靶向siRNA沉默Akt1基因表达及其对肺癌培养基促内皮细胞迁移的抑制作用

目的:研究小干扰RNA(siRNA)对血管内皮细胞Akt1基因表达的沉默作用及其对肺癌A549细胞条件培养基促血管内皮细胞迁移的影响。方法:以人脐静脉内皮细胞为靶细胞,设计针对Akt1基因mRNA的siRNA(siAkt1),利用阳离子脂质体介导转染人脐静脉内皮细胞,采用半定量PCR技术(RT-PCR)检测Akt1mRNA的表达,用Western blotting技术检测Akt总蛋白表达。同时用体外"伤口愈合"实验观察细胞迁移。结果:筛选出的siAkt1能显著抑制内皮细胞Akt1mRNA(P<0.01)和Akt总蛋白的表达(P<0.05),A549细胞条件培养基显著促进人脐静脉内皮细胞迁移(P<0.05),但对转染siAkt1的人脐静脉内皮细胞迁移没有促进作用(P>0.05)。结论:特异性siRNA通过有效抑制Akt1基因的表达而抑制A549细胞条件培养基促血管内皮细胞迁移的作用,这为肺癌血管生成干预治疗提供了新的理论基础。     

阿托伐他汀对同型半胱氨酸诱导内皮细胞内质网应激的抑制作用

目的： 观察阿托伐他汀对同型半胱氨酸（Hcy）诱导的人脐静脉内皮细胞内质网应激（endoplasmic reticulum stress,ERS）以及凋亡的影响。方法: 不同浓度的Hcy或联合阿托伐他汀处理人脐静脉内皮细胞后,流式细胞术检测细胞凋亡率,实时定量PCR和蛋白质印迹法测定ERS相关分子BiP、CHOP及p-eIF2α、p- PERK的表达变化。结果: Hcy呈浓度依赖性地诱导内皮细胞ERS相关分子BiP、CHOP及p-eIF2α、p-PERK的表达,阿托伐他汀可明显抑制Hcy诱导的内皮细胞ERS相关分子的表达,减少内皮细胞凋亡。结论： 阿托伐他汀可通过下调ERS相关信号通路,抑制Hcy诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡。     

siRNA沉默Gankyrin基因对喉鳞癌Hep-2细胞生物学行为的影响

目的:观察小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)沉默Gankyrin基因对喉鳞癌Hep-2细胞的生物学行为影响?方法:用siRNA沉默喉鳞癌Hep-2细胞中的Gankyrin基因,运用实时定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)及蛋白印迹法(Western blot)技术检测转染前后Gankyrin mRNA及蛋白的表达?采用CCK-8法检测细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期,细胞划痕损伤实验和Transwell小室实验检测细胞迁移能力,Matrigel侵袭实验检测细胞侵袭能力,Western blot检测Gankyrin下调后p53蛋白的表达?结果:qRT-PCR和Western blot结果显示,Gankyrin siRNA组Gankyrin mRNA和蛋白的相对表达量均低于对照siRNA组和未处理组(P < 0.001)?CCK-8法显示Gankyrin siRNA组细胞增殖速度明显下降(P < 0.001)?流式细胞仪检测结果表明,Gankyrin siRNA组细胞凋亡率[(7.70 ± 1.12)%]明显高于对照siRNA组[(2.34 ± 0.32)%]和未处理组[(1.82 ± 0.29)%],差异有统计学意义(P < 0.001);与两对照组相比,Gankyrin siRNA组G1期比例增加,S期比例减少,差异有统计学意义 (P < 0.001)?细胞划痕损伤实验和Transwell小室实验显示Gankyrin siRNA组的细胞迁移能力明显减弱(P < 0.01);Matrigel侵袭实验显示Gankyrin siRNA组细胞侵袭能力与对照siRNA组和未处理组比较,差异无统计学意义(P > 0.05)?Gankyrin表达下调增加了Hep-2细胞中p53蛋白的表达,差异有统计学意义(P < 0.001)?结论:Gankyrin表达下调能抑制Hep-2细胞的增殖和迁移,可能与细胞凋亡?细胞周期改变及p53的表达密切相关?     

