高糖对人牙髓细胞增殖及氧化应激的影响

目的 探讨高糖对人牙髓细胞(HDPCs)增殖和氧化应激的影响,以探索高糖环境对牙髓的影响机制.方法 分离培养牙髓细胞,鉴定组织来源,实验分为4组:低糖组(葡萄糖5.5 mmol/L)、正常组(葡萄糖25 mmol/L)、高糖组(葡萄糖50mmol/L)、高渗组(与50 mmol/L组渗透压相等,并与5.5 mmol/L...     

D-甘露糖对炎性条件下牙龈间充质干细胞迁移、增殖和凋亡的影响

目的 评估在体外D-甘露糖对牙龈卟啉单胞菌(Pg)超声提取物提供的炎性条件作用下的牙龈间充质干细胞的迁移、增殖和凋亡能力的影响.方法 体外培养人牙龈间充质干细胞,用D-甘露糖预处理细胞72 h,在Pg超声提取物作用36 h后观察,用划痕实验检测细胞的迁移能力变化;用CCK-8法检测细胞增殖活性;用流式细胞术检测细胞凋亡...     

骨形态发生蛋白7在高糖环境下对成骨细胞分化的影响

目的:研究对于重组人骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein7,BMP7)在持续稳定高糖环境下对成骨细胞生物学性能及成骨活性的影响。方法:细胞取小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14(MC3T3-E1Subclone 14,MC3T3),分为4组:正常生理糖浓度组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L)为对照组,生理糖浓度+BMP7组高糖组(葡萄糖浓度为5.5 mmol/L,BMP7浓度为100 μg/L)(葡萄糖浓度为25 mmol/L),高糖+BMP7组(葡萄糖浓度为25 mmol/L,BMP7浓度为100 μg/L)。甲基噻唑基四唑(MTT)法检测不同条件培养后1 d、3 d、5 d、7 d后的细胞增殖情况,成骨诱导检测细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性。罗丹明-鬼笔环肽染色后以激光共聚焦显微镜观察MC3T3细胞骨架于BMP7作用24h后的形态变化,荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-qPCR)检测BMP7作用48 h后成骨基因特异性转录因子2(Runx2),骨钙素(osteocalcin,OCN)、碱性磷酸酶(ALP)的mRNA表达。结果:MTT实验显示25 mmol/L葡萄糖可抑制MC3T3增殖(P<0.05),加入BMP7后可提高细胞增值率(P<0.05)。并可上调高糖导致的ALP活性下降。细胞骨架观察结果显示,对照组细胞骨架成束状铺开,交织成网,较为均匀。高糖组细胞微丝解聚成团状,模糊不清。RT-qPCR结果显示BMP7可促进MC3T3细胞的ALP、OCN及Runx2(P<0.05)的表达。结论:持续稳定高糖环境能够抑制成骨细胞的增殖及ALP活性,影响细胞骨架结构,抑制成骨基因表达,添加BMP7可以在不同程度上反转该趋势,但仍较正常水平低。     

胰岛素在高糖环境诱发牙周膜细胞凋亡过程中的调节作用

目的:探讨胰岛素在高糖环境下牙周膜细胞凋亡过程中的调节作用。方法:本实验采用含有不同葡萄糖浓度的培养基培养人牙周膜细胞,并采用胰岛素作治疗对照,作用24小时后,立即使用流式细胞仪对各组凋亡细胞进行计数,最后进行统计学分析。结果:葡萄糖浓度增至15mmol/L时,牙周膜细胞凋亡比例无显著增加(3.47±0.78 VS 3.03±0.40,P>0.05),当葡萄糖浓度增至25mmol/L和35mmol/L时,牙周膜细胞凋亡比例显著增加(5.07±0.611 VS 3.03±0.40,P<0.01;7.13±0.72 VS 3.03±0.40,P<0.01),加入胰岛素后,牙周膜细胞凋亡比例显著下降(7.13±0.72 VS 5.23±0.85,P<0.01),但仍然高于正常糖浓度组(5.23±0.85 VS3.03±0.40,P<0.01)。结论:胰岛素能够部分抑制高糖环境诱发的牙周膜细胞凋亡。     

