Bcl-xl反义寡核苷酸转染对肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的影响

目的研究Bcl-xl反义寡核苷酸(ASODN)对肺腺癌A549细胞增殖及凋亡的影响。方法将肺腺癌A549细胞分为细胞对照组(无脂质体及核酸)、脂质体(Lip)组(空脂质体,无核酸)、序列对照寡核苷酸(SCODN)组和ASODN组,设计合成特异性靶向Bcl-xl ASODN,用阳离子脂质体介导其转染肺腺癌A549细胞株。采用细胞计数试剂盒(CCK8)法检测A549细胞增殖抑制率;末端脱氧核苷酰基转移酶介导性d UTP切口末端标记(TUNEL)法检测A549细胞凋亡情况;反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测A549细胞中Bcl-xlm RNA和蛋白表达水平。结果 ASODN和SCODN浓度为50 nmol·L~(-1)时,各组A549细胞增殖抑制率比较差异均无统计学意义(P>0.05);浓度为100、200、400 nmol·L~(-1)时,ASODN组A549细胞增殖抑制率均高于SCODN组和Lip组(P<0.05);ASODN对细胞增殖抑制作用随其浓度增加而增高,具有剂量依赖性(P<0.05)。细胞对照组、Lip组、SCODN组和ASODN组细胞凋亡率分别为(4.01±0.18)%、(5.23±0.22)%、(8.01±0.32)%和(41.50±1.91)%,ASODN组细胞凋亡率高于SCODN组、Lip组和细胞对照组(P<0.05)。ASODN和SCODN浓度为50 nmol·L~(-1)时,各组A549细胞中Bcl-xl mRNA表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05);浓度为100、200、400 nmol·L~(-1)时,ASODN组A549细胞中Bcl-xl mRNA表达量均低于SCODN组、Lip组和细胞对照组(P<0.05);ASODN组A549细胞中Bcl-xl mRNA表达量随浓度增加相应地下降(P<0.05);SCODN组和Lip组Bcl-xl mRNA表达量较细胞对照组下降,但差异均无统计学意义(P>0.05)。细胞对照组、Lip组、SCODN组和ASODN组A549细胞中Bcl-xl蛋白表达量分别为0.62±0.17、0.67±0.27、0.62±0.21和0.23±0.10,ASODN组A549细胞中Bcl-xl蛋白表达量低于细胞对照组、Lip组和SCODN组(P<0.05)。结论转染Bcl-xl ASODN可下调Bcl-xl基因表达,能有效抑制A549细胞增殖,并显著促进A549细胞凋亡;Bcl-xl基因有望成为肺腺癌基因治疗的新靶点。     

Anti-miR-155反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞增殖的影响

目的观察anti-miR-155反义寡核苷酸（AMOs）对肺腺癌A549细胞增殖的影响。方法 A549细胞分为对照组和AMOs处理组，采用AMOs抑制A549细胞内miR-155的活性，液闪计数仪测定[3^H]-TdR掺入量，MTT法测定细胞增殖抑制率，流式细胞仪测定细胞周期。结果与对照组相比，AMOs显著减少A549细胞[3^H]-TdR掺入量，随着浓度从10nmol/L逐渐增加至100nmol/L，A549细胞[3^H]-TdR掺入量亦随之减少。MTT法测定细胞增殖抑制率结果显示，与对照组相比，AMOs显著抑制A549细胞的增殖。流式细胞术检测结果显示AMOs使G0/G1细胞比例显著增加，G2/M期细胞比例显著减少。结论采用AMOs抑制A549细胞内高水平表达miR-155的活性后，可显著抑制A549细胞的增殖。     

