大电导钙激活钾通道(BKCa)在胃肠道平滑肌的研究

大电导钙激活钾通道(BKCa)属于钙激活钾通道的一种,因其电导值较大而区别于其它亚型.它接受细胞膜电位和胞内Ca2+浓度的双重调节,又可通过负反馈效应反向调节细胞膜电位及胞内Ca2+浓度.BKCa通道在较多细胞中都有表达如:平滑肌细胞、神经细胞、感觉细胞、上皮细胞,因此参与了体内一些重要的生理过程的调节,如:平滑肌细胞的收缩舒张、神经递质的释放、炎症的发生发展.近年,离子通道在胃肠道动力中所起的作用引起广泛关注,BKCa通道在胃肠道平滑肌的研究已有一定基础,本文将就相关方面做一综述.     

大电导钙敏感钾通道在人足月妊娠子宫平滑肌组织中的表达

目的了解大电导钙敏感钾通道（large-conductance calcium-sensitive potassium channel,BKCa）蛋白在人足月妊娠未临产及临产子宫下段平滑肌组织中的表达情况,探讨BKCa在分娩启动中的作用。方法采用Western blot分别测定人足月妊娠未临产及临产子宫下段平滑肌组织中BKCa蛋白α亚单位的表达。结果人足月妊娠未临产子宫下段平滑肌组织中BKCa蛋白α亚单位的相对表达量为1.18＋0.20 （n=9）,足月妊娠临产子宫下段平滑肌组织中BKCa蛋白α亚单位的相对表达量为0.60＋0.08（n=11）,二者统计学差异显著（P=0.009）。结论人足月妊娠未临产子宫下段平滑肌组织BKCa 蛋白的表达高于临产子宫下段平滑肌组织,提示BKCa在宫缩发动中具有一定作用。     

钙激活钾通道电流在膀胱逼尿肌不稳定中的表达变化研究

目的观察膀胱逼尿肌不稳定(DI)中钙激活钾通道(BKCa)电流变化,探讨BKCa在DI发生机制中的作用。方法通过膀胱出口部位梗阻法建立大鼠DI模型,取其膀胱平滑肌,酶消化分离单个平滑肌细胞,采用全细胞膜片钳技术记录BKCa宏观电流,比较其电流密度在DI和正常大鼠中的变化。结果大鼠膀胱平滑肌细胞表达较为丰富的BKCa电流,具有其他平滑肌细胞BKCa相似的电生理特性,即外向整流特性,能够被BKCa通道特异性阻断剂IbTX(300 nM)阻断。DI大鼠膀胱平滑肌BKCa在多个膜电位时电流密度明显下降,在膜电位为+60时电流密度由(32.42±7.97)pA/pF(n=21)下降到(20.56±4.63)pA/pF(n=18),两组相比,P<0.01。结论 BKCa可能参与了大鼠膀胱DI的发生,调控DI时BKCa通道活性可能作为治疗DI的靶点之一。     

小鼠脑动脉平滑肌钙激活钾通道基本特性和动力学调控研究

目的采用膜片钳技术记录小鼠脑动脉平滑肌细胞上的大电导钙激活钾通道(BKCa)和自发瞬时外向电流(STOCs),研究了其基本特性以及钙离子对通道动力学的调控。方法采用两步法急性酶分离小鼠脑动脉,得到单个平滑肌细胞。使用200μg/mL两性霉素B为穿孔剂进行穿孔全细胞膜片钳实验,包括全细胞宏观电流记录和STOCs记录,采用inside-out和outside-out构型进行单通道电流记录。结果 BKCa宏观电流和STOCs能够被BKCa的特异性阻断剂IbTX(200nmol)阻断。BKCa单通道具有明显电压依赖性(半数最大激活电压V1/2=78.09mV)、K+选择性和钙敏感性(Ca2+解离常数Kd=0.881μmol),能够被胞外IbTX阻断。胞内Ca2+调控通道动力学特性主要表现为减少了开放时间常数,促进了通道由关闭向开放的转变。结论 BKCa宏观电流和STOCs非常容易记录,单通道活性好,具有BKCa的电生理学特性。小鼠脑动脉平滑肌是研究BKCa功能活动和血管活性药物作用机制的良好实验标本。     

