腺病毒介导血管平滑肌细胞转染表达p27基因的研究

目的体外培养大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)并以腺病毒介导转染表达p27。方法取大鼠主动脉血管,以常规组织块贴壁法培养VSMC。用位置特异性重组方法构建带p27基因的复制缺陷型腺病毒载体(AdCMV-p27),经鉴定、扩增,以获取高滴度AdCMV-p27转染液,体外转染VSMC。用RT-PCR方法检测p27 mRNA表达,免疫细胞化学法检测p27蛋白表达,流式细胞仪检测p27细胞表达率。结果构建的AdCMV-p27体外转染培养VSMC表达率为85.81%。以免疫细胞化学、流式细胞仪和RT-PCR检测p27表明,转染后p27表达明显增强,并随表达时间延长而增加,24h达峰值。结论腺病毒载体可较高效率介导p27在体外培养的VSMC转染表达。转染表达p27的VSMC可作为研究有丝分裂原对其增殖、迁移以及凋亡等生物学行为影响的良好细胞模型。     

腺病毒介导的人p27kipl基因高表达对大鼠血管平滑肌细胞增殖？…

ｐ2 7ｋｉｐ1是近年发现的一个细胞周期负调节物 ,可以抑制细胞周期由Ｇ0 /Ｇ1期向Ｓ期过渡 ,本实验中我们构建了含人ｐ2 7ｋｉｐ1ｃＤＮＡ的重组腺病毒载体并将此在体外转染原代培养的大鼠血管平滑肌细胞 (ＶＳＭＣ) ,以此观察外源性ｐ2 7ｋｉｐ1基因导入对ＶＳＭＣ细胞周期及增殖的抑制作用。一、材料与方法1 主要试剂 :人全长ｐ2 7ｋｉｐ1ｃＤＮＡ由纽约ＭｅｍｏｒｉａｌＳｌｏａｎＫｅｔｔｅｒｉｎｇＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒＭａｓｓａｇｕｅ博士惠赠 ;真核表达载体ｐＣＩｃｃ、Ｅ1区替代的腺病毒载体ｐＡｘｌｃｗ由日本东京大学Ｓａｉ…     

腺病毒介导p21基因转染抑制人血管平滑肌细胞增殖的研究

目的 研究抗增殖性p21基因转染对体外培养的人血管平滑肌细胞(HVSMC)的增殖抑制作用及其作用机制。方法 通过腺病毒介导将外源性p21基因转入HVSMC,通过免疫印迹法(Western blot)检测p21基因的表达,原位末端标记法(TUNEL)、DNA片段梯度分析及流式细胞分析(FCM)观察靶细胞的细胞周期变化及凋亡,利用酶联免疫光度仪分析靶细胞的增殖抑制情况。结果 Western blot结果显示p21基因转染后的HVSMC可高水平表达p21蛋白,而另两组无表达。感染后5 d,Adp21组的细胞数为0.275 5±0.01(525 nm波长下吸光度A值),AdlacZ组为0.340 9±0.02,空白组为0.347 5±0.02,Adp21组较另两组的差异有统计学意义(P<0.01)。TUNEL、DNA片段梯度分析及FCM检测均提示靶细胞发生了凋亡。FCM检测还发现明显的细胞周期阻滞现象,Adp21组G0-G1期细胞比例为66.23％,S期细胞比例为10.18％,而另两组G0-G1期和S期细胞比例分别为:47.73％、30.56％和45.31％、32.34％。结论 复制缺陷性腺病毒在体外可有效介导外源性p21基因转染HVSMC,转染后的细胞除发生细胞周期阻滞外还出现明显的凋亡,其生长增殖受到抑制。     

p27基因对血管平滑肌细胞中连接蛋白43表达的影响

目的 研究连接蛋白43(Cx43)在p27基因抑制血管平滑肌细胞(VSMC)增殖中的作用.方法 以携带大鼠p27基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-p27)转染VSMC后,应用免疫细胞化学染色检测p27和Cx43表达的变化;应用3H标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入试验观察p27基因表达增强对VSMC增殖的影响.结果 (1)Ad-CMV-p27转染前,血小板衍化生长因子BB(platelet.derived growth factor,PDGF-BB)下调P27蛋白的表达,AdCMV-p27转染后,无论有无PDGF-BB刺激,VSMC中P27蛋白的表达均比转染前显著增高.(2)AdCMV-p27转染使VSMC中Cx43蛋白的表达基本恢复至有丝分裂原刺激前状态.(3)AdCMV-p27转染使VSMC的.H.TdR掺入量均较未转染组显著降低.结论 p27基因对Cx43表达的调控,使细胞间连接通讯得到维护,是其抑制VSMC增殖的重要机制之一.     