肺癌组织MMP-7表达及其反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞增殖的作用

目的 检测非小细胞肺癌患者基质溶解素（matrilysin,MMP-7）的表达,探讨重组基质溶解素（rMMP-7）和脂质体-MMP-7反义寡核苷酸（antisense oligonucleotde of matrilysin by liposome transfection,LIPO-MAON）对肺腺癌A549细胞和人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cell,HUVEC）增殖的影响。方法 ①免疫组化法检测NSCLC患者癌组织MMP-7表达;②MMT法和半定量RT-PCR法检测rMMP-7和LIPO-MOAN作用下A549和HUVEC的增殖及MMP-7-mRNA表达。结果 57例肺癌组织47例MMP-7表达为阳性,阳性表达率为82．5％,与正常对照组相比P〈0．01。rMMP-7能促进肺腺癌A549细胞的增殖,LIPO-MAON对AM9细胞增殖则有明显抑制作用。对HUVEC增殖,仅高浓度的rMMP-7（0．75、1．0μg／ml）有促进作用,而LIPO—MAON对其增殖无抑制作用。RT-PCR结果表明,HUVEC不表达MMP-7-mRNA;rMMP-7能增加A549细胞MMP-7-mRNA的表达,LIPO-MAON可降低其表达（P〈0．05）。结论 非小细胞肺癌患者MMP-7表达阳性率为82．5％,MMP-7反义寡核苷酸能抑制肺腺癌细胞的增殖及MMP-7-mRNA表达,对正常血管内皮细胞增殖无抑制作用。MMP-7能促进肺腺癌细胞增殖。     

靶向Livin反义寡核苷酸对结肠癌LoVo细胞增殖及对卡铂敏感性的影响

目的探讨靶向Livin反义寡核苷酸(ASODN)对结肠癌LoVo细胞增殖及Livin基因表达的影响,并观察其对卡铂敏感性的变化。方法 (1)用靶向Livin ASODN、随机寡核苷酸(RODN)分别转染LoVo细胞,反转录-聚合酶链式扩增反应检测Livin mRNA表达量变化;(2)流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况;(3)采用CCK-8法检测卡铂联合靶向Livin ASODN作用对肿瘤细胞的增殖抑制率。结果 Livin ASODN转染LoVo细胞明显抑制Livin mRNA表达,与空白对照组、RODN组比较差异均有统计学意义(P<0.01);流式细胞术碘化丙锭单染色显示,空白对照组、RODN组均未出现细胞亚二倍体峰;Livin ASODN组存在LoVo早期凋亡细胞,200、400 nmol.L-1的Livin ASODN组细胞亚二倍体百分率分别为(10.59±1.05)%、(11.63±1.27)%;卡铂单药半数抑制浓度(IC50)为3.33 mg.L-1,卡铂与Livin ASODN(100 nmol.L-1)联合,IC50为0.22 mg.L-1,表现为协同作用(Q≥1.15),增敏倍数15.14。结论靶向Livin ASODN下调Livin mRNA表达,诱导LoVo细胞凋亡并提高其对卡铂的敏感性。     

反义寡核苷酸对淋巴瘤细胞Livin基因表达及细胞凋亡的影响

目的 分析凋亡抑制蛋白Livin基因的反义寡核苷酸(ASODN)对人淋巴瘤细胞株(Raji)Livin mR-NA表达的抑制作用及其对细胞凋亡的影响.方法 合成Livin特异性全硫代修饰的ASODN及其对照错义寡核苷酸(MSODN),通过脂质体转染Raji细胞,MTT法检测细胞的增殖抑制率;RT-PCR法检测转染前后Livin mRNA表达水平的变化;Hoechst染色观察细胞凋亡的形态学改变;流式细胞仅检测细胞的凋亡率.结果 Livin ASODN能显著抑制Raji细胞的增殖(P<0.01),并呈现一定的剂量效应关系.0.6μmol/L的A-SODN作用Raji细胞48h后,Livin mRNA的表达水平明显下调,细胞出现凋亡的形态学改变,细胞凋亡率为(37.54±2.65)%,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01).结论 Livin ASODN能有效降低Livin mRNA表达水平,抑制Raji细胞增殖,并增强细胞凋亡的敏感性,有望成为淋巴瘤基因治疗的分子靶向.     

基质溶解素及其反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞增殖的作用

目的 探讨重组基质溶解素 (recombinant matrilysin, rMMP-7)和脂质体-MMP-7反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide of matrilysin by liposome transfection, LIPO- MAON)对肺腺癌A549细胞和人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)增殖的影响.方法 ①构建MMP-7的反义寡核苷酸.②MTT法检测rMMP-7和LIPO-MOAN作用下A549和HUVEC的增殖状况.③RT-PCR法检测rMMP-7 和LIPO-MAON作用下腺癌A549细胞和HUVEC MMP-7 mRNA的表达.结果 0.75、1.0 μg/ml rMMP-7对HUVEC增殖有促进作用,各种浓度的LIPO-MAON无作用;对A549细胞的增殖,0.5、0.75、1.0 μg/ml的rMMP-7均有促进作用;而高浓度(7.5、10 nmol/ml)的 LIPO-MAON对A549细胞增殖有明显抑制作用.RT-PCR检测结果表明,HUVEC不表达MMP-7 mRNA;rMMP-7能增加A549细胞MMP-7 mRNA的表达,LIPO-MAON 可降低其MMP-7 mRNA的表达(P＜0.05).结论 在本试验浓度范围内高浓度的MMP-7能促进正常血管内皮细胞和肺腺癌细胞的增殖,其反义寡核苷酸不能抑制正常血管内皮细胞增殖,但高浓度的反义寡核苷酸能抑制肺腺癌细胞的增殖.     

