孕二烯酮对大鼠卵巢颗粒细胞分泌甾体激素及芳香化酶的作用

目的:观察孕二烯酮对离体原代培养大鼠颗粒细胞分泌雌、孕激素功能及芳香化酶表达的抑制作用。方法:用活细胞计数法(CCK-8法)计算细胞存活率及半数抑制率(IC50)。加入卵泡刺激素和雄烯二酮刺激颗粒细胞分泌激素。用磁性均相酶联免疫法测定培养液中雌、孕激素含量。用大恒MIVNT显微图象分析软件分析免疫组化方法中芳香化酶表达。结果:孕二烯酮杀伤细胞的IC50为41μg/ml(95%可性限38.6-44.1μg/ml)。孕二烯酮5μg/ml,10μg/ml和20μg/ml在不影响活细胞数的情况下对颗粒细胞分泌雌激素的抑制率分别为4.5%,14.3%,38.7%;而其对分泌孕激素的抑制率分别为42.8%,53.1%和61.9%。免疫组化亦证明孕二烯酮能影响颗粒细胞中芳香化酶的表达。结论:孕二烯酮能直接抑制离体培养的大鼠颗粒细胞分泌雌、孕激素;且可能是通过抑制芳香化酶的活性而产生作用。     

丙戊酸钠对卵泡内膜细胞雄激素分泌及相关甾体合成酶改变的影响

目的:研究丙戊酸钠(VPA)对卵泡内膜细胞睾酮生成以及细胞色素P45017α羟化酶(CYP17)、胆固醇侧链裂解酶(P450scc)和类固醇激素急性调节蛋白(StAR)mRNA的影响。方法:采用猪的卵泡内膜细胞进行体外原代培养,并给予不同浓度的VPA(0mg/L、50mg/L、100mg/L和250mg/L)处理,48h后收集培养液,采用ELISA法检测细胞睾酮的分泌,采用荧光实时RT-PCR(TaqMan.assay)方法检测卵泡内膜细胞中CYP17、P450scc和StARmRNA表达。结果:VPA刺激了卵泡内膜细胞睾酮的分泌(P<0.05),且CYP17(P<0.01)、P450scc(P<0.01)和StAR(P<0.01)mRNA表达增加。结论:VPA可直接作用于卵泡内膜细胞,改变CYP17、P450scc和StARmRNA表达,引起雄激素的分泌变化。临床上长期服用VPA的癫痫妇女出现类似于PCOS患者的生殖内分泌功能紊乱,可能与该药物本身作用有密切联系。     

Effects of Controlled Ovarian Hyperstimulation on Oocyte Quality in Terms of the Incidence of Apoptotic Granulosa Cells

Purpose: The aim was to investigate which ovarian hyperstimulation protocol performed in the same patients causes development of oocytes of good quality. Methods: Twenty normo-ovulatory women underwent three different controlled ovarian hyperstimulation protocols for in vitro fertilization–embryo transfer. Patients underwent follicle aspiration after administration of human chorionic gonadotropin (hCG). The total number of retrieved oocytes, the number of mature oocytes, and the rate of mature oocytes were examined. Recovered granulosa cells were stained with Hoechst 33258 and examined by fluorescence microscopy to estimate the incidence of apoptotic cells. Results: The total number of oocytes and the number of mature oocytes in gonadotropin-releasing hormone agonist (GnRHa) + human menopausal gonadotropin (hMG) + hCG and hMG + hCG cycles were higher than those in the natural cycle (P < 0.0001). The rate of mature oocytes in hMG + hCG cycle was the highest among the three protocols (P < 0.04). In the mural granulosa cells, the incidence of apoptotic cells in the GnRHa + hMG + hCG cycle was significantly higher than those of the natural (P < 0.002) and hMG + hCG cycles (P = 0.0002). The incidence of apoptotic cumulus granulosa cells in the GnRHa + hMG + hCG cycle was significantly higher than those of natural and hMG + hCG cycles (P < 0.002). Moreover, the incidence of apoptotic cumulus granulosa cells in the hMG + hCG cycle was significantly lower than that in the natural cycle (P < 0.01). Conclusions: These results indicated that hMG + hCG is the most appropriate controlled ovarian hyperstimulation protocol among the three examined with regard to oocyte quality.     