钩藤碱对猪冠状动脉平滑肌舒缩作用的影响及其机制

目的观察钩藤碱对离体猪冠状动脉血管的作用,并探讨其作用机制。方法采用血管环张力测定技术及全细胞穿孔膜片钳技术分别观察钩藤碱对离体猪冠状动脉血管环张力的影响以及对大电导钙激活钾通道(BKCa)的作用。结果血管环张力实验显示钩藤碱能够明显舒张[(89.94±1.18)%,n=7]高钾(40mmol/L)去极化所致的冠状动脉血管收缩,而K+通道阻断剂四乙基胺(TEA)不能抑制钩藤碱的舒血管作用,提示K+通道几乎不参与钩藤碱对猪冠状动脉血管的舒张。在全细胞穿孔膜片钳模式下,钩藤碱(100μmol/L)可显著抑制猪冠状动脉平滑肌细胞的BKCa通道[(48.22±4.24)%,n=6],BKCa通道介导的自发性瞬时外向电流(STOCs)的幅度和频率也分别下降了(45.74±6.26)%和(87.98±6.39)%(n=5)。结论钩藤碱可明显舒张猪冠状动脉血管,而对全细胞BKCa通道具有明显的抑制作用,K+通道的激活在钩藤碱的舒血管机制中所起的作用不大。     

大电导钙激活钾通道功能特性、分子结构和氧化性调节研究进展

实验已证实大电导钙激活钾通道(BKCa)在很多组织中都有表达[1],在生理和病理过程中起到重要作用.许多细胞内外因素都可以调制BKCa通道的功能,而对通道氧化性调节这个影响通道功能的重要因素的研究却相对较少[2].本文拟在BKCa通道功能特性、分子结构及氧化性调节方面进行深人阐述.     

人肠系膜血管平滑肌细胞BKCa通道在HEK293细胞上的表达方法研究

目的:本研究旨在HEK 293细胞系上成功表达人肠系膜血管平滑肌细胞大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium-activated potassium channels,BKCa),建立一种稳定高效表达人肠系膜血管平滑肌细胞BKCa的HEK 293细胞系方法,进一步揭示在工具细胞表达上的BKCa的基本特性,为以后的诸多实验提供参考价值.方法:应用基因工程技术构建人肠系膜血管平滑肌细胞BKCa通道基因表达载体,用脂质体转染法转染HEK 293细胞,建立了稳定高效表达BKCa通道的HEK 293细胞系的方法.结果:在HEK 293细胞系上表达的BKCa单通道电流的电导值为229.56±4.62 pS,具有电压依赖性,钙离子敏感性等特性;在HEK 293细胞系表达的BKCa全细胞宏观电流具有明显的电压依赖性和外向整流特性.结论:成功建立了一种在HEK293细胞系上表达的BKCa通道的实验方法,并成功记录到BKCa通道的单通道电流和全细胞宏观电流,且与天然细胞上BKCa通道电流特性基本一致.     

多功能钾离子通道BKCa的研究进展

大电导钙激活钾离子通道(BKCa)属于细胞膜上的钾通道,广泛分布于人体各种组织中,呈现出高密度表达,开放概率大、电导率高、调控位点多等特点。BKCa因其分子结构复杂、对K+的高通透性以及离子通道的功能结构特点,参与细胞的兴奋及代谢调节、细胞内信号转导等生理过程,并在多种重要生理活动中发挥重要作用,成为许多疾病潜在的治疗靶点。因此,深入研究BKCa的分子结构和功能将为治疗相关疾病的药物研发奠定基础。     

大鼠肠系膜细动脉血管平滑肌大电导钙激活钾通道的特性

目的探讨肠系膜细动脉血管平滑肌细胞膜上大电导钙激活钾通道(large-conductance calcium-activated potassium channel, BKCa)的电生理特性及其与张力调节的可能机制。方法木瓜酶、胶原酶两步消化法急性分离大鼠肠系膜细动脉血管平滑肌细胞,膜片钳的内面向外式记录法记录BKCa。结果(1)在浴槽液和电极液均为高钾的条件下,BKCa通道的单通道电导为(221±6)pS,反转电位为-0.12 mV;(2)BKCa通道的电流幅度无细胞内钙依赖性,而开放概率(NPo)则同时具有电压依赖性和细胞内钙依赖性。在细胞内钙浓度为0.1 μmol/L时, 使NPo增加e倍的电压增加为(13±1)mV, 达到最大开放概率一半的电压(V1/2)为(22±2)mV;(3)在细胞内钙浓度为1 μmol/L时,可记录到通道长时间的关闭和失活现象,这种现象称为钙依赖性失活。结论肠系膜细动脉血管平滑肌细胞膜上的BKCa具有大电导、高钾选择性、强电压依赖性和高度的细胞内钙敏感性。BKCa高度的钙敏感性可能与血管平滑肌病理情况下的代偿调节有关。     