Livin反义寡核苷酸对肝癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的 利用Livin反义寡核苷酸在裸鼠体内抑制Livin基因表达,探讨Livin反义核苷酸对肝癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用.方法 设计靶向Livin基因的反义寡核苷酸,以Lipofectamine2000作为载体导入裸鼠皮下移植瘤,观察肿瘤生长情况.采用RT-PCR方法检测实验组和对照组Livin基因表达,TUNEL法检测凋亡指数.结果 ASODN组裸鼠皮下移植瘤后14 d,肿瘤体积明显变小.Livin rnRNA表达明显降低.结论 Livin反义寡核苷酸可以明显抑制肝癌裸鼠移植瘤的增殖.     

MMP7反义寡核苷酸对肺腺癌A549细胞粘附和侵袭能力的影响

目的:观察基质溶解素（Matrilysin,MMP7）反义寡核苷酸（Antisenseoligodeoxynucleotide）对肺腺癌A549细胞体外粘附和侵袭能力的影响。方法:采用硫代磷酸修饰的MMP7ASODN,通过脂质体导入A549细胞,RT-PCR检测MMP7mRNA表达;平板粘附模型和Boydenchamber模型比较A549细胞的粘附和侵袭能力。结果:MMP7ASODN转染A549细胞后,与未转染组和脂质体组比较,RT-PCR电泳条带相对光密度值显著降低（P<0.01）。粘附于平板和穿过Boydenchamber的细胞数有明显下降（P<0.01）。结论:MMP7ASODN可以有效抑制肺腺癌A549细胞株MMP7基因的表达,降低细胞粘附和侵袭能力。     

反义寡核苷酸抑制MMP7基因表达对肺腺癌A549细胞凋亡敏感性影响的研究

目的观察基质溶解素(matrilysin,MMP7)反义寡核苷酸(antisense ligodeoxynucleotide,ASODN)对肺腺癌A549细胞凋亡敏感性的影响。方法采用硫代磷酸修饰的MMP7ASODN,通过脂质体导入A549细胞后,RT-PCR检测MMP7 ASODN对MMP7 mRNA表达的影响;流式细胞仪检测其对细胞膜Fas抗原表达率的影响;加入重组FasL,诱导凋亡,流式细胞仪检测凋亡率。结果RT-PCR结果表明,MMP7 ASODN转染能显著抑制A549细胞MMP7 mRNA表达。流式细胞仪检测表明,MMP7ASODN转染A549细胞后,与未转染组和错义寡核苷酸(scrambled oligodeoxynucleotide,SCODN)组比较,细胞膜Fas蛋白表达率增高,有显著性差异(P<0.01)。加入重组FasL,诱导细胞凋亡,细胞凋亡率明显增高,与未转染组和SCODN组有显著性差异(P<0.01)。结论MMP7ASODN可以抑制肺腺癌A549细胞株MMP7基因的表达,上调细胞膜Fas抗原表达,增强A549细胞凋亡敏感性。     

Bcl-2反义寡核苷酸联合照射对肺癌细胞的抑制作用

[目的]研究Bcl-2反义寡核苷酸联合照射对肺癌细胞的抑制作用。[方法]NCI-H446肺癌细胞株分5组:空白对照、单纯照射组、反义寡核苷酸加照射组、无义序列加照射组、脂质体加照射组。相应组照射10GY后24、48、72小时,MTT法检测各组的细胞增殖抑制率和联合相互作用。[结果]照射组、反义寡核苷酸加照射组、无义序列加照射组、脂质体加照射组均有细胞抑制,并呈时间依赖关系。其中Bcl-2反义寡核苷酸联合照射组抑制率明显高于其它三组(P<0.01),联合作用指数(CDI)=0.86。[结论]Bcl-2反义寡核苷酸促进了照射对NCI-H446肺癌细胞的增殖抑制作用,两者有协同作用。     

