到特异的FCC1／HN株PfSSP2基因序列，酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-PfSSP2重组质粒。测序表明，所克隆的PfSSP2基因大小为1680bp，编码559个氨基酸残基。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的3D7、DD2、FCR3、HB3A、K1、Thai814、Thai838、Thai842、Thai947及7G8株PfSSP2的氨基酸序列在33个位点存在氨基酸替代，1处氨基酸序列增加；各株间PfSSP2的氨基酸序列同源性都在95.7％以上。结论：克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株PfSSP2基因。序列测定及同源性分析表明，恶性疟原虫不同分离株间有高度的同源性。     

恶性疟原虫FCCl／HN株LDH基因的克隆及序列分析

目的 克隆并测定恶性疟原虫海南(FCCl／HN)株LDN基因序列,比较FCCl/HN株与国外分离株LDH基因序列的差异。方法 根据LDH基因已知序列设计合成一对引物,应用PCR技术从FCCl/HN株基因组DNA中扩增LDH基因,并将其克隆入pMDl8-T载体。用双脱氧链末端终止法进行基因序列测定,并用分子生物学软件进行不同分离株LDH基因序列的同源性比较。结果 PCR扩增得到特异的FCCl／HN株LDH基因片段并构建了pT—LDH重组质粒。恶性疟原虫FCCl／HN株LDH基因全长951bp,编码316个氨基酸。序列分析表明,我国恶性疟原虫FCCl／HN株与国外的3所、Honduras 1株LDH基因编码氨基酸序列完全一致。结论 成功克隆恶性疟原虫FCCl,HN株LDH基因。序列测定及同源性分析表明,FCCl/HN株与其它分离株的LDH基因序列高度保守。     

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白—2基因克隆及其在大肠杆菌中 …

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因,并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因,克隆插入ｐＵＣ１９,并重组人表达质粒载体中,转化大肠杆菌,诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原,对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段,经酶切鉴定和部分序列测定证实为Ｍ     

非洲婴幼儿恶性疟疾65例临床分析

目的探讨非洲婴幼儿恶性疟疾临床特点、诊治方法及其转归。方法回顾性分析确诊为恶性疟疾65例（其中脑型疟19例）住院婴幼儿的临床资料。结果65例恶性疟疾婴幼儿的血涂片均见到恶性疟原虫；临床表现以发热（100％），呕吐32例（49．2％），腹泻23例（36．9％），咳嗽27例（41．5％），抽搐12例（18．5％），意识障碍19例（29．1％），贫血52例（80．0％），脾肿大46例（71．6％），肝肿大41例（63．1％），脑膜刺激征19例（29．1％）。65例均接受青蒿琥酯抗疟的综合治疗，治愈60例，死亡5例。结论婴幼儿恶性疟疾临床表现复杂多样化且不够典型，尽早诊断、及时治疗是改善本病预后的关键；青蒿琥酯是治疗疟疾安全、有效的首选药物。     

恶性疟原虫MESA基因的克隆和测序

目的克隆、测定恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)成熟疟原虫感染红细胞表面抗原(MESA)基因序列，并进行序列分析。方法根据恶性疟原虫palo-alto株MESA基因已知序列，设计合成四对引物，用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出4个部分序列重叠的MESA基因片段，分别克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测定这4个基因片段的序列，拼接得到全长MESA基因序列。应用DNAstar、AnthProt软件辅助进行序列同源性比较和抗原表位区预测。结果PCR扩增得到特异的恶性疟原虫FCC1／HN株MESA基因片段，酶切及PCR鉴定获得了包含MESA基因片段的重组质粒。测序结果表明，FCC1／HN株MESA全基因编码区长4102bp，A T含量为72．11％，G C含量为27．89％，有1个内含子；编码1323个氨基酸残基，分子量为154470u。序列分析表明，FCC1／HN株与Palo-aho、D10株MESA蛋白在长度和序列组成上呈多态性，序列差异较大区域位于MESA蛋白的氨基酸重复区1、3、4、5和7。经多参数综合分析，有7个潜在的抗原表位区。结论测定、分析了恶性疟原虫FCC1／HN株MESA基因序列。FCC1／HN株MESA基因与其它分离株的MESA基因编码的氨基酸序列存在一定差异。     

恶性疟原虫PfRh5F2片段pTGub21b表达载体的构建及融合蛋白表达鉴定

目的克隆表达恶性疟原虫网状细胞结合蛋白同源体5(PfRh5)F2片段,并评价其抗原性。方法 PCR扩增目的基因片段,克隆到表达载体pTGub21b中,构建PfRh5F2/pTGub21b原核表达载体。IPTG诱导表达目的基因,SDS-PAGE电泳分析表达产物,并用Western blot检测其抗原性。结果成功构建了PfRh5F2/pTGub21b原核表达系统,并在大肠杆菌中可溶性高效表达,表达产物能被恶性疟患者血清识别,而重组抗原免疫鼠血清也能识别恶性疟患者血样中的相应抗原。结论恶性疟原虫PfRh5 F2片段在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性和免疫原性。     

恶性疟的两种重组复合抗原的纯化与鉴定

用我们构建的高效表达恶性疟原虫复合抗原融合蛋白的工程菌ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｐＷＲ－Ｃ／ＪＭ１０９和ｐＷＲ－ＣＡＣ／ＪＭ１０９进行发酵培养，收集菌体经超声波破菌、硫酸铵分级沉淀、分子筛层析、离子交换层析等步骤纯化后，纯度可达８２．０％。纯化后的融合蛋白保持β－半乳糖苷酶的活性。用等电聚焦技术测定纯化蛋白等电点分别为８．４０和８．２５．用Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ法测定纯化蛋白的免疫原性，证实纯化的重组蛋白可与小鼠抗恶性疟原虫抗体及疟区病人血清发生特异性免疫反应。重组蛋白加弗氏佐剂免疫家兔制备的抗血清可与４种工程菌表达产物发生特异免疫反应，并可识别恶性疟原虫海南株和云南株红内期抗原。说明纯化的重组融合蛋白为具有恶性疟原虫抗原活性的重组复会抗原。