人卵丘颗粒细胞凋亡与卵子发育潜能关系的研究

目的:探讨人卵子周围卵丘颗粒细胞的凋亡状态与卵子发育潜能的关系。方法:收集130例接受体外受精(IVF)患者卵子周围的卵丘颗粒细胞,包埋后切片进行透射电镜观察,研究其凋亡状态与不孕原因、取卵数、受精数、优质胚胎数及治疗结局的关系。结果:子宫内膜异位症导致的不孕症患者卵丘颗粒细胞的凋亡率高于其他原因导致的不孕,差异有显著性(P<0.05)。卵丘颗粒细胞的凋亡率与取卵数有关,取卵数≤5个的患者与取卵数>5个的比较,卵丘颗粒细胞的凋亡率高,差异有显著性(P<0.05);卵丘颗粒细胞的凋亡与卵子受精密切相关,无或受精卵≤2个与受精卵>2个的患者两两比较,前者卵丘颗粒细胞凋亡率增高,差异有显著性(P<0.01);卵丘颗粒细胞的凋亡与胚胎质量有关,无或优质胚胎≤2个与优质胚胎>2个的患者两两相比,前者卵丘颗粒细胞凋亡率增高,差异有显著性(P<0.01);卵丘颗粒细胞的凋亡与移植结局有关,妊娠组卵丘颗粒细胞凋亡率与未妊娠组比较,差异有显著性(P<0.05)。结论:卵丘颗粒细胞的生长状态与卵子的发育潜能密切相关,卵丘颗粒细胞的凋亡影响卵子的成熟、受精和卵裂。卵丘颗粒细胞凋亡的检测可以作为预测IVF结果的指标。     

粘附分子在分娩期宫颈扩张中的子宫下段肌层血管内皮细胞上的表达

目的 :观察粘附分子在分娩期宫颈不同扩张程度下的子宫下段肌层组织中血管内皮细胞上的表达 ,探讨其在宫颈扩张机制中的作用。方法 :用免疫组织化学SP法 ,检测E 选择素、血管细胞粘附分子 1(VCAM 1)、细胞间粘附分子 1(ICAM 1)在宫颈不同扩张程度下子宫下段肌层血管内皮细胞上的表达。结果 :随着宫颈的扩张 ,E 选择素和VCAM 1在子宫下段血管内皮细胞上表达明显增加 ,在宫颈开大 >6cm组的表达与宫颈口开大 <2cm组的表达差异有显著性或非常显著性 (P <0 .0 5 ,P <0 .0 1)。ICAM 1在各组的表达差异均无显著性。结论 :E 选择素和VCAM 1在宫颈扩张过程中表达增加 ,是宫颈扩张过程中的一个重要环节。     