siRNA下调Ezrin表达对人胰腺癌PANC-1细胞增殖和运动能力的影响

目的:探讨Ezrin蛋白在胰腺癌细胞生长和运动转移过程中的作用。方法:体外培养人胰腺癌PANC-1细胞,针对Ezrin基因设计小干扰RNA(siRNA),并通过脂质体转染入细胞,运用MTT法、流式细胞仪、划痕愈合实验、扫描电镜和Transwell实验方法,观察siRNA下调人胰腺癌PANC-1细胞Ezrin表达后,肿瘤细胞增殖、细胞周期、伪足形成、侵袭和迁移能力的改变。结果:Western印迹分析结果显示,Ezrin siRNA对Ezrin蛋白表达水平有显著的下调作用。下调Ezrin蛋白表达后,PANC-1细胞增殖明显被抑制,G2/M期细胞显著降低;细胞伪足形成显著减少,细胞的运动侵袭能力下降。结论:Ezrin在胰腺癌细胞恶性增殖和运动转移过程中具有重要作用,可能成为抑制胰腺癌侵袭转移的靶点。     

siRNA干扰PDLIM1表达抑制胶质瘤细胞U87迁移与侵袭

目的 研究人PDZ和LIM域蛋白1(PDLIM1)特异性siRNA对人胶质母细胞瘤U87细胞系迁移、侵袭能力的影响,并对其相关机制进行初步探讨.方法 用小RNA干扰技术下调U87细胞PDLIM1,用荧光实时定量Real-time PCR技术验证siRNA干扰效率;采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力,采用Transwell实验检测细胞侵袭能力;用Western blot法检测细胞上皮间质转化(EMT)相关蛋白表达情况,并探讨相关机制.结果 经PD-LIM1-siRNA干扰后,胶质瘤U87细胞中PDLIM1在mRNA水平显著下调(P<0.001);与对照组相比,迁移和侵袭能力被显著抑制(P<0.001);PDLIM1基因表达下调后,U87细胞中EMT相关蛋白N-cadherin、β-catenin、Slug下调.结论 PDLIM1通过EMT相关转录因子Slug调节N-cadherin、β-catenin蛋白表达,是其调节胶质瘤U87细胞迁移及侵袭能力的可能机制之一.     

靶向c-myc基因小RNA干扰对胆囊癌细胞侵袭运动的影响

目的 研究c-myc基因在胆囊癌侵袭和转移中的作用及其机制。方法 采用实时定量PCR和蛋白质印迹法检测亲代和高转移胆囊癌细胞系中c-myc基因表达,设计靶向c-myc的干扰性小RNA(siRNA)转染高转移的胆囊癌细胞,体外Transwell实验研究c-myc siRNA对胆囊癌高转移细胞迁移和侵袭能力的影响。通过蛋白质印迹法检测转染c-myc siRNA后c-myc下游部分信号通路的变化。结果 高转移细胞中c-myc基因表达高于亲代细胞,转染c-myc siRNA后,c-myc的表达在转录和翻译水平均降低。同时GBC-SD/M3细胞的转移和侵袭能力受到抑制。对c-myc下游信号通路的检测发现LIN28的表达下调。结论 c-myc在高转移的胆囊癌细胞中表达上调;通过siRNA下调其表达后可以抑制胆囊癌细胞的转移和侵袭,这种抑制作用可能与LIN28的下调有关。     