腺病毒介导gax基因转染抑制血管平滑肌细胞增殖

目的　以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞 (VSMC) ,探讨gax基因表达增强后VSMC增殖的变化。方法　以携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型 5型腺病毒载体 (AdCMV gax)常规转染VSMC后 ,应用免疫细胞化学染色检测gax基因表达的变化 ;应用四唑盐 (MTT)比色试验、3H标记的胸腺嘧啶核苷 ( 3H TdR)掺入试验和流式细胞仪检测观察gax基因表达增强对VSMC增殖的影响。结果　①AdCMV gax转染前 ,PDGF BB下调Gax蛋白的表达 ,接近正常生理浓度的PDGF BB( 2ng ml)即可使VSMC的Gax蛋白表达率由 3 6.42 %显著降低至 2 2 .83 %(P <0 .0 5 ) ,随着PDGF BB浓度的升高 ,gax基因表达下降程度更加显著 ;AdCMV gax转染后 ,无论有无PDGF BB刺激 ,VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高。②AdCMV gax转染使VSMC表达gax增强后 ,VSMC的MTT吸光度值和3H TdR掺入量均较未转染组显著降低 ,G0 G1期的VSMC比例较未转染组显著增高 (P <0 .0 1) ,G2 M期和S期细胞比例显著降低 (P <0 .0 1)。结论　增强gax基因表达可抑制由有丝分裂原刺激所引起的VSMC增殖     

腺病毒介导gax基因转染对血管平滑肌细胞迁移的影响

目的以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞(VSMC),探讨gax基因表达增强后VSMC迁移的变化.方法以携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-gax)常规转染VSMC后,应用免疫细胞化学染色检测gax基因表达的变化,Boyden's小室观察gax基因表达增强对VSMC迁移的影响.结果①AdCMV-gax转染前,PDGF-BB下调Gax蛋白的表达,接近正常生理浓度的PDGF-BB(2 ng/ml)即可使VSMC的Gax蛋白表达率由36.42%显著降低至22.83%(P＜0.05),随着PDGF-BB浓度的升高,gax基因表达下降程度更加显著;AdCMV-gax转染后,无论有无PDGF-BB刺激,VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高.②AdCMV-gax转染使VSMC表达gax增强后,VSMC迁移数较未转染组显著减少.结论增强gax基因表达,可抑制由有丝分裂原刺激所引起的VSMC迁移.     

P27对血管平滑肌细胞增殖的调控

社会正逐步进入老龄化,血管增殖性疾病如动脉粥样硬化,经皮腔内冠状动脉成形术后再狭窄等发病率和死亡率逐年上升,已成为严重影响人类健康的主要疾病目前认为血管平滑肌(vascular smoth muscle cell,VSMC)的异常增殖和迁移在冠心病等血管增殖性疾病的发生发展中具有重要作用.随着分子生物学的发展,对引起VSMC异常增殖和迁移的分子学机制正在不断深入,为血管增殖性疾病的治疗提供了新的思路.通过对细胞周期素(Cyclins)和细胞周期素依赖性激酶(cyclins delay kinase,CDK)及其复合物的抑制作用来调控细胞周期的进程.对P27蛋白的研究将有助于血管增殖性疾病的治疗.本文就P27与VSMC增殖和迁移做一综述.     

PDGF-BB和SDZ RAD对血管平滑肌细胞p27基因启动子活性和p27 mRNA表达的影响

目的 探讨重组大鼠血小板衍化生长因子(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)和抗增殖剂SDZ RAD对大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)p27基因启动子活性和p27 mRNA表达的影响.方法 构建含p27基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶(chloramphenicol acetyl transferase,CAT)报告基因的重组体pXp27,将这个重组体瞬时转染大鼠VSMC,加入PDGF-BB和SDZ RAD干预,测定CAT活性.用RT-PCR法测定其对p27 mRNA表达的影响.结果 10 ng/ml的PDGF-BB使转染后的重组体CAT活性降低,且使VSMC p27 mRNA表达量显著下降.10 ng/ml的SDZ RAD则使重组体CAT活性增高,并使VSMC p27 mRNA表达量显著增加.结论 PDGF-BB或SDZ RAD分别在基因转录水平或促进p27抑制基因启动子活性,进而减少或增加其mRNA的表达.     

