细胞穿膜肽在抗肿瘤靶向治疗中的研究进展

随着生物技术的发展,生物大分子在疾病治疗中的作用愈加重要,如蛋白质、寡核苷酸、多肽等.但是由于细胞膜的天然屏障作用,这些生物大分子的实际应用受到限制.细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPPs)是一类具有较强细胞膜穿透能力的小分子短肽,可携带多种大分子物质进入细胞.本文综述了作为纳米载体的CPPs的分类及跨膜机制,以及近年其在抗肿瘤靶向治疗中的研究进展.     

细胞穿膜肽药物载体研究进展

细胞穿膜肽(CPP)是一类具有穿透细胞膜功能的小分子多肽,能携带多种生物活性分子进入细胞。随着对CPP研究的深入,发现其存在抗蛋白酶水解稳定性差、内体逃逸率低和缺乏靶向性等问题,严重限制其作为药物载体的应用。为了克服这些问题,完善CPP的药物载体功能,广大研究者提出了许多改进策略。本文主要就其改进策略加以综述,以期为CPP的改进提供新的思路。     

RGD肽修饰紫杉醇聚合物纳米粒的制备及其药效学研究

制备靶向肽c(RGDyK)修饰的紫杉醇聚合物纳米粒,并对其体内外药效学性质进行评价。采用透析法制备靶向肽修饰的包载紫杉醇(PTX)的低相对分子质量肝素-全反式维甲酸聚合物(PTX-LHRyK)纳米粒,测定其粒度分布、Zeta电位、载药量和包封率等理化性质,通过体外细胞毒实验和体内药效学实验评价PTX-LHRyK纳米粒的抗肿瘤效果。制得的PTX-LHRyK纳米粒的粒径为(131.7±2.3)nm,Zeta电位为(-27.1±2.3)mV,载药量和包封率分别为(32.03±0.11)%和(84.84±2.63)%。随着孵育时间的延长,PTX-LHRyK纳米粒对B16F10细胞的毒性增加,孵育72 h后对B16F10细胞的IC₅₀为(41.6±7.2)ng/mL,LHRyK载体对B16F10细胞的存活率无显著影响。体内药效学研究显示,PTX-LHRyK纳米粒的抑瘤率达到75.28%,是混合药物溶液组的1.46倍,纳米粒制剂组的小鼠体重和相对脾重均无显著性变化。因此,PTX-LHRyK纳米粒粒径小,载药量高,可明显提高紫杉醇的抗肿瘤治疗效果,且降低药物的不良反应。     

穿膜肽修饰的纳米颗粒抗胰腺癌的初步研究

目的 探究穿膜肽修饰的纳米颗粒介导的光动力学疗法(PDT)对胰腺癌SW1990细胞的杀伤作用.方法 将胰腺癌SW1990细胞分成4组,不光照不含光敏剂的细胞作为空白对照组,与细胞共孵育的游离Ce6组,NP/Ce6组及TAT-NP/Ce6组.首先分别制备出纳米颗粒TAT-NP/Ce6和NP/Ce6.利用流式细胞仪(FACS)检测各组被SW 1990细胞摄取的情况;荧光显微镜观察各组光照下在细胞内产生活性氧的情况;最后用MTT或活死染色法检测光照下各组对细胞的杀伤效果.结果 FACS结果显示各组分别被细胞摄取4h后,TAT-NP/Ce6组胞内荧光显著高于NP/Ce6组(P＜0.001),同时NP/Ce6组明显强于free Ce6组(P ＜0.001).荧光显微镜显示光照下纳米颗粒TAT-NP/Ce6组在细胞内产生活性氧明显强于其他各组(P ＜0.001).MTT法显示在每一Ce6浓度下光照时,TAT-NP/Ce6组对细胞的杀伤效果明显强于NP/Ce6 (P＜0.01),Ce6浓度为0.5μg/ml时,活死细胞染色法同样证明了对细胞的这种杀伤效果.结论 TAT肽修饰的纳米颗粒能有效增加胰腺癌细胞对其摄取,其介导的PDT杀伤胰腺癌细胞效果明显增强.     