siRNA沉默Pokemon基因抑制人非霍奇金淋巴瘤Raji细胞的增殖

目的采用siRNA干扰技术沉默人非霍奇金淋巴瘤Raji细胞中Pokemon基因,观察Raji细胞增殖活性的变化,并探讨其可能的分子机制。方法构建靶向Pokemon基因的siRNA重组慢病毒载体并转染Raji细胞。采用实时定量PCR法和Western blotting法检测Raji细胞Pokemon基因的沉默效果,在Raji细胞中沉默Pokemon基因的表达后采用实时定量PCR法和Western blotting法检测bcl-6和突变型p53表达水平的变化;采用流式细胞术检测Pokemon基因沉默后Raji细胞凋亡的情况。结果利用Pokemon靶向siRNA重组慢病毒载体感染Raji细胞有效沉默Raji细胞Pokemon基因表达(P<0.05)。沉默Pokemon基因后,bcl-6和突变型p53基因和蛋白表达均显著降低(P<0.05),细胞凋亡率增高(P<0.05)。结论 siRNA沉默Pokemon基因有效降低了人非霍奇金淋巴瘤Raji细胞的bcl-6和突变型p53基因和蛋白表达,促进细胞凋亡,抑制其增殖。Pokemon基因有望成为非霍奇金淋巴瘤治疗的新靶点。     

印迹基因CDKN1C对滋养细胞生物学功能的影响

目的 研究印迹基因CDKN1C对人滋养细胞生物学功能的影响.方法 利用小干扰RNA沉默CDKN1C基因的表达,将人绒毛外滋养细胞(TEV-1细胞株)分为3组,空白组细胞未经转染处理,对照组细胞由不合siRNA的空白脂粒体进行转染,siRNA组细胞由包裹siRNA的脂粒体进行转染.实时荧光定量-PCR(qRT-PCR)和免疫印迹(Western blot)检测TEV-1细胞CDKN1C基因的表达水平,CCK-8检测细胞增殖率,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,Transwell细胞迁移实验检测细胞侵袭和迁移能力.结果 CDKN1C基因沉默后48 hTEV-1细胞早期和晚期凋亡率均降低,细胞增殖率升高;细胞周期G0/G1期比例下降、S期和G2/M期比例增高;细胞迁移和侵袭能力增强(P＜0.05).结论 印迹基因CDKN1C对人滋养细胞增殖、凋亡、细胞周期、迁移、侵袭等生物学功能有调控作用.     

Eg5基因在神经母细胞瘤细胞增殖和凋亡中的作用

目的探讨Eg5基因对神经母细胞瘤(NB)细胞增殖和凋亡的影响。方法取2株NB细胞株SHSY-5Y和NBL-S,分别转染针对Eg5基因的小干扰RNA(siRNA),分为细胞对照组(用等体积的水代替siRNA,只含有脂质体,未转染细胞)、siRNA对照组(转染siRNA对照)和siRNA干扰组(转染Eg5 siRNA),每组6孔,每孔1×10~6个细胞。使用实时定量聚合酶链式反应(real-time PCR)检测Eg5 mRNA表达水平的变化;使用5-乙炔基-2’-脱氧尿苷(EdU)掺入实验和克隆形成实验检测下调Eg5表达对NB细胞增殖的影响;使用流式细胞术检测下调Eg5表达对NB细胞凋亡和细胞周期的影响。结果荧光定量PCR检测结果显示,siRNA干扰组Eg5 mRNA表达水平与细胞对照组和siRNA对照组相比显著减少,差异有统计学意义(P<0.05);EdU掺入实验和克隆形成结果表明,siRNA干扰组细胞中DNA的合成量和细胞克隆数量低于细胞对照和siRNA对照组,差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞术检测结果显示,细胞对照组和siRNA对照组细胞的凋亡比率低于siRNA干扰组细胞的凋亡比率,差异有统计学意义(P<0.05);细胞周期的检测结果显示,细胞对照组和siRNA对照组细胞中G0/G1期所占比率<50%,而siRNA干扰组细胞中G0/G1期所占比率>70%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论在NB细胞中使用siRNA下调Eg5表达,能够抑制NB细胞增殖,促进细胞凋亡。     