腺病毒介导突变体HIF-1α基因对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的 观察突变体HIF-1α基因在体外培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)内的表达以及对其增殖的影响.方法 以LacZ为对照,用野生型HIF-1α、单突变体HIF-1α564和双突变体HIF-1α564 803转染体外培养的大鼠VSMCs,Western blot测定HIF-1α蛋白表达:MTS/PES法确定大鼠VSMCs的增殖状态.结果 Western blot结果显示以LacZ组的密度扫描结果为1,HIF-1α564(3.284±0.582),HIF-1α564 803(4.026±0.445)与野生型HIF-1α(2.429±0.765)相比差异有显著性(P＜0.05),HIF-1α564与HIF-1α564 803组之间差异无显著性(P＞0.05).MTS/PMS比色结果显示:转染的第1天HIF-1α(0.242±0.020),HIF-1α564(0.234±0.021),HIF-1α564 803(0.223±0.020)3组均可抑制VSMCs增殖,与对照LacZ组(0.256±0.020)相比差异有显著性(P＜0.05),但是各组间差异无显著性(P＞0.05).转染第3,5,7天HIF-1α564,HIF-1α564 803组较HIF-1α组相比,差异有显著性(P＜0.05),尤以HIF-1α564 803组抑制大鼠VSMCs增殖能力最显著(P＜0.05).第7天HIF-1α564 803组Hoechst 33258与TUNEL双重荧光染色提示大鼠VSMCs发生了凋亡.结论 腺病毒介导的突变体HIF-1α基因能抑制大鼠VSMCs的增殖,突变体较野生型HIF-1α抑制作用更强,且双突变体HIF-1α564 803能诱导大鼠VSMCs发生凋亡.     

ORC1基因RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的以RNA干扰抑制血管平滑肌细胞(vascu lar smooth musc le cells,VSMCs)ORC1基因,探讨ORC1基因表达抑制后VSMCs增殖的变化。方法实验设置正常对照组、阴性siRNA组及阳性(ORC1 A、ORC1 B、ORC1 C)siR-NA组。应用W estern b lot检测ORC1基因表达的变化;应用MTT比色试验、3H-TdR掺入试验检测VSMCs增殖的情况。免疫细胞化学染色观察增殖细胞核抗原(proliferating cell nuc lear antigen,PCNA)表达。结果①siRNA转染后,3个阳性siRNA转染组ORC1基因表达水平均降低,尤以第2对阳性siRNA抑制效果最为显著,而空白对照组及阴性对照组间ORC1基因表达水平无显著差异。②siRNA转染使ORC1表达减弱后,VSMCs的MTT吸光度值3、H-TdR掺入量和PCNA表达量均较空白对照组及阴性对照组显著降低。结论RNA干扰介导的ORC1基因沉寂可显著抑制VSMCs增殖。     

茶多酚对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的　探讨茶多酚对离体大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响。方法　体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞 ,应用不同剂量的茶多酚作用 2 4 h后 ,采用 MTS/ PES法确定血管平滑肌细胞的增殖状态。应用流式细胞术测定细胞周期。结果　与对照组相比 ,茶多酚对血管平滑肌细胞增殖具有明显的抑制作用 (P<0 .0 0 1)。流式细胞术检测结果表明 ,茶多酚可以使血管平滑肌细胞大部分处于 G0 / G1 期 ,与对照组相比有明显差异 (P<0 .0 5 ) ,并且可以诱导其凋亡。结论　茶多酚可明显抑制离体大鼠血管平滑肌细胞的增殖。     