肿瘤靶向性细胞穿膜肽的固相合成及体外活性研究

目的采用固相合成法合成以基质金属蛋白酶为靶点的肿瘤靶向性细胞穿膜肽,用5-羧基四甲基罗丹明对其进行荧光标记,并对合成的产物进行生物活性和细胞毒性评估。方法采用N-芴甲氧羰基(Fmoc)作为α-氨基酸的保护基,以逐个延伸的固相合成法合成肿瘤靶向性细胞穿膜肽,并在有耦合剂HATU和DMF的情况下,加入5-羧基四甲基罗丹明进行荧光标记,应用高效液相色谱分析仪和质谱仪测定其纯度和分子量;荧光显微镜观察穿膜肽对体外培养的肝癌细胞株SMMC-7721和正常肝脏细胞株LO2的穿膜效果,以评价穿膜肽的生物学活性;MTT比色法检测穿膜肽对SMMC-7721细胞活性的影响。结果所合成的细胞穿膜肽经高效液相色谱法鉴定纯度为96.05%,经质谱鉴定相对分子量为3504.9。这种穿膜肽对正常肝脏细胞株LO2无明显穿膜作用,但对肝癌细胞株SMMC-7721有较强的穿膜作用,并且对细胞活性无明显影响。结论采用Fmoc固相肽合成法成功合成细胞穿膜肽;所合成的细胞穿膜肽具有肿瘤靶向性。     

细胞穿膜肽-抗人膀胱癌单克隆抗体-载丝裂霉素白蛋白纳米微球三联体的靶向性和穿膜活性研究

目的：探讨细胞穿膜肽（TAT-EGFP）一抗人膀胱癌单克隆抗体（BDI-1）一载丝裂霉素白蛋白纳米微球（MMC-NS）三联体的靶向性和穿膜活性。方法：采用异型双功能连接剂SPDP,偶联TAT-EGFP、BDI-1、MMC-NS形成三联体偶联物,进行EJ人膀胱癌靶向结合及穿膜试验,通过激光共聚焦、扫描电子显微镜及透射电子显微镜检测其靶向结合特异性和穿膜活性。结果：成功地应用异型双功能连接剂SPDP偶联TAT-EGFP、BDI-1、载MMC白蛋白纳米微球制成三联体。TAT-EGFP-BDI-1-MMC-NS偶联物能够成功进入细胞发挥细胞毒作用。首次发现TAT-EGFP内化MMC-NS入EJ人膀胱癌细胞内部后微绒毛消失的现象。结论：TAT-EGFP-BDI-1-MMC-NS三联体有可能应用于膀胱肿瘤的靶向治疗。     

负载紫杉醇双配体纳米药物输送系统的体外生物性能评价

目的　体外评价带有叶酸和穿膜肽双配体的、负载紫杉醇纳米药物输送系统的生物性能。　方法　分别用H-F-P　NPs、H-Tat-P　NPs及H-F-Tat-P　NPs孵育细胞,利用流式细胞仪定量评价细胞对带有不同配体纳米药物输送系统的摄取量。再用H-F-Tat-P　NPs孵育细胞,利用激光共聚焦显微镜定性评价不同细胞对H-F-Tat-P　NPs的摄取量。　结果　叶酸受体阳性表达的MDA-MB-231细胞摄取H-F-Tat-P　NPs的量明显多于H-F-P　NPs及H-Tat-P　NPs。叶酸受体阴性表达的A549细胞摄取H-F-Tat-P　NPs与H-Tat-P　NPs的量多于H-F-P　NPs。　结论　叶酸的靶向作用与穿膜肽的穿膜作用能够协同提高药物在靶细胞的聚集,进一步增强药物输送系统的治疗作用,为开发新型、高效药物输送系统提供基础。     

艾塞那肽聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒制备及体外评价

目的：探讨呼出气一氧化氮（fractional exhaled nitric oxide,FeNO）检测用于诊断咳嗽变异性哮喘（cough variant asthma,CVA）的临床价值及其影响因素。方法：连续收集2015年10月到2016年9月于我院就诊的慢性咳嗽患者607例,首先完成FeNO检测,之后通过支气管激发试验或支气管舒张试验并结合病史作为诊断CVA的标准,绘制FeNO诊断CVA的受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve,ROC曲线）,确定其最佳阈值;建立logisitic回归模型,通过模型分析筛选与CVA相关的因素,根据ROC曲线评价FeNO及FeNO联合其他相关因素对CVA的诊断价值。结果：607例患者中最终诊断CVA患者331例,非CVA患者276例。CVA组的FeNO水平明显高于非CVA组[（54.7±44.5） ppb vs. （19.8±11.9） ppb,P=0.000];FeNO用于判定CVA的最佳阈值为31 ppb,约登指数最大值为0.507 6,ROC曲线下面积（area under curve,AUC）为0.794,此时检验的敏感度为61.63%,特异度为89.13%,阳性预测值为87.18%,阴性预测值为65.95%;年龄增高会引起FeNO下降,FeNO联合年龄、吸烟史诊断CVA的AUC为0.813,单用FeNO时的AUC为0.794,但两者差异无统计学意义（P=0.224）。结论：FeNO检测是诊断CVA的有效辅助手段,有助于慢性咳嗽的鉴别诊断;FeNO联合患者年龄、吸烟史诊断CVA价值不优于单用FeNO的诊断价值。     