胰岛素对高糖环境下大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨分化过程中peroxiredoxin-6表达的影响

目的：探讨胰岛素对高糖环境下大鼠颌骨骨髓基质细胞(rat bone marrow stromal cells, rBMSCs)成骨分化过程中peroxiredoxin-6表达的影响。方法：从Wistar大鼠下颌骨中分离培养骨髓基质细胞,分别于不同糖浓度(5.5、25、45 mmol/L)及胰岛素(0、10-5 mol/L)的干预下成骨诱导(5.5 mmol/L组、5.5 mmol/L +Ins组、25 mmol/L组、25 mmol/L+Ins组、45 mmol/L组、45 mmol/L+Ins组)。成骨诱导21 d后,进行茜素红染色,矿化结节定量分析。成骨诱导1、3、7、14、21 d后, 用ELISA试剂盒检测peroxiredoxin-6蛋白的表达。采用SPSS15.0软件包对数据进行统计学分析。结果：45 mmol/L高糖环境显著抑制rBMSCss的矿化,胰岛素可改善高糖对rBMSCs矿化的抑制。45 mmol/L组peroxiredoxin-6的表达较5.5 mmol/L组和25 mmol/L组均显著下降。矿化诱导第21天,各组peroxiredoxin-6蛋白的表达均达到最高峰。在25 mmol/L和45 mmol/L的糖浓度下,10-5 mol/L的胰岛素可显著上调rBMSCs peroxiredoxin-6蛋白的表达。结论：高糖环境抑制peroxiredoxin-6蛋白的表达,胰岛素可改善高糖环境对peroxiredoxin-6蛋白在大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨分化过程中表达的影响。Peroxiredoxin-6蛋白在大鼠颌骨骨髓基质细胞成骨分化后期表达显著。     

不同浓度葡萄糖对人牙髓细胞增殖凋亡及矿化的影响

目的:探讨人牙髓细胞(hDPCs)在不同浓度葡萄糖作用下，细胞增殖凋亡及矿化情况。方法:体外培养的第4代hDPCs分为正常组、高糖1组和高糖2组，分别用含葡萄糖浓度为0、 5.5、 40和50 mmol/L的培养基培养，21 d后CCK-8实验检测细胞存活率，流式细胞仪检测细胞凋亡率，qRT-PCR检测DMP1和DSPP mRNA相对表达量；茜素红染色观察矿化结节情况，试剂盒检测MDA含量及SOD和ALP活性，Wester blot检测Bcl-2、Bax及DSPP和DMP1蛋白相对表达量。结果:正常组矿化结节明显，其余2组矿化结节少。正常组细胞存活率、SOD和ALP活性、DMP1和DSPP mRNA相对表达量、Bcl-2以及DMP1和DSPP蛋白相对表达量均高于高糖1组(P<0.05)和高糖2组(P<0.05),而细胞凋亡率、MDA含量、Bax蛋白相对表达量均低于高糖1组(P<0.05)和高糖2组(P<0.05)，以上指标差异在高糖2组比1组更明显(P<0.05)。结论:高糖抑制人牙髓细胞增殖和矿化，可能是高糖增强氧化应激反应引起。     