表达在HEK293细胞上的BKCa通道基本特性与动力学调控研究

目的构建稳定表达人血管平滑肌大电导钙激活钾通道(BKCa)的293细胞系,并研究其基本电生理学特征和动力学模型。方法通过脂质体(lipofectamine 2000)转染法转染BKCa表达质粒pcDNA3.1-BKα和(或)pIRES-BKβ1,筛选稳定表达的单克隆细胞系。使用膜片钳多种记录方式研究其基本电生理学特性,同时建立BKCa动力学研究模型。结果构建稳定转染BKCa通道α和(或)β1亚单位的HEK293细胞系,通过膜片钳能够记录到具有与天然细胞BKCa电生理学特性相似的电流,包括大电导特性[内面向外式构型下单通道电导为(216.38±3.55)pS]、电压依赖性、Ca2+依赖性、钾离子选择性和200nmol/L IbTX(BKCa特异性阻断剂)阻断;联合表达β1亚单位能够明显增加通道的开放时程。采用inside-out宏观电流记录方式可以记录到明显的尾电流。可以用于分析通道激活、去激活等动力学模型及药物动力学作用机制。结论成功构建稳定转染BKCa通道α和(或)β1亚单位的HEK293细胞系。膜片钳实验证明具有典型的BKCa电生理学特性,同时建立的细胞系可以很好的用于BKCa通道功能调控研究和动力学参数分析。     

血清药理学与膜片钳技术对川芎扩冠离子机制的探讨

目的 通过观察分析川芎灌胃动物后分离的含药血清(含川芎血清)对猪冠状动脉血管及平滑肌细胞BKCa的作用,旨在从细胞分子水平阐述其扩冠机制,也为探索建立血清药理学与膜片钳技术结合于中药研究的联合技术奠定基础.方法 用膜片钳实验及冠状动脉血管条实验观察含川芎血清、川芎主要活性成分川芎嗪(阳性对照)和空白血清(阴性对照)对BKCa的作用以及对离体猪冠状动脉血管条的影响.结果 在内面向外式和贴附式膜片上,含川芎血清和空白血清对BKCa通道无激活作用,但在内面向外式膜片上,阳性对照川芎嗪对BKCa通道具有激活作用,且川芎嗪具有对抗高钾(45mM)去极化所致的冠脉血管条收缩的作用,含川芎血清和空白血清无此作用.结论 川芎嗪对BKCa通道具有直接激活作用,含川芎血清在体外实验中对BKCa通道无明显激活作用.     

雌激素激活血管平滑肌细胞钙激活钾通道的非基因组机制研究进展

大电导钙激活钾通道(BKCa)由形成孔道的α亚基及具有调节作用的β亚基组成,因其电导大,对调节平滑肌细胞功能起重要作用,从而成为近年来研究的热点。研究发现雌激素经细胞膜上的雌激素受体介导,通过胞内多种信号转导通路激活内皮型一氧化氮合酶进而产生NO直接或间接激活BKCa通道,产生快速血管效应。随着分子生物学及膜片钳技术的发展,人们在雌激素对BKCa调节机制方面进行了深入的研究,本文就此内容进行综述。     

一种有效记录人肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道电流的穿孔全细胞膜片钳方法

目的：探讨一种有效记录人肠系膜动脉平滑肌细胞大电导钙激活钾通道电流的穿孔全细胞膜片钳方法,使细胞内环境保持稳定,改善常规全细胞膜片钳破膜所造成的封接不稳定。方法：以人肠系膜动脉平滑肌细胞为研究对象,采用穿孔全细胞膜片钳技术,记录人肠系膜动脉平滑肌细胞上大电导钙激活钾通道（big-conductance Ca2＋-activated potassium channels,BKCa）宏观电流以及自发性瞬时外向电流（spontaneous transient outward currents,STOCs）。结果：采用这种穿孔全细胞膜片钳技术,能有效记录到人肠系膜动脉平滑肌细胞上BKCa和STOCs。结论：穿孔膜片钳技术是一种简便而有效的记录全细胞电流的实验方法,该方法的建立为今后更深入的研究提供实验基础。     