细胞穿膜肽的治疗应用

细胞穿膜肽(CPPs)是具有细胞膜穿透能力的小分子多肽,能将蛋白质、多肽、核酸片段等以多种方式导入哺乳动物细胞内,其转导效率高且不会造成细胞损伤。CPPs的具体穿膜机制尚不清楚,甚至互相矛盾,但并不影响其在生命科学研究领域,包括基础研究和临床研究中的应用。CPPs已经在肿瘤、心肌病、免疫治疗等临床领域展现出很大的研究价值,并且已经取得了不少新的进展,具有广泛的应用前景。     

紫杉醇在体外对二磷酸腺苷诱导的血小板聚集的影响

目的 研究紫杉醇在体外对二磷酸腺苷（ADP）诱导的血小板聚集的影响。方法 血小板混悬液中加入不同浓度〔0（对照组）、0.01 ng/mL、0.1 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、1 000 ng/mL〕的紫杉醇,在最佳ADP终浓度和最佳孵育时间条件下,分别测定血小板聚集率。结果 在ADP终浓度为10 μmol/L、孵育时间为10 min条件下,随着紫杉醇浓度的增高,其促进ADP诱导的血小板聚集的作用也随之增加,不同浓度紫杉醇间血小板聚集率的比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 紫杉醇能在体外增强ADP诱导的血小板聚集,且诱导作用呈浓度依赖性。     

乙肝病毒体内外感染模型研究进展

乙肝病毒是威胁人类健康的重要病原体之一。目前,利用针对乙肝病毒和宿主分别建立的细胞模型和动物模型,广泛应用于乙肝病毒的基础研究、新药研发和新疗法的探索。但是,这些模型仍然存在某些方面的缺陷,如感染率低、感染期短,与人存在较大的种属差异等,最重要的是,这些模型无法完全模拟乙肝病毒自然感染人的过程及产生病理变化。本文对近十五年来主要乙肝病毒体内外感染模型及其最新的研究进展进行简要综述,为今后建立新型乙肝病毒感染模型提供参考。     

冻干法制备VEGFR2靶向超声微泡体外寻靶及显影实验

目的 采用冻干法制备血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）靶向超声造影剂,并评价其体外寻靶能力及超声显影效果。方法 冻干法制备生物素化微泡,将链霉亲和素及VEGFR2单克隆抗体依次连接至生物素化微泡,构建VEGFR2靶向超声微泡。采用免疫荧光染色法验证链霉亲和素及大鼠抗小鼠VEGFR2单克隆抗体与微泡的结合情况。观察及检测VEGFR2靶向超声微泡的形态、大小及分布。体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)至对数期,分3组,分别为非靶向超声微泡组（加入非靶向微泡1×107个）、抗体预饱和+VEGFR2靶向微泡组（加入过量的VEGFR2抗体孵育后,再加入VEGFR2靶向超声微泡1×107个）及VEGFR2靶向超声微泡组（加入VEGFR2靶向超声微泡1×107个）,比较各组微泡与细胞的结合情况。采用自制体外循环装置并采集超声图像,检测VEGFR2靶向超声微泡体外显影能力。结果 通过免疫荧光染色法的验证,链霉亲和素及大鼠抗小鼠VEGFR2单克隆抗体可与生物素化微泡结合构建VEGFR2靶向超声微泡。VEGFR2靶向微泡光学显微镜下呈圆形,大小一致且分布均匀,平均直径为（1.31±0.93） μm。显微镜下见非靶向微泡组HUVEC周围可见少量微泡结构,抗体预饱和+VEGFR2靶向超声微泡组HUVEC周围几乎无微泡结构,VEGFR2靶向超声微泡组HUVEC周围可见较多微泡结构存在。在超声增强模式下自制微泡显影效果良好,随造影时间延长无明显衰减。结论 冻干法可制备VEGFR2靶向超声造影剂,在体外实验中具有良好的寻靶能力且超声辐照下可显影。     