胰岛素对高糖条件下体外培养的大鼠牙囊细胞增殖、分化的影响

目的:探讨胰岛素对高糖条件下体外培养的大鼠牙囊细胞(dental follicle cells,DFC.)增殖、分化的影响.方法:取出生7d的SD大鼠上、下颌磨牙牙囊,原代培养牙囊细胞,选取生长状态良好的第4代细胞,在糖生理浓度(5.5mmol/L)和高糖条件下(16.5 mmol/L和49.5 mmol/L)与6μg/mL胰岛素共同孵育,分别于培养1、3、7、9d时采用MTT法和1～7d采用碱性磷酸酶试剂盒检测胰岛素对高糖条件下体外培养的大鼠牙囊细胞增殖、分化的影响.采用SPSS13.0软件包对数据进行统计学分析.结果:所培养的细胞波形丝蛋白阳性,角蛋白阴性.在第1、3天,16.5mmol/L葡萄糖促进第4代大鼠牙囊细胞的增殖,而49.5 mmol/L葡萄糖抑制牙囊细胞的增殖,胰岛素下调16.5 mmol/L葡萄糖下牙囊细胞的增殖,上调49.5 mmol/L葡萄糖下牙囊细胞增殖;在第7、9天,高糖促进牙囊细胞增殖,胰岛素上调高糖下牙囊细胞的增殖.在1～7d内,高糖提高第4代大鼠牙囊细胞碱性磷酸酶活性,胰岛素下调高糖下牙囊细胞的碱性磷酸酶活性(P<0.05).结论:本实验培养的细胞是来源于外胚层间充质的牙囊细胞.实验结果表明,胰岛素能纠正急性高糖对大鼠牙囊细胞增殖和分化的影响.     

糖基化终产物对人牙周膜细胞增殖和NF-κB mRNA表达的影响

目的:研究比较在体外高糖、糖基化终产物(advanced glycation end of products,AGEs)刺激环境下对人牙周膜细胞(hPDLFs)增殖能力和NF-κB mRNA表达的影响。方法:选取因正畸治疗而拔除的前磨牙体外分离培养人牙周膜细胞,根据不同的刺激环境分为阴性对照组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(25 mmol/L葡萄糖)、AGEs组(100μg/mL AGEs)3组。培养12、24、36 h,3个时间点,使用Real Time PCR检测各组NF-κBmRNA的表达差异情况;流式细胞仪检测培养hPDLFs 36 h时细胞增殖差异情况。结果:在培养12、24、36 h,高糖组和AGEs组NF-κB mRNA的表达均高于阴性对照组(P<0.05),其中AGEs组最高,与高糖组相比,24、36 h时均有统计学差异(P<0.05);培养36 h AGEs组hPDLFs增殖能力明显低于阴性对照组和高糖组(P<0.05);高糖组与阴性对照组相比无统计学差异(P>0.05)。结论:AGEs能够显著的抑制hPDLFs增殖,并上调NF-κB的表达呈时间依赖性。     

P38MAPK信号通路抑制剂SB203580对高糖状态下成骨细胞MC3T3-E1增殖和分化的影响

目的:探讨P38MAPK信号通路抑制剂SB203580对高糖状态下成骨细胞MC3T3-E1增殖和分化的影响。方法:将培养的MC3T3-E1细胞按培养基内含葡萄糖浓度分为5.5 mmol/L正常对照组,25.5 mmol/L高糖组和25.5 mmol/L+SB203580组,观察细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)、矿化结节(AR-S)、成骨相关基因Runx2和OCN mRNA的表达。结果:高糖培养后,MC3T3-E1细胞增殖明显受到抑制(P<0.05)。高糖组的ALP活性光密度值在各个时间点均低于对照组(P<0.05),OCN mRNA,Runx2 mRNA表达随着葡萄糖浓度升高而明显下降,给予SB203580处理后,细胞增殖仍呈下降趋势,OCN、Runx2 mRNA、ALP活性较未加入抑制剂组升高。结论:SB203580可抑制P38MAPK在高糖状态对MC3T3-E1的作用。     