整合素亚基α_5、β_1在人精子的表达及其与受精的关系

目的 :研究精子表面整合素亚基 α5、β1的表达及其与精子功能状态和受精力的关系 ;整合素亚基 α5、β1的表达与不明原因不育症的关系。方法 :1 3例生育力正常男性的精液标本 ,9例临床诊断为不明原因不育症患者的精液标本。以精子穿透去透明带的金黄地鼠卵行体外受精试验 (SPA)检测精子受精力 ;对新鲜、获能和孕酮诱导顶体反应后精子行间接免疫荧光染色 ,流式细胞仪检测精子表面整合素亚基α5、β1表达阳性的精子百分率。以三色法染色 ,观察精子顶体反应的发生率。结果 :流式细胞仪检测显示正常组新鲜精子表面α5亚基的表达 (1 3 .3± 5 .4% )与对照组 (1 0 .7± 6 .4% )无显著差异 (P>0 .0 5 )。获能组精子表面 α5亚基的表达率 (6 5 .7± 1 7.6 % )比新鲜组和对照组显著增高 (P<0 .0 5 )。孕酮诱导顶体反应后 ,α5亚基的表达率 (6 5 .3± 1 8.9% )比新鲜组和对照组显著增高 (P<0 .0 5 ) ,但与获能精子组相比无显著差异 (P>0 .0 5 )。β1亚基的表达率分别为新鲜组1 2 .9± 7.4% ,获能组 1 5 .9± 7.9% ,诱导顶体反应组 1 6 .9± 6 .2 % ,与对照组 (分别为 :9.3± 3 .4% ,1 7.3± 7.8% ,1 2 .2± 8.7% )比较均无显著差异 (P>0 .0 5 )。获能精子表面α5亚基的阳性表达率与受精率有一定的线性相关 (r=0 .     

催乳素及多巴胺对大鼠卵巢颗粒细胞产生甾体激素的影响

使用含有FSH和雄烯二酮的DME-F 12培养液培养未成熟大鼠的卵巢颗粒细胞,观察了不同剂量的催乳素和多巴胺对颗粒细胞合成孕酮和雌二醇的影响。结果表明,低浓度的催乳素(0.5 μg/ml)促进孕酮产生,高浓度时(5 μg/ml)抑制孕酮产生。催乳素能抑制雌二醇产生。低浓度的多巴胺(0.5 μg/ml)不影响这两种甾体激素的产生。当浓度为5μg/ml时能明显抑制这两种激素的产生。但是,多巴胺对颗粒细胞发挥作用的机制需进一步研究。     

白介素-6调节颗粒细胞雌孕激素分泌的作用

目的 :探讨白介素 -6 (IL -6 )对颗粒细胞分泌雌孕激素的影响。方法 :收集行 IVF-ET穿卵时的颗粒细胞作体外培养 ,在有或无 FSH条件下 ,以不同浓度的 rh IL-6作用于颗粒细胞 ,2 4、48、72和 96 h后收集培养液作雌二醇、孕酮测定 ,观察基因重组人白介素 -6 (rh IL-6 )对体外培养中的颗粒细胞分泌雌二醇、孕酮的影响 ;通过 m RNA狭缝杂交 (m RNA slotblot)检测颗粒细胞是否存在 IL-6 R m RNA。结果 :在无 FSH条件下 ,rh IL-6对颗粒细胞分泌雌二醇有抑制作用 ,对孕酮分泌的影响不明显 ;而加入 FSH后 ,发现 rh IL-6对 FSH刺激颗粒细胞所分泌的雌二醇、孕酮均有明显抑制作用。这些作用呈现一定的时间和剂量依赖性。结论 :rh IL-6可抑制 FSH刺激颗粒细胞所致的甾体激素分泌 ,从而参与调节卵巢功能。     

CHOP/GADD153在多囊卵巢综合征患者卵巢黄体颗粒细胞上的表达

目的:探讨内质网应激相关因子CHOP/GADD153在多囊卵巢综合征(PCOS)患者卵巢黄体颗粒细胞上的表达。方法:收集因PCOS不孕、行IVF-ET取卵时的黄体颗粒细胞(PCOS组,n=45)及因男方因素不孕、行IVF/ICSI-ET取卵时的黄体颗粒细胞(对照组,n=45),应用RT-PCR和Western blotting方法检测患者卵巢黄体颗粒细胞CHOP/GADD153的表达。结果:PCOS组CHOP/GADD153 mRNA水平(0.45±0.20)及蛋白水平(0.62±0.26)均较对照组(分别为0.40±0.18、0.56±0.17)有增高趋势,但差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:内质网应激标志蛋白CHOP/GADD153在PCOS患者卵巢黄体颗粒细胞上的表达无明显改变,推测PCOS患者卵巢黄体颗粒细胞内质网应激尚处于保护性阶段。     