姜黄素口服纳米晶胶囊的制备及体内外评价

通过纳米晶技术将难溶性药物姜黄素制备成方便给药的口服纳米晶固体制剂,以提高姜黄素的溶解度及溶出速率,进而提高生物利用度.采用介质研磨法制备姜黄素纳米晶混悬液,得到两种稳定的姜黄素纳米晶混悬液处方,稳定剂分别为聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)/十二烷基硫酸钠(SDS)(1∶1),以及吐温80;通过流化床底喷包衣工艺将姜黄...     

养肾排毒缓释片的制备及体外释放

考察养肾排毒缓释片的制备工艺,并阐明缓释片中多种活性成分的体外释药规律。采用单因素试验法优选制剂处方与成型工艺参数,优选的制剂处方为:70%中药提取物,25%HPMC,4%乳糖和1%硬脂酸镁,采用湿颗粒压片法。采用体外释放度测定法,以相似因子比较法、释放模型拟合法以及Peppas方程研究肾排毒缓释片中4种代表性成分的释放规律与机制,结果表明养肾排毒缓释片中的丹酚酸B、丹参酮ⅡA、黄芪甲苷和大黄总蒽醌等4种成分的体外释放曲线高度相似。提示优选的制备工艺合理可行,体外释放具有明显的缓释特征和多成分均衡特性。     

多西紫杉醇前体混合胶束的制备及体外评价

研究制备经稀释可自发形成混合胶束的多西紫杉醇磷脂胆盐前体混合胶束。采用薄膜分散法制备多西紫杉醇磷脂胆盐前体混合胶束;通过高效液相色谱测定混合胶束的包封率;分别利用透射电镜、动态光散射法对混合胶束的形态、粒径进行了表征;采用透析法考察其体外释放行为;考察前体混合胶束与0.9%氯化钠注射液及5%葡萄糖注射液的配伍稳定性;通过家兔溶血试验、血管刺激性试验及小鼠异常毒性实验考察其安全性。结果表明,多西紫杉醇前体混合胶束稀释后自发形成圆盘状混合胶束,平均粒径为65 nm,粒度分布很窄,多分散系数为0.049,包封率为96%,24 h体外累积释药百分率为96.02%;与0.9%氯化钠注射液配伍稳定性较好;对家兔给予本注射液,滴注部位未出现刺激反应,对家兔红细胞未产生溶血和凝集作用;LD₅₀大于20 mg/kg。综合上述研究可见,多西紫杉醇前体混合胶束具有良好的应用前景。     

还原性多肽共载基因和化学治疗药载体的构建与体外评价

目的 制备一种应用于共载基因和化疗药的硫辛酸（LA）修饰的非内吞机制进入细胞的固有无序正常蛋白-细胞质定位的内化肽6（CL）的纳米复合物(LA-CL),并考察其对HEK293细胞的转染效率、胞摄取情况,以及体外释放规律。方法 以不同比例（2.5%、5%、10%、20%）半胱氨酸作为交联剂,合成四种不同交联度的LA-CLss (LA-CLss1, LA-CLss2,LA-CLss3, LA-CLss4),利用1H-NMR和凝胶色谱鉴定合成的LA-CLss。取增强绿色荧光蛋白质粒(plasmid Enhanced Green Fluorescent Protein, pEGFP) 和LA-CLss以不同氮磷比（N/P）（2.5, 5, 10, 20, 40, 80）自组装形成纳米复合物,粒度测定仪测定复合物的粒径和zeta电位,琼脂糖凝胶电泳测定载体LA-CLss对pEGFP的包裹能力以及保护作用。用超声乳化法制备载多西他赛的载药胶束,并用芘荧光探针法测定其临界胶束浓度。用LA-CLss/ pEGFP纳米复合物与人胚肾HEK293细胞共同培养,考察不同交联度复合物的细胞转染情况。结果 通过核磁结果确定LA-CLss合成成功;在N/P=40时,HEK293细胞对LA-CLss3/ pEGFP的转染效率高于其他四种 复合物(LA-CLss, LA-CLss1,LA-CLss2, LA-CLss4)。超声乳化法制备的载药胶束包封率为85.25 ± 0.04%,载药量为8.81 ± 0.02%。细胞摄取结果表明该载体可以有效地将基因递送进细胞内。体外释放实验结果表明该多肽胶束具有还原性条件敏感释药行为。结论 制备的LA-CLss纳米复合物有望成为一种高效的共载基因和化疗药的载体。     