牙龈卟啉单胞菌对人滋养层细胞增殖及凋亡的影响

目的:检测牙龈卟啉单胞菌感染对人胎盘滋养层细胞(HTR-8细胞)增殖以及凋亡的影响。方法:用不同感染复数(MOI)的牙龈卟啉单胞菌体标准菌ATCC 33277体外感染HTR-8细胞,未感染牙龈卟啉单胞菌的HTR-8细胞作为空白对照组。感染后,用Cell Counting Kit(cck-8)检测HTR-8细胞增殖情况,用线粒体膜电位凋亡检测试剂(JC-1)检测HTR-8细胞凋亡情况。结果:MOI=10组,感染72 h内,HTR-8细胞增殖未受抑制(P>0.05)。而MOI=100组和MOI=200组,感染24 h开始,HTR-8细胞增殖受到明显抑制(P<0.01)。并且与MOI=100组相比,MOI=200组在感染48 h(P<0.05)和72 h(P<0.01)时,HTR-8细胞增殖明显降低。牙龈卟啉单胞菌感染24 h,MOI=200组HTR-8细胞凋亡率显著高于空白对照组(P<0.01)。感染48 h,MOI=100组HTR-8细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.01)。MOI=10组在感染24 h和48 h时细胞凋亡率与空白对照组相比差异无统计学意义。结论:在体外感染模型中,牙龈卟啉单胞菌标准菌ATCC 33277感染可抑制滋养层细胞增殖,且促进其凋亡。提示早产低体重儿与牙龈卟啉单胞菌感染引起滋养层细胞增殖和凋亡失衡有关。     

高糖环境通过抑制CXCR-4影响大鼠下颌骨骨髓基质细胞迁移

目的： 探讨高糖环境通过抑制CXCR-4对大鼠下颌骨骨髓基质细胞迁移的影响。方法： 从Wistar大鼠下颌骨中分离、培养骨髓基质细胞,利用Transwell实验筛选在生理糖浓度（5.5 mmol/L）下的SDF-1最适迁移浓度,检测不同糖浓度（5.5、16.5 mmol/L ）条件下SDF-1、AMD3100对细胞迁移能力的影响。利用Western 免疫印迹检测不同糖浓度（5.5、16.5 mmol/L ）条件下CXCR-4的表达,实时定量PCR检测CXCR-4、MMP-2的mRNA表达。采用SPSS 11.0软件包对数据进行统计学分析。结果： Transwell检测显示,生理糖浓度下,骨髓基质细胞的迁移能力对趋化因子SDF-1呈浓度依赖性;在生理糖浓度下,趋化因子SDF-1的最适浓度为100 ng/mL。高糖环境可抑制骨髓基质细胞的迁移能力。在不同糖浓度下,SDF-1均可明显增强细胞的迁移能力。加入AMD3100后,这种增强趋势受到明显抑制。高糖环境抑制CXCR-4蛋白以及CXCR-4和MMP-2 mRNA表达。结论： 高糖环境可以通过抑制CXCR-4的表达来影响大鼠下颌骨骨髓基质细胞在 SDF-1/CXCR-4生物轴调控下的定向迁移能力。     

三维条件下高糖对牙周膜干细胞成骨成脂分化潜能的影响

目的:探索三维培养条件下高糖环境对牙周膜干细胞(PDLSCs)成骨成脂分化潜能的影响.方法:利用明胶材料和谷氨酰胺转移酶构建三维培养条件,通过鬼笔环肽染色观察细胞形态特点;细胞在不同葡萄糖浓度(5.5 mmol/L和25 mmol/L)的培养基中孵育后,通过碱性磷酸酶(ALP)染色、茜素红染色和实时定量PCR检测细胞成...     

槲皮素对牙龈卟啉单胞菌脂多糖刺激的人牙龈成纤维细胞生物学行为的影响研究

目的研究槲皮素对牙龈卟啉单胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,P.g LPS)刺激的人牙龈成纤维细胞(human gingival fibroblasts,HGFs)生物学行为的影响。方法采用DNA片段凝胶电泳、CCK-8法、细胞划痕法观察不同浓度槲皮素(10、20、50、100μmol/L)对体外培养HGFs的毒性作用,以及对HGFs增殖与迁移的影响。采用P.g LPS刺激HGFs来建立体外炎症刺激模型,通过流式细胞术、细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测、酶联免疫吸附试验(ELISA)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)进一步观察槲皮素对HGFs凋亡、ROS的产生及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)表达的影响。结果槲皮素对HGFs无毒性作用,且对HGFs的增殖无影响(P>0.05)。各组细胞迁移率总的比较,差异有统计学意义(F=9.973,P<0.05),在处理48 h后,20μmol/L槲皮素处理组细胞迁移率大于10、50μmol/L槲皮素处理组以及对照组,差异均有统计学意义(均P<0.05)。槲皮素对P.g LPS刺激的HGFs凋亡具有抑制作用,且其能够抑制并预防P.g LPS刺激的HGFs中ROS相对产生量增加现象(均P<0.05)。槲皮素处理显著抑制了P.g LPS诱导的TNF-α表达增加现象(P<0.05),而槲皮素处理组PGE2的表达水平与对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论浓度为20μmol/L的槲皮素能够促进体外培养HGFs的迁移,且具有抗氧化、抗炎保护作用。     