整合素α_5、α_6、β_1在人、小鼠卵的表达及其与卵成熟的关系

目的:研究整合素亚基的α5、α6、β1在小鼠及人卵不同成熟阶段表达。方法:对小鼠及人生发泡期及成熟期卵进行免疫组化染色,共聚焦显微镜观察整合素亚基α5、α6、β1的表达。结果:GV期及成熟期的小鼠及人卵都有整合素亚基α6、β1的表达,且这些亚基在卵的分布及表达水平与卵的成熟程度及功能状态有关;小鼠卵胞浆有α5的表达。结论:整合素亚基α6、β1在卵的表达与卵成熟程度和功能状态具有一定的关系,提示其可能参与精、卵之间的相互作用。     

米非司酮对人类围植入期子宫内膜整合素表达的影响

目的:观察具有正常生育能力的妇女服用米非司酮后对围植入期子宫内膜整合素表达的影响,以探讨小剂量米非司酮用于紧急避孕可能的作用机制。方法:以具有正常生育能力的健康妇女为研究对象。11名自愿受试者随机分为两组:LH—2组(n=5)和LH+2组(n=6),于对照周期和实验周期分别在LH—2或LH+2一次性口服安慰剂和米非司酮10 mg,在两个周期的LH+7各取一次子宫内膜,利用免疫组化技术,研究每位受试者用药前后子宫内膜整合素α_1、α_4、β_3亚基表达的改变。结果:LH—2组于用药后整合素α_1、α_4亚基在子宫内膜腺上皮的表达增强,而LH+2组于用药前后无显著差异。两组整合素β_3亚基的着色于用药前后均无显著差异。结论:米非司酮干扰了整合素在“植入窗”内的正常表达,提示米非司酮的避孕效果在于损伤了子宫内膜的感受态。     

抗苗勒氏管激素(AMH)对离体人卵巢黄素化颗粒细胞干细胞因子(SCF)表达负调控的研究

目的:研究人卵巢黄素化颗粒细胞中抗苗勒氏管激素(AMH)对干细胞因子(SCF)表达的影响。方法:收集15例年龄<35岁因男方因素行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)患者的卵巢颗粒细胞,经原代培养,加入不同浓度基因重组人抗苗勒氏管激素(rhAMH),分别于培养的第4日与第6日采用实时定量PCR(RT-PCR)和免疫组织化学检测空白对照组与各实验组SCFmRNA及蛋白的表达。结果:RT-PCR和免疫组织化学均证实人卵巢黄素化颗粒细胞在不同浓度rhAMH干预后,SCFmRNA及蛋白的表达显著减少(P<0.05),其中15 ng/ml rhAMH抑制作用最明显;实验组第4日与第6日颗粒细胞表达SCFmRNA及蛋白无明显差异(P>0.05)。结论:AMH可有效抑制人卵巢黄素化颗粒细胞SCF mRNA及蛋白的表达。     

整合素β_3和纤维粘连蛋白在人正常及妊娠输卵管的表达与变化

目的:探讨整合素β3和纤维粘连蛋白(fibronectin,FN)在人正常及妊娠输卵管黏膜内的表达与变化。方法:应用免疫组化和图像分析技术检测整合素β3及FN在人正常和妊娠输卵管黏膜内的表达。结果:整合素β3在人正常输卵管黏膜上皮纤毛细胞的胞浆内表达。峡部,排卵后显著高于排卵前(P<0.001);壶腹部,排卵后显著下降(P<0.001);伞部,排卵后的4 d内升高,显著高于其它各时期(P<0.001)。输卵管近妊娠部位黏膜上皮纤毛细胞和分泌细胞胞浆内均表达整合素β3,与分泌期正常输卵管黏膜上皮细胞内的表达比差异无统计学意义。正常输卵管黏膜上皮基底膜和基质表达FN,增生期高于分泌期(P<0.001);FN在近妊娠部位输卵管黏膜内的表达量高于分泌期正常输卵管(P<0.001)。结论:输卵管各节段黏膜整合素β3和FN的表达水平依月经周期不同时期而有明显变化。整合素β3可能不参与输卵管妊娠的发生,FN有可能是输卵管内滞留胚胎植入的分子基础之一。     