姜黄素纳米晶注射液的制备及体内外性质评价

通过优化姜黄素纳米晶注射液(curcumin nanocrystalline injection)处方及制备工艺,进而提高姜黄素溶出速率及体内生物利用度.采用介质研磨法制备姜黄素纳米晶,以粒径为评价指标,采用Box-Behnken实验设计优化其处方及制备工艺,并对其进行理化性质表征.此外,通过桨法对不同粒径药物溶出进行...     

奥曲肽靶向阿霉素脂质体的制备及其体外性质

探讨奥曲肽靶向脂质体的制备方法。首先采用乙醇注入法和硫酸铵梯度载药法制备阿霉素普通脂质体(P-L),单因素研究多种处方组成及工艺参数对脂质体性质的影响。随后在阿霉素脂质体表面插入奥曲肽-聚乙二醇₄₀₀₀-氢化磷脂酰乙醇胺（Octreotide- PEG_{4000-HSPE）,获得奥曲肽靶向阿霉素脂质体(Oct-L)。采用柱分离法和粒径仪考察脂质体包封率、粒径分布、稳定性,透射电镜观察脂质体形态,透析法测定其释放性质。所制备的奥曲肽靶向脂质体外形圆整,粒径略小于100 nm,药物包封率约100%,48 h释放约20%;与阿霉素普通脂质体相比,提高了对生长抑素受体表达阳性的NCI H-446细胞的毒性及其阿霉素摄取量。本实验表明,乙醇注入、硫酸铵梯度及后插入法可应用于阿霉素脂质体的制备及脂质体奥曲肽靶向的修饰。}     

叶酸修饰壳聚糖纳米载药胶束的制备及其体外抗肿瘤效果研究

目的: 设计并合成叶酸修饰酸碱度响应壳聚糖纳米胶束,考察材料及其载药胶束对肿瘤细胞的体外生物活性。方法: 醛基化的壳聚糖与亲水性的胺类化合物经还原胺化反应得CHI-DMA,进一步与月桂酸（LA）经缩合反应得CHI-DMA-LA;叶酸（FA）修饰后得FA-CHI-DMA-LA;包载阿霉素（DOX）后得载药纳米胶束FA-CHI-DMA-LA/DOX。采用氢核磁共振测定材料结构;透射电子显微镜考察材料形态;动态光散射法测定粒径和表面电位;紫外分光光度法测定材料中叶酸的接入率、载药胶束的载药率和包封率;荧光分光光度法测试不同酸碱度下载药胶束体外释放药物的性能;MTT法检测胶束对KB细胞的毒性;荧光显微镜和流式细胞仪考察载药胶束在KB细胞中的吞噬情况。结果: 合成了叶酸修饰的壳聚糖胶束材料FA-CHI-DMA-LA,后续用于实验的FA-CHI-DMA-LA-1和FA-CHI-DMA-LA-2胶束的粒径分别为（73±14）nm和（106±15）nm,表面电位分别为（15.59±1.98）mV和（21.20±2.35）mV。其载药胶束FA-CHI-DMA-LA-1/DOX和FA-CHI-DMA-LA-2/DOX的载药率分别为（4.08±1.12）%和（4.12±0.44）%,体外药物在酸碱度5.0下累积释放分别达37%和36%,是酸碱度7.4下的1.5倍左右。FA-CHI-DMA-LA在1.25~125 μg/mL浓度下作用24 h后KB细胞存活率均在70%以上。FA-CHI-DMA-LA/DOX载药胶束的细胞摄取较CHI-DMA-LA/DOX增强,且在无叶酸培养基孵育下细胞摄取比含叶酸培养基孵育下增强。与游离阿霉素和CHI-DMA-LA/DOX比较,FA-CHI-DMA-LA/DOX对KB细胞杀伤力更高,其中FA-CHI-DMA-LA-2/DOX给药孵育24 h后细胞存活率约17%。结论: 成功制备了作为药物输送载体的叶酸修饰壳聚糖纳米胶束材料,其生物相容性良好,具有适应肿瘤微环境酸碱度的药物释放和肿瘤靶向效果。