PDTC对膀胱癌EJ细胞Livin、Survivin mRNA表达影响

目的:探讨体外细胞培养,观察核转录因子κB通路特异性抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)对膀胱癌EJ细胞凋亡抑制蛋白Livin、Survivin mRNA表达水平的影响。方法:采用Real-time PCR法检测以不同浓度不同时间的PDTC处理的膀胱癌EJ细胞的凋亡抑制蛋白Livin、Survivin mRNA表达水平情况。结果:PDTC可降低膀胱癌EJ细胞凋亡抑制因子Livin、Survivin mRNA表达水平,呈剂量-时间依赖性,且呈负相关(P<0.05)。结论:PDTC可使膀胱癌EJ细胞凋亡抑制蛋白Livin、Survivin mRNA表达水平减少,其机制可能与NF-κB通路被抑制相关。     

Livin mRNA和Livin蛋白在食管癌组织中的表达

目的探讨凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAP）家族中的新成员Livin在食管癌组织中的表达及其与食管癌临床病理的关系。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）结合银染技术检测食管癌组织中Livinα mRNA和LivinβmRNA的表达，并用western blot分析Livin蛋白的表达。结果36例食管癌组织中Livin表达阳性率为50.0％，其表达与癌组织浸润深度和淋巴结转移呈正相关（P〈0.05），而与癌组织分化程度无关（P〉0.05）。而18例癌旁正常食管组织中Livin低表达，阳性率为5．6％（P〈0.01）。结论Livin在食管癌组织中异常表达，有望成为食管癌诊断和基因治疗的新靶点。     

转染Livin基因对膀胱癌细胞凋亡的影响

目的 探讨凋亡抑制基因Livin对膀胱癌细胞凋亡的影响.方法 采用脂质体转染法将Livin基因转入膀胱癌T24细胞系,经G418筛选后获得稳定表达Livin的亚克隆细胞系T24/Livin+及仅转染载体的T24/pcDNA3.1(+).用丝裂霉素C(MMC)分别作用于转染前后的膀胱癌细胞系,应用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测转染前后细胞生长抑制率,应用流式细胞仪(FCM)及吖啶橙(AO)染色检测细胞凋亡.结果 成功建立了稳定表达Livin的亚克隆细胞系T24/Livin+;经MMC作用24 h后,T24/pcDNA3.1(+)细胞与T24的细胞凋亡率分别为(21.4±2.3)%和(19.6±2.3)%,而T24/Livin+的细胞凋亡率则为(8.7±1.5)%,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 Livin基因提高了T24膀胱癌细胞的抗凋亡能力,特别是在膀胱癌化疗中显示出更强的抗凋亡能力.     

Transfection of gene Livin α/β into A549 cells and separate effect on the cell growth

Objective:To express two Livin isoforms (Livin α & β genes) with transfection techniques in A549 cell line respectively in order to observe their effect on growth of cell line. Methods:Two eukaryotic expression vectors of Livin, pcDNA3.1-Livin α & β, were transfected into A549 cell line by electroporation. Then G418-resistant clones were screened. RT-PCR, Northern blot and immunofluorescence cytochemistry were used to detect Livin α & β expression level in the transfected cells. Finally, observation of cell morphology, growth curve assay and colony formation analysis were performed to explore the effect of Livin on growth of the cells. Results:Livin α & β were expressed in transfected A549 cells, and induced a faster cell growth, shorter doubling time and stronger cell colony forming ability, yet had no morphology change.Conclusion:Both isoforms can accelerate the growth of A549 cells, indicating a close relationship between Livin expression and the genesis and development of lung cancer. The expression of Livin α & β in A549 cells provides basis for further study of their different biological functions of anti-apoptosis and of their role in lung cancer cell resistance to radiotherapy and chemotherapy.     