川芎嗪对正常人体肠系膜血管平滑肌细胞大电导钙激活钾通道的作用

目的：研究川芎嗪（（tetramethylpyrazine,TMP））对正常人体肠系膜血管平滑肌细胞大电导钙激活钾通道宏观电流（large-conductance Ca^2＋-activated potassium channels,BKCa）的作用,探讨TMP对BKCa的作用机制。方法：用急性酶分离法分离人体肠系膜动脉平滑肌细胞,采用全细胞穿孔膜片钳技术记录该细胞上的大电导钙激活钾通道宏观电流,并测试TMP对该电流的作用。结果：TMP在0.73、3.67mmol/L时可明显地可逆性地激活正常人体肠系膜血管平滑肌细胞上的BKCa,在0.73mmol/L浓度时,测试电压从-50～＋60mV时差异都有统计学意义,其中测试电压在-50mV时,电流密度从0.25±0.03pA/pF增加到0.34±0.039pA/pF（P〈0.01,n=12）,测试电压在＋60mV时,电流密度从8.37±1.75pA/pF增加到14.12±2.66pA/pF（P〈0.01,n=12）;TMP在3.67mmol/L时可明显地可逆性地激活正常人体肠系膜血管平滑肌细胞上的BKCa,测试电压从0～＋60mV时差异都有统计学意义,其中测试电压在0mV时,电流密度从1.25±0.23pA/pF增加到1.90±0.31pA/pF（P〈0.05,n=7）,测试电压在＋60mV时,电流密度从10.57±3.61pA/pF增加到20.32±4.68pA/pF（P〈0.05,n=7）。但TMP在8.07mmol/L时可明显地可逆性地抑制正常人体肠系膜血管平滑肌细胞上的BKCa,测试电压从-60～＋60mV时差异都有统计学意义,其中测试电压在-60mV时,电流密度从0.28±0.02pA/pF降低到0.15±0.04pA/pF（P〈0.01,n=6）,测试电压在＋60mV时,电流密度从10.49±0.44pA/pF降低到1.83±0.68pA/pF（P〈0.01,n=6）。结论：TMP在0.73、3.67mmol/L下,可激活正常人体肠系膜血管平滑肌细胞大电导钙激活钾通道,而在8.07mmol/L时可明显地可逆性地抑制正常人体肠系膜血管平滑肌细胞上的BKCa。在低浓度和较高浓度下TMP对正常人体肠系膜血管平滑肌细胞上的BKCa有不同效应的实验结果,为TMP应用于临床提供了实验依据     

Mg~(2+)对猪冠脉平滑肌细胞钙激活钾通道的激活作用的初步研究

目的：研究Mg2+对猪冠脉平滑肌细胞钙激活钾通道的作用,以揭示Mg2+扩血管作用的电生理机制。方法：应用膜片钳制技术inside－out方式记录冠脉平滑肌上的单通道活动,经PCLAMP软件进行微机采样储存数据和数据的分析处理。结果：Mg2+对猪冠脉平滑肌钙激活钾通道具有明显激活作用：增强通道开放概率P0,增加膜片通道开放数目。结论：Mg2+对钙激活钾通道的激活作用可能为Mg2+调节心血管活动的重要机制之一。     

大鼠海马神经干细胞外向电压门控性钾通道的电生理特性

目的 研究大鼠海马源神经干细胞(NSC)外向电压门控性钾通道(Kv)的电生理特性.方法 利用无血清培养、单细胞克隆技术,体外培养SD大鼠海马组织源NSC.以免疫细胞化学方法对NSC及其分化后的子代神经细胞进行鉴定.应用膜片钳技术全细胞模式记录不同外向Kv通道的电生理特性.结果 体外培养SD大鼠海马组织源NSC表达巢蛋白(nestin),在体外可诱导分化产生分别表达Tuj1和GFAP的细胞.全细胞膜片钳可记录到三种外向Kv通道:一种缓慢激活的、对四乙基胺(TEA)敏感的延迟整流钾电流(IDR);一种快速激活和失活、可被4-氨基吡啶(4-AP)阻断的外向瞬时钾电流(IA),其在+20 mV和+50 mV的电流密度分别为11 pA/pF±3 pA/pF和29 pA/pF ±7 pA/pF(标本数=11);一种可被iberiotoxin(IbIX)抑制的大电导钙激活钾通道(BKCa),钳制电位+80mV时,加入100 nM IbTX前后的电流密度分别为56 pA/pF ±4 pA/pF和45 pA/pF±4 pA/pF(标本数=6.P＜0.05).结论 体外培养的未分化状态下SD大鼠海马源NSC至少含有IDR、IA和BKCa三种外向Kv通道.     