高糖对人骨髓间充质干细胞成骨能力影响的体外研究

目的:体外模拟糖尿病病人高血糖状态,观察高糖对人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)成骨能力的影响。方法 :将使用不同含糖量培养液体外培养的hMSCs分为5.5mmol/L生理糖浓度组、25mmol/L高糖组、44 mmol/L高糖组。CCK-8试剂盒检测各组hMSCs的增殖速度;骨诱导7、14、21 d时分别观察高糖对hMSCs骨向分化相关基因骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)、Runx相关因子2(Runx-2)的表达,碱性磷酸酶(ALP)活性,钙沉积量的影响。结果:两个高糖组相对生理糖组,有抑制hMSCs的增殖能力(P<0.05),且抑制ALP活性及细胞外钙基质沉积,下调了骨向分化相关基因OCN、OPN、Runx-2表达水平(P<0.01),该抑制作用随糖的浓度升高而加强。结论:高糖显著抑制了hMSCs生物矿化过程,并以浓度依赖的方式降低hMSCs的增殖及成骨能力。     

氟对体外培养大鼠成釉细胞 HAT-7细胞活性和对细胞内 Ca2+浓度的影响

目的:观察氟对体外培养的大鼠成釉细胞HAT-7细胞活性及细胞内Ca2+浓度的影响。方法:取对数生长期的HAT-7细胞,分别加入不同浓度的Na F培养液,培养24、48、72 h后,用CCK-8检测细胞的活性;流式细胞术分析氟对细胞凋亡的影响;激光共聚焦显微镜检测细胞内钙离子的浓度。结果:Na F浓度为0.4、0.8 mmol/L时,促进成釉细胞增殖;当Na F浓度大于1.6 mmol/L时,促进成釉细胞凋亡,Na F浓度为1.6 mmol/L时,细胞早期凋亡数量增加,激光共聚焦显微镜检测证实,1.6mmol/L Na F可以诱导大鼠成釉细胞内Ca2+浓度升高,Na F对HAT-7细胞的上述作用与浓度和作用时间呈正相关。结论:低浓度氟促进HAT-7细胞增殖,高浓度则抑制其增殖。Na F浓度超过1.6 mmol/L时,可诱导成釉细胞凋亡,并诱导成釉细胞内Ca2+浓度增加。     

葡萄糖浓度对人牙龈成纤维细胞分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白及纤维粘连蛋白影响研究

目的    探讨不同浓度葡萄糖对人牙龈成纤维细胞分泌Ⅰ（COL1）、Ⅲ型胶原蛋白（COL3）及纤维粘连蛋白（FN）的影响。方法    分别于5.5、7.0、8.8、10.0、15.0、20.0 mmol/L的葡萄糖溶液中培养人牙龈成纤维细胞3 ~ 7 d,酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定其分泌COL1、COL3及FN的量。结果    人牙龈成纤维细胞培养3 d后,葡萄糖浓度高于10.0 mmol/L时,COL1的分泌量减少;高于15.0 mmol/L时,COL3的分泌量减少;FN与COL3情况相似。培养7 d后,葡萄糖浓度高于10.0 mmol/L时,COL1、COL3及FN的分泌量均减少。结论    随着葡萄糖浓度的增高,人牙龈成纤维细胞分泌COL1、COL3及FN的量均有减少趋势,且高糖条件下更为明显。     