Livin靶向RNA干扰对MDA-MB-231细胞增殖和凋亡的影响

目的 研究凋亡抑制蛋白Livin靶向RNA干扰MDA-MB-231对细胞增殖和凋亡的影响,探讨其可能的机制.方法 构建3个靶向Livin的siRNA真核表达载体,分别转染乳腺癌细胞MDA-MB-231后,通过RT-PCR、Western blot技术检测干扰前后MDA-MB-231细胞Livin、Caspase-3和Smac/DIABLO在mRNA、蛋白水平的表达;采用MTT法检测对细胞增殖的抑制作用,流式细胞法测细胞周期,TUNEL法检测细胞凋亡以及观察细胞形态变化.结果 成功构建了针对Livin基因的3个特异性siRNA表达载体.它们不同程度地抑制了MDA-MB-231细胞Livin基因的表达,以si-Livin2抑制效率最高,它对Livin的mRNA和蛋白的抑制率分别达76.4%,70.2%.si-Livin2转染48 h后,与未转染组相比,细胞增殖活力受到抑制,转染48 h抑制率达36.1%.细胞周期重新分布,G0/G1期上升为(71.75±1.31)%,S期下降为(18.06±1.46)%;细胞凋亡率上升为(13.28±1.65)%;电镜下可见典型的凋亡细胞特征.细胞内Caspase-3,Smac/DIABLO的mRNA、蛋白表达有所上升.结论 Livin靶向RNA干扰通过上调Caspase-3,Smac/DIABLO表达有效地抑制MDA-MB-231细胞增殖,促进凋亡.     

姜黄挥发油对人肺腺癌A549细胞作用的形态学研究

目的研究中药姜黄提取物姜黄挥发油对人肺腺癌A549细胞的作用.方法采用倒置显微镜、Giemsa染色及丫啶橙荧光染色观察不同浓度姜黄挥发油作用下人肺腺癌A549细胞形态的变化.结果①倒置显微镜下见,不同浓度(0.08～1.5 μl/ml)的姜黄挥发油处理肺癌细胞24～72 h后,肺癌细胞呈散在分布,细胞稀少,大多数为圆形或椭圆形,显示细胞增殖受到抑制,上述变化与姜黄挥发油的浓度有关;②Giemsa染色实验表明,姜黄挥发油作用24～72 h后,0.8 μl/ml组和1.0 μl/ml组细胞凋亡率分别为34%和42%,与阴性对照组(13.5%)比较差异显著(P<0.01),凋亡细胞多表现为胞体缩小、变圆,核浓缩,呈紫黑色;③丫啶橙荧光染色可较细致地显示细胞凋亡时的多种结构、形态改变,能够发现较早期的凋亡细胞,因而其敏感度可能更高.结论姜黄挥发油可抑制肺癌细胞的生长和增殖,对肺癌细胞有诱导凋亡作用.     

肺腺癌A549细胞培养上清液对人单核细胞衍生树突状细胞的影响

目的：观察肺腺癌A549细胞培养上清液（TSN）对人单核细胞衍生树突状细胞（MoDC）的表型、增殖和抗肿瘤A549免疫应答的影响。方法：制备人肺腺癌A549细胞的TSN、灭活TSN和冻融抗原;人MoDC培养按照不同培养条件组合分为7组,分别于培养全程或晚期（第7d）加入TSN或第4d加入冻融抗原冲击致敏,制备MoDC瘤苗,第9d收获细胞。检测各组MoDC表型、MoDC凋亡率、体外混合淋巴细胞反应（MLR）、MoDC诱导的细胞毒性T细胞（CTL）抑瘤活性、培养上清液中IL－12含量。结果：培养全程加TSN的MoDC,相对特异性表型CD80、CD83和人类白细胞抗原（HLA－DR）明显下调,凋亡率明显升高,同时,激活T细胞增殖能力、诱导CTL抑瘤活性及分泌IL－12的量均显著低于正常培养组;培养晚期加TSN的MoDC及培养全程加入灭活TSN的MoDC,均无上述影响;脱离TSN影响、体外正常制备的MoDC瘤苗,表型明显上调、各项免疫指标明显升高,诱导出了高效的抗A549免疫应答。结论：TSN能干扰MoDC成熟过程,下调基表型表达,诱导其凋亡发生、抑制其介导的抗肿瘤免疫应答;而脱离TSH影响、体外正常制备的MoDC瘤苗能够诱导出高铲的抗瘤免疫应答。     

刺五加注射液对人肺腺癌A549细胞增殖的抑制作用

目的探讨刺五加注射液对人肺腺癌A549细胞的体外增殖的抑制作用。方法采用MTT法测定了不同浓度的刺五加注射液对人肺腺癌A549细胞的体外抑制作用,倒置显微镜观察细胞形态变化。结果刺五加注射液浓度越高对A549细胞抑制作用越好,作用时间越长抑制效果越强,量效关系和时效关系良好;形态学观察到细胞凋亡。结论刺五加注射液对人肺腺癌A549细胞的增殖有较强的抑制作用。