妊娠期高血压疾病孕妇胎盘小动脉平滑肌大电导钙激活钾通道表达水平的定量测定

目的：观察妊娠期高血压疾病（HDCP）孕妇胎盘小动脉中大电导钙激活钾通道（BKCa）的蛋白表达,探讨BKCa在该疾病发生机制中的作用。方法取 HDCP孕妇（HDCP组,＝15）与健康孕妇（NT组,n＝15）胎盘小动脉平滑肌,用蛋白免疫印迹法（Western blot）检测BKCa通道α亚基及β1亚基的蛋白水平。结果胎盘小动脉平滑肌检测显示,BKCa通道α亚基在NT组的蛋白相对表达量为1．0282±0．1806,HDCP组为1．0012±0．1698,差异无统计学意义（P＞0．05）;β1亚基在NT组的蛋白相对表达量为1．6168±0．0126,HDCP组为0．4181±0．0808,差异有统计学意义（P＜0．05）。结论 HDCP胎盘小动脉平滑肌BKCa通道α亚基蛋白表达无明显变化,β1亚基蛋白表达均明显下调。由此推测大电导钙激活钾通道可能参与了 HDCP的发生、发展,β1亚基的异常表达可能是导致HDCP血管舒缩功能障碍的一个重要基础。     

人参皂苷Rb1对阿尔茨海默病模型细胞大电导钙激活钾通道变化机制的影响

【目的】观察阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)模型细胞的大电导钙激活钾通道BKCa的变化及人参皂苷Rb1对AD模型细胞上BKCa通道的影响。【方法】实验分为Aβ25-35模型组(终浓度为5、10、20、40μmol/L)、人参皂苷Rb1预处理组(终浓度为0.5、1、2、4μmol/L)、治疗组(Aβ25-35+人参皂苷Rb1)和空白对照组。采用膜片钳技术观察各组BKCa通道的平均开放时间、平均开放概率和电流幅度,选择Aβ25-35模型组及人参皂苷Rb1预处理组的最佳浓度,并观察人参皂苷Rb1对AD细胞的作用。【结果】20μmol/L Aβ25-35可显著降低BKCa通道的平均开放时间(P0.05),抑制BKCa通道开放;4μmol/L人参皂苷Rb1组BKCa通道平均开放概率和开放时间较空白对照组均显著升高(P0.05),与模型组比较均显著升高(P0.05或P0.01)。【结论】人参皂苷Rb1治疗AD的机制可能与其能激活BKCa通道、对抗Aβ25-35的毒性作用并保护神经细胞有关。     

小鼠结肠平滑肌大电导钙激活钾通道的剪切与表达

目的检测小鼠结肠平滑肌大电导钙激活钾通道(large conductance calcium activated potassium channels,BKCa)mRNA的全长结构,探明该基因在结肠平滑肌的剪切形式,并对BKCaα亚基在消化道各节段的表达进行半定量比较。方法采用RT-PCR和Western blotting方法检测消化道各段平滑肌BKCa基因和蛋白的表达,用RT-PCR的方法分段检测小鼠结肠平滑肌上BKCa基因各个剪切位点的剪切形式。结果在小鼠无论在mRNA还是在蛋白水平,胃和结肠平滑肌BKCa的表达均比十二指肠、回肠部位丰富。结肠平滑肌上BKCaα亚基mRNA缺失第19号外显子即应激调控外显子(stress-regulated exon,STREX),在其他位点未检测到外显子剪切。结论在小鼠消化道各节段,结肠平滑肌上BKCa的含量比较高,其α亚基未表达第19号外显子序列,其表型为缺失应激调控外显子型,即ZERO型。     

ATP敏感性钾通道和钙激活钾通道对血管平滑肌的调控作用

在所有的离子通道中，钾通道种类最多。在血管平滑肌中目前已确认至少存在４种钾通道：①ＡＴＰ敏感性钾通道（ＫＡＴＰ）；②钙激活钾通道（ＫＣａ）；③电压依赖性（延迟整流）钾通道（ＫＶ）；④内向整流钾通道（ＫＩＲ）。它们在调节血管平滑肌细胞（ＶＳＭＣ）膜电位及血管张力方面各有其独特功能。近年来国际上对ＫＡＴＰ及ＫＣａ研究较多，本文就这两个钾通道的特性、调控及生理和病理状态下的改变作一综述。１　ＡＴＰ敏感性钾通道（ＫＡＴＰ）１．１　ＫＡＴＰ的特性　ＫＡＴＰ分布广泛，但密度较低，单个平滑肌细胞（ＳＭＣ）上只…