RNA干扰YAP基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响

目的 探讨RNA干扰YAP基因对人乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学行为的影响。方法 使用阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM2000将靶向沉默YAP基因的siRNA序列转染至乳腺癌MDA-MB-231细胞中,采用qRT-PCR和Western印迹法分别检测转染后MDA-MB-231细胞中YAP基因及蛋白的表达水平,噻唑蓝(MTT)实验和细胞平板克隆实验检测转染前后细胞增殖的变化,Transwell小室和划痕实验观察转染对细胞侵袭及迁移的影响,流式细胞术评价转染后细胞周期及凋亡的变化情况。结果 转染siRNA后,YAP RNA和蛋白的表达量相对于空白对照及阴性对照组均明显下降(P<0.01)。MTT实验及细胞平板克隆实验显示,siRNA干扰YAP表达可以显著抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖活性;Transwell小室及划痕试验显示,siRNA干扰YAP的表达可以明显抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的侵袭及迁移能力;细胞周期实验显示,沉默YAP后,细胞周期出现G₀/G₁期阻滞,细胞凋亡检测证实沉默YAP后细胞凋亡率并未出现明显上升。结论 抑制YAP在乳腺癌细胞的表达可有效降低细胞的增殖、迁移和侵袭能力,改变细胞周期分布,但对细胞凋亡无明显影响。     

十二指肠乳头癌中埃兹蛋白和钙黏蛋白的表达与预后关系研究

目的探讨埃兹蛋白(Ezrin)、钙黏蛋白(E-cadherin)的表达与十二指肠乳头癌的临床预后关系。方法收集十二指肠乳头腺瘤28例患者和腺癌46例患者的组织标本,应用免疫组化方法对Ezrin、E-cadherin在十二指肠乳头腺瘤和腺癌组织中的表达水平进行测定。结果在十二指肠乳头癌组织中Ezrin、E-cadherin的表达阳性率分别为73.91%(34/46)和21.74%(10/46),腺瘤组织中分别为46.23%(13/28)和85.71%(24/28),两种组织中Ezrin、E-cadherin表达阳性率差异均有统计学意义(P<0.05),Ezrin和E-cadherin在十二指肠乳头癌组织中表达呈负相关且与肿瘤分化程度、临床分期及淋巴结转移显著相关(P<0.05)。单因素分析发现,两种蛋白的表达、肿瘤分化程度、临床分期、淋巴结转移与术后生存密切相关。多因素分析发现,两种蛋白的表达、肿瘤分化程度、淋巴结转移是影响预后的独立因素。结论 Ezrin和E-cadherin对十二指肠乳头癌的发生、发展及预后起重要作用,可能成为十二指肠乳头癌的分子标记物或治疗的潜在靶点。     

Ezrin蛋白在口腔鳞癌中的表达及意义

目的:检测Ezrin蛋白在口腔鳞癌中的表达,探讨其在评估口腔鳞癌的肿瘤分化程度和侵袭转移中的意义。方法:采用免疫组织化学SP法检测Ezrin蛋白在39例口腔鳞癌和28例正常口腔粘膜组织中的表达。结果:Ezrin蛋白在正常口腔粘膜组织中的阳性表达率为14.29%,其在口腔鳞癌中的阳性表达率为76.92%,Ezrin蛋白在口腔鳞癌中表达水平显著高于正常口腔粘膜组织(P<0.01);Ezrin蛋白的表达随口腔鳞癌病理分级增高而增高(P<0.01);Ezrin蛋白在伴淋巴结转移的口腔鳞癌中的表达水平高于无淋巴结转移组(P<0.01)。结论:Ezrin蛋白与口腔鳞癌的病理分化和淋巴结转移密切相关,其表达水平可作为评估口腔鳞癌转移和预后的指标。     