糖基化终产物促进人牙龈成纤维细胞凋亡机制及葛根素拮抗作用初探

目的 观察糖基化终产物(advanced glycation end-products,AGE)对人牙龈成纤维细胞凋亡及活性氧生成的影响,探讨AGE在糖尿病加重牙周病变中的作用机制.方法 分别采用3组不同质量浓度(0、50、150 mg/L)的AGE修饰的人血清白蛋白(AGE-human serum albumin,AGE-HSA)与人牙龈成纤维细胞共培养,利用流式细胞术检测细胞凋亡率及活性氧水平变化;50 mg/L AGE-HAS质量浓度组加入0.24 mmol/L葛根素共培养(葛根素实验组)后检测细胞凋亡率.结果 0、50、150 mg/L AGE-HAS质量浓度组凋亡率分别为(1.60±0.30)%、(29.43±1.45)%、(49.20±4.43)%,细胞凋亡率随刺激物质量浓度增加逐渐升高,组间差异有统计学意义(P＜0.05),细胞荧光强度随浓度升高逐渐增强(P＜0.05);葛根素实验组凋亡率[(6.37±3.02)%]显著低于对照组[(29.43±1.45)%,P＜0.05].结论 糖基化终产物能促进人牙龈成纤维细胞凋亡,其凋亡促进作用可能由氧化应激所介导;葛根素可通过抑制这种凋亡而保护牙周组织.

Abstract：

Objective To observe the effect of synthesized advanced glycation end-products(AGE)on reactive oxygen species formation and apoptosis of the cultured human gingival fibroblast and investigate the potential mechanisms of AGE in the modification of periodontal impairment. Methods AGE products with different concentrations[0, 50, 150 mg/L AGE-human serum albumin (AGE-HSA)] were incubated with human gingival fibroblast for 48 h, respestively. Flow cytometry was used to detect intracellular reactive oxygen species and cell apoptosis. The culture media with 50 mg/L AGE-HSA was exposed to 0.24 mmol/L puerarin for 48 h and then cell apoptosis was measured. Results The values of cellular apoptotic rate in 0,50, 150 mg/L AGE-HSA groups were ( 1.60 ± 0.30 ) %, ( 29.43 ± 1.45 ) %, ( 49. 20 ± 4. 43 ) %,respectively. The differences between each AGE-HSA group and control were statistically significant ( P ＜0.05). AGE-HSA increased cell apoptosis in a dose-dependent manner ( 150 mg/L ＞ 50 mg/L ＞0 mg/L,P ＜0.05 ). The cellular fluorescence intensity value was elevated as the concentration of AGE-HSA increased ( P ＜ 0.05 ). After incubation of human gingival fibroblast with AGE-HSA for 48 h, there was a significant decrease in apoptotic rate in puerarin group [ ( 6. 37 ± 3.02 ) % ], compared with the control [ ( 29. 43 ±1.45 ) %, P ＜ 0.05 ]. Conclusions AGE can stimulate apoptosis of human gingival fibroblast, which may be mediated by oxidative stress. Puerarin may protect periodontal tissues by inhibiting the apoptosis.     

芦荟大黄素抑制人口腔癌KB细胞增殖和迁移的双重效应及其机制研究

目的 探讨芦荟大黄素抑制人口腔癌细胞生长和迁移的双重效应及其机制.方法 对人口腔上皮癌KB细胞分别用2.5、5、10、20和40 μmol/L的芦荟大黄素处理,对照组为含0.1%二甲基亚砜的培养液,分别用结晶紫实验和划痕损伤愈合迁移实验分析长效抗增殖作用和抗迁移效应,并用Western blotting方法 检测蛋白激酶Ca和c-myc蛋白水平的变化.结果 芦荟大黄素能长时间抑制KB细胞的生长;划痕损伤愈合迁移实验结果 显示,药物处理3 d后进入划痕区域的细胞数为(6.2±0.2)个/mm2,而对照组为(33.5±0.4)个/mm2,差异有统计学意义(P＜0.05);对照组细胞抑制蛋白激酶Ca和c-myc的水平较高,经芦荟大黄素处理后,均以剂量依赖方式下降.结论 芦荟大黄素的抗增殖和抗迁移活性与抑制蛋白激酶C信号传导途径有关.