前列腺素和γ干扰素对人黄体细胞甾体激素生成的影响及相互作用

我们以前的工作显示Ｔ－淋巴细胞产生的细胞因子γ干扰素（ＩＦＮ－γ），可能在人黄体退化的过程中，通过抑制黄体孕酮生成而起作用。已知在大多数哺乳类动物中，前列腺素Ｆ２ａ（ＰＧＦ２ａ）是一个重要的溶黄体因子。本工作对γ干扰素与前列腺素的关系作了进一步探讨。实验将人黄体细胞置于有或无γ干扰素的条件下培养４天，同时，测定孕酮、ＰＧＦ２ａ、ＰＧＥ２和６－酮－ＰＧＦ１ａ的生成。伴随着γ干扰素对孕酮合成的抑制，观察到一个前列腺素合成的双相模式反应。即暴露于γ干扰素２４ｈ后，ＰＧＦ２ａ和ＰＧＦ１ａ的合成轻微降低，而培养９６ｈ后ＰＧＥ２的合成增加。在另一实验中，发现ＰＧＥ２和ＰＧＦ２ａ对不同期的人黄体细胞在培养４８ｈ和９６ｈ后均有促黄体作用。此外，在消炎痛显著抑制ＰＧ合成的同时，γ干扰素仍能同样抑制其黄体细胞产生孕酮。这些结果提示：观察到γ干扰素引起的抑制孕酮产生似乎并非由前列腺素造成的，因为在同时加入可以抑制前列腺素合成的消炎痛时，这种抑制效果并不受影响。     

整合素配体玻连蛋白在人精子的表达及其与受精的关系

目的 :进一步研究整合素配体玻连蛋白 (Vn)在人精子的表达及其与受精的关系。方法 :选用 1 4例生育力正常的成年男性及 8例精液常规分析正常的不明原因不育男性患者的精液标本 ,液化后提取上游精子。精子体外获能后用兔抗人 Vn多克隆抗体及羊抗兔 Ig G-FITC行免疫染色。然后用流式细胞仪计数 Vn表达阳性精子百分数。部分获能精子同时与去透明带金黄地鼠卵行异种体外受精 (SPA)以检测其受精力 ,比较两组获能精子表面Vn表达阳性精子百分率及受精率差异并分析受精率与 Vn表达阳性的获能精子百分数之间的相关性。结果 :生育组与不育组获能精子 Vn表达水平分别为 2 1 .2 4± 1 1 .70 %与3.6 4± 3.2 7% ,不育组明显低于生育组 (P<0 .0 5)。生育组受精率大于 1 0 % ,不育组受精率小于 1 0 % ,符合划分生育力正常与异常的标准。所有标本 Vn表达阳性的获能精子百分率与精子受精率间具有相关性 (r=0 .476 )。结论 :人获能精子表面存在一定水平的整合素配体玻连蛋白表达 ;Vn参与受精过程 ;Vn表达异常可能与一些不明原因的不育有关     

人输卵管蛋白全长cDNA克隆及真核细胞中的表达

目的:克隆人输卵管蛋白(hOviductin)全长cDNA序列,真核细胞中表达,并了解hOviductin是否与大鼠卵母细胞结合。方法:构建人输卵管黏膜上皮细胞cDNA文库,以~(32)P标记的兔输卵管蛋白全长cDNA序列为探针,自文库中筛选hOviductin全长cDNA序列。将获得的hOviductin编码区cDNA序列插入pEGFP-N1真核表达载体,转染HeLa细胞,表达分泌重组的绿色荧光蛋白(EGFP)-hOviductin,并估量其浓度。激光扫描共聚焦显微镜下观察EGFP-hOviductin与大鼠卵巢的卵丘细胞-卵母细胞复合物(COC)或去除透明带后的裸卵的结合情况。结果:所构建的cDNA文库重组率为98.5％,滴度为1.1×10~6pfu/mL。克隆所得hOviductin全长cDNA约为2500 bp,Gen-Bank的登录号为AY189737。EGFP-hOviductin在条件培液中的浓度为0.236 nmol/L,能结合在去透明带的大鼠裸卵质膜外表面,而未见其与COC结合。结论:hOviductin能在HeLa细胞中表达分泌,其分泌产物可结合于大鼠裸卵质膜外表面。     