埃兹蛋白通过L1细胞黏附分子信号通路促进肺癌转移

目的 研究埃兹蛋白(Ezrin)促进人肺癌发生转移的分子机制.方法 通过RT-PCR、Western blot检测肺癌细胞系中Ezrin的表达;划痕试验检测Ezrin对肺癌细胞系迁移能力的影响;Western blot检测Ezrin调控L1细胞黏附分子(L1CAM)的机制.结果 Western blot结果显示,与低转移肺癌细胞系H460、EBC-1比较,高转移细胞系95D及PC9具有更高的Ezrin蛋白表达(P＜0.05);用基因方法沉默95D细胞Ezrin表达后(siEzrin-95D),细胞划痕试验结果发现与95D细胞比较,siEzrin-95D细胞的迁移能力明显减弱(P＜0.05).与95D及H460细胞比较,基因沉默95D及H460细胞Ezrin表达后,其L1CAM的表达明显下调(P＜0.05).结论 Ezrin可能通过调节L1CAM的表达促进肺癌转移.     

RNA干扰Ezrin体外对胃癌AGS细胞侵袭和迁移的影响

目的 探讨膜-细胞骨架联接蛋白Ezrin对胃癌细胞株AGS侵袭和迁移能力的影响.方法 针对人Villin2基因(Ezrin编码基因)设计发夹式RNA(shRNA).合成后克隆入载体pGCsileneer,扩增并中量提取质粒,应用脂质体Lipofectamine 2000转染进AGS细胞.采用RT-PCR和Western印迹检测Ezrin的表达.shRNA转染AGS细胞并行G418筛选,传代扩增.结果 shRNA-Ezrin对Ezrin表达抑制作用明显,稳定转染细胞Ezrin下调率达93%.侵袭实验AGSEzrin 细胞的跨膜数为(27.67±4.50),与对照组(125.50±8.33)比较差异具有统计学意义(P<0.01).结论 Ezrin在人胃癌细胞侵袭迁移过程中发挥重要作用,可能成为胃癌基因治疗的一个新靶点.     

考布他汀A-4衍生物CPU-XT-006对人脐静脉内皮细胞增殖、凋亡及VEGF 、bFGF表达的影响

化合物CPU-XT-006是微管蛋白聚合抑制剂、血管阻断剂考布他汀A-4(CA-4)的一种衍生物。通过MTT法分别检测CPU-XT-006对血清、血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)分别诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响;采用流式细胞仪检测CPU-XT-006对HUVEC凋亡的影响;采用Western blot法检测CPU-XT-006对HUVEC内VEGF、bFGF细胞因子表达的影响。结果显示,CPU-XT-006可抑制HUVEC的增殖,诱导HUVEC凋亡,并降低其细胞内VEGF、bFGF细胞因子的表达。     

当归补血微囊促血管新生中JAK2/STAT3通路的作用研究

目的 探讨JAK2/STAT3信号传导通路在当归补血微囊促血管新生中的作用。方法 建立人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）模型,分别采用CCK-8和流式细胞术检测HUVEC细胞活力和细胞凋亡情况;采用Western blot检测各组中p-STAT3、VEGF的表达情况;采用荧光定量PCR,检测各组中VEGF基因和miRNA-21的表达情况。结果 20μg/mL当归补血微囊作用于HUVEC 24h,可有效促进HUVEC的增殖,并上调p-STAT3、VEGF及miRNA-21的表达;AG490能有效抑制当归补血微囊对HUVEC的促增殖作用,并减少p-STAT3、VEGF及miRNA-21的表达。结论 当归补血微囊促进血管生成的作用确实与JAK2/STAT3信号途径有关。      

肝癌组织细胞骨架连接蛋白和焦点黏附激酶的表达及其意义

目的:检测细胞骨架连接蛋白(membrane cytoskeleton cross linker protein,Ezrin)、焦点黏附激酶(focal ad-hesion kinase,FAK)在肝癌组织中的表达及其临床意义。方法:手术切除肝癌标本79例(其中62例附癌旁正常组织),应用免疫组化检测Ezrin,FAK的表达。结果:免疫组化染色显示,Ezrin和FAK的表达与肝癌的浸润、转移呈正相关,与分化程度呈负相关(P<0.05)。结论:Ezrin,FAK的高表达与肝细胞癌的侵袭转移关系密切,它们可能是影响肝癌患者预后以及癌细胞转移的重要因素。     