内皮祖细胞对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的：观察内皮祖细胞(endothelial progenitor cell,EPCs)对血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)增殖的影响。方法：采用6%羟乙基淀粉沉降红细胞和密度梯度离心法分离人脐血单个核细胞,EGM-2细胞培养基进行培养,诱导单个核细胞贴壁并向EPCs分化;采用荧光显微镜双染色、流式细胞术鉴定EPCs,间接免疫荧光检测VSMCs收缩表型标志物α-SM-actin和calponin的表达;Transwell培养板建立早期EPCs和大鼠VSMCs共培养模式,以20%胎牛血清刺激VSMCs增殖,分别共培养6,12,24,48,72 h后收集VSMCs,采用BrdU标记法、蛋白定量、流式细胞术分析VSMCs DNA合成能力、细胞总蛋白含量以及细胞周期进程。结果：从脐血单个核细胞成功培养了EPCs。EPCs和大鼠VSMCs共培养12,24,48,72 h后,VSMCs DNA合成能力、细胞总蛋白含量均较对照组明显降低(P＜0.05),其中以48 h最明显;流式细胞术显示,共培养组VSMCs细胞周期中S期细胞所占百分率较对照组显著降低(P＜0.05),而细胞周期中G1期细胞所占百分率均相应高于对照组(P＜0.05),其中均以48 h最明显。结论：早期EPCs能够抑制VSMCs增殖。     

gax基因对血管平滑肌细胞中p21基因表达的影响

目的：研究p21基因在gax基因抑制血管平滑肌细胞(VSMC)增殖中的作用。方法：以携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV—gax)常规转染VSMC后，应用免疫细胞化学染色检测gax和p21表达的变化；应用RT—PCR检测p21 mRNA表达的变化；应用^3H标记的胸腺嘧啶核苷(^3H-TdR)掺入试验观察gax基因表达增强对VSMC增殖的影响。结果：①AdCMV—gax转染前，血小板衍化生长因子BB(PDGF—BB)下调gax蛋白的表达，AdCMV—gax转染后，无论有无PDGF—BB刺激，VSMC中gax蛋白的表达均比转染前显著增高。②AdCMV—gax转染使VSMC的p21表达比未转染组显著增高。③AdCMV—gax转染使VSMC的^3H-TdR掺入量均较未转染组显著降低。结论：gax基因抑制VSMC增殖的机制与其增强p21表达有关。     

Eukaryotic Expression of Human Arresten Gene and Its Effect on the Proliferation of Vascular Smooth Muscle Cells

Arresten,human noncollagenous domain 1 oftheα1 chain of type Ⅳcollagen,is derived fromthe carboxy terminal of type Ⅳcollagen[1].It wasidentified as a powerful inhibitor of angiogenesisrecently .In earlier studies , human arresten wassuccessfully amplified from placenta tissue , andmolecular cloning and DNA sequencing verifiedthat the coding sequence obtained was correct[2].Prokaryotic expression vector of arresten gene hasbeen constructed[3]. Excessive proliferation andmigration to endome…     

超声造影剂对血管平滑肌细胞增殖的影响

目的观察超声造影剂对大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响.方法血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)刺激大鼠VSMC建立细胞增殖模型.在培养基中加或不加脂质体微泡(1μl/ml),采用台盼蓝排斥染色、MTT法和3H-TdR掺入法检测不同强度、时间的连续波超声辐照对VSMC的毒性作用以及增殖和DNA合成的抑制作用.结果频率1MHz、声强0.3W/cm2的超声联合造影荆辐照VSMC,未见细胞溶解,24h后细胞核蓝染率较辐照即刻显著降低(P＜0.01);辐照30s即可显著抑制PDGF-BB所致的VSMC增殖和DNA合成(P＜0.05),随着辐照时间延长,抑制作用增强,60s时抑制程度最强(P＜0.01).结论低强度超声辐照下超声造影荆的空化效应可抑制VSMC增殖,并对细胞膜有暂时性的损伤作用.     

自噬对血管平滑肌细胞增殖的影响

血管平滑肌细胞异常增殖是血管增殖性疾病的病理基础,自噬是真核生物维持细胞内环境稳态的一种自我保护机制。近年来的研究发现,自噬参与多种细胞因子、血管活性物质、剪切应力、ncRNA等诱导的血管平滑肌细胞增殖,一些抗血管增生性疾病的药物往往通过调节自噬通量和自噬活性发挥抗血管平滑肌细胞增殖作用。本文综述了自噬对血管平滑肌细胞增殖的影响,为探索血管增生性疾病的病理生理机制提供新的思路。