In Controlled Ovarian Hyperstimulation, Steroid Production, Oocyte Retrieval, and Pregnancy Rate Correlate with Gene Expression of Vascular Endothelial Growth Factor

Purpose: Whether the gene expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in human granulosa cells is a predictor of fertilization was evaluated in patients participating in an in vitro fertilization program. Methods: Fifty patients with normal ovaries who were participating in an in vitro fertilization program at the University of Milan, San Raffaele Scientific Institute, were included in the study. We correlated E ₂ and P serum levels on the day of oocyte collection, the number of follicles, oocytes collected, and fertilized, and pregnancies with mRNA for VEGF of luteinizing granulosa cells obtained at the time of oocyte retrieval. Results: Comparing E ₂ and P serum levels, the number of follicles, oocytes collected and fertilized, and pregnancies with gene expression for VEGF, we found a positive correlation. E ₂ and P serum levels were higher in patients with increased VEGF (P < 0.01). Furthermore, there were more follicles, oocytes collected and fertilized, and pregnancies in patients with maximum expression of VEGF, and the difference was statistically significant (P < 0.05). Conclusions: Our results suggest that VEGF may be important for vascular development during follicular growth and luteal differentiation, oocyte maturation, and fertilization.     

输卵管积水妇女种植窗期子宫内膜胞饮小泡及部分种植因子的变化

目的:探讨输卵管积水对种植窗期子宫内膜胞饮小泡及种植因子integrinβ3、MUC1及LIF表达的影响。方法:选择接受IVF治疗的20例输卵管积水妇女(积水组)及21例因男性因素所致不孕的妇女(对照组),在种植窗期间通过扫描电镜观察子宫内膜表面胞饮小泡的形态、密度,免疫组织化学分析种植因子integrinβ3、MUC1及LIF的表达。结果:对照组成熟期胞饮小泡所占比例以及胞饮小泡的密度与积水组相比无统计学差异(P>0.05)。integrinβ3、LIF及MUC1在正常对照组的腺上皮细胞和腔上皮细胞中的表达强度均明显高于积水组,integrinβ3在间质细胞中表达亦明显高于积水组。结论:integrinβ3、MUC1及LIF受积水的影响较胞饮小泡更为敏感,先于子宫内膜表面超微结构受到改变,可能是造成胚胎种植率下降的主要原因之一。     

炎症因子对人颗粒细胞凋亡调控基因P53、Bax、Casepase-3、Bcl-2、Survivin表达的影响

目的:探讨炎症因子对人颗粒细胞凋亡调控基因P53、Bax、Casepase-3、Bcl-2、Survivin表达的影响。方法:选择行体外受精-胚胎移植(IVF-ET)治疗的非多囊卵巢综合征(PCOS)患者50例,提取卵泡液中颗粒细胞进行体外培养,随机分为炎症因子处理组和对照组,处理组分别加入5nmol/L白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNFα),比较各组颗粒细胞的增殖速率及凋亡调控基因的表达是否存在差异。结果:IL-1、IL-6、TNFα处理组体外培养48小时后颗粒细胞增殖速率低于对照组(P0.05);处理组促凋亡基因P53、Bax、Casepase-3的表达水平高于对照组(P0.05),而抗凋亡基因Bcl-2、Survivin的表达水平低于对照组(P0.05)。结论:炎症因子IL-1、IL-6、TNFα抑制人颗粒细胞增殖,并诱发颗粒细胞凋亡。