埃兹蛋白（Ezrin）在胃癌中的表达及其临床意义

目的:研究ERM蛋白家族中的一成员Ezrin蛋白在胃癌中的表达及其临床意义。方法:用免疫组化SP法检测40例胃癌组织、20例胃良性肿瘤组织、10例正常胃粘膜中Ezrin的表达,分析Ezrin与胃癌临床病理因素之间关系。结果:10例正常胃粘膜中未见Ezrin表达,而在40例胃癌组织中Ezrin阳性表达率为55%(22/40),两者差异有统计学意义(P<0.05)。且Exrin表达与胃癌分化程度、淋巴结转移相关(P<0.05)。与患者年龄、性别、胃癌大小、浸润深度无关(P>0.05)。结论:Ezrin表达与胃癌的淋巴结转移及恶性程度有关,有助于预后判断及治疗方法选择,Ezrin表达是反映胃癌生物学行为的有价值指标。     

膀胱尿路上皮癌组织中Ezrin和E-cadherin的表达

目的 检测埃兹蛋白(Ezrin)和钙黏素E(E-cadherin)在膀胱尿路上皮癌组织中的表达情况,探讨其与膀胱尿路上皮癌侵袭转移的关系.方法 采用免疫组织化学SP法检测80例膀胱尿路上皮癌病理组织切片中Ezrin和E-cadherin的表达.结果 在54例无转移的膀胱尿路上皮癌组织中28例Ezrin异常表达(51.85%),在26例有转移的癌组织中20例(76.92%)Ezrin异常表达;在54例无转移的膀胱尿路上皮癌组织中22例(40.74%)E-cadherin异常表达,而在26例有转移的膀胱尿路上皮癌组织中18例(69.23%)E-cadherin异常表达.无转移的膀胱尿路上皮癌组织中二者异常表达均低于有转移者,差异有显著性(χ2=4.596、5.698,P<0.05).Ezrin异常表达与E-cadherin异常表达呈显著的正相关性(r=0.898,P<0.05).结论 Ezrin和E-cadherin与膀胱尿路上皮癌的浸润和转移密切相关,可以作为预测膀胱尿路上皮癌转移的重要肿瘤标志物.     

Ezrin和E-cadherin在鼻咽癌组织中的表达及意义

目的：检测鼻咽癌组织中埃兹蛋白(Ezrin)及上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)的表达情况,探讨它们与肿瘤侵袭、转移及预后的关系。方法：应用免疫组织化学SP法检测Ezrin及E-cadherin蛋白在42例鼻咽癌组织和10例鼻咽炎性组织中的表达情况。结果：鼻咽癌组织中Ezrin 蛋白的表达显著高于鼻咽炎性组织（P＜0.05）,而鼻咽癌组织中E-cadherin蛋白的表达显著低于鼻咽炎性组织（P＜0.05）。Ezrin和E-cadherin蛋白在鼻咽癌组织中的表达均与鼻咽癌的T分期、颈淋巴结转移、临床分期密切相关（P＜0.05）。Ezrin与E-cadherin在鼻咽癌组织中的表达呈明显负相关(r=-0.450,P＜0.05);生存分析显示Ezrin阳性表达、肿瘤TNM分期、E-cadherin表达下调及有淋巴结转移者与鼻咽癌患者的生存率有关（P＜0.05）。结论：Ezrin和E-cadherin在鼻咽癌组织中的表达呈明显的负相关。Ezrin和E-cadherin与鼻咽癌临床分期、淋巴结转移有关,有可能作为鼻咽癌的重要肿瘤标志物。联合检测Ezrin和E-cadherin的表达水平,可能为鼻咽癌预后判断提供依据。