线粒体功能障碍在胰岛β细胞脂性凋亡中的作用

目的:探讨线粒体途径在脂毒性诱导的胰岛β细胞株MIN6凋亡中的作用。方法:胰岛β细胞株MIN6分别在含或不含棕榈酸(0.1-0.5mmol/L)的DMEM无血浆培养基中孵育24h;Hoechst33258染色法检测细胞凋亡,用试剂盒测定caspase-3活性;透射电镜观察MIN6细胞株线粒体结构;RT-PCR法检测bcl-2相关X蛋白(bax)、B细胞淋巴瘤因子2(bcl-2)、固醇调节元件结合蛋白亚型1c(SREBP1c)和DNA损伤可诱导的转录子3(chop-10)mRNA的表达。结果:棕榈酸诱导MIN6细胞凋亡,引起细胞线粒体肿胀,抑制bcl-2mRNA的表达并促进bax、SREBP1c和chop-10mRNA的表达。结论:棕榈酸通过促进线粒体功能障碍而诱导胰岛β细胞凋亡,这一过程可能和bax、bcl-2、SREBP1c和chop-10mRNA表达异常有关。     

Ghrelin对棕榈酸诱导的内皮细胞凋亡的影响及机制

 目的 探讨ghrelin能否抑制棕榈酸诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡及其与PI3K/Akt通路的关系。 方法 大鼠主动脉内皮细胞在分别在含或不含0.3mM棕榈酸的DMEM培养基中孵育,培养基中加或不加ghrelin及PI3K/Akt的阻断剂LY294002,流式细胞仪Annexin Ⅴ/PI法检测凋亡,分光光度计检测caspase-3活性,Western blot检测总Akt及磷酸化Akt。 结果0.3mM棕榈酸作用24小时增加大鼠主动脉内皮细胞凋亡,Ghrelin抑制棕榈酸诱导的内皮细胞凋亡。棕榈酸干预内皮细胞24小时能显著抑制Akt的磷酸化,加入ghrelin可引起Akt的活化。Ghrelin引起的Akt的活化能够显著地被PI3K/Akt阻断剂LY294002所阻断,而且LY294002能够阻断ghrelin对棕榈酸诱导的内皮细胞凋亡的保护作用。 结论 Ghrelin能够抑制棕榈酸诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡,ghrelin的抗凋亡作用至少是部分通过PI3K/Akt通路起作用的。     

蛋白激酶B在佛波酯诱导人胃癌细胞系凋亡中的作用

目的探讨佛波酯(TPA)诱导胃癌细胞系凋亡过程中蛋白激酶B(PKB)的作用。方法通过BrdU处理,流式细胞术检测以及DAPI染色,荧光显微镜观察分析TPA对胃癌BGC-823细胞的影响;免疫印迹法检测TPA对PKB蛋白表达水平、磷酸化的影响;核浆分离获得核浆蛋白,用于免疫印迹法检测TPA对胃癌细胞内PKB和其Ser 473位点磷酸化的核浆表达影响,以及激光扫描共焦显微镜观察TPA是否改变胃癌细胞内PKB的分布。结果TPA诱导BGC-823细胞凋亡;TPA下调BGC-823细胞内PKB蛋白表达,并且与TPA作用时间和TPA浓度呈正相关,与PP2A降解作用无关;TPA抑制PKB的Ser 473位点磷酸化,而对其Thr 308位点磷酸化没有明显影响;TPA下调细胞核内PKB的表达以及Ser 473位点的磷酸化;TPA并不改变PKB在胃癌细胞内的分布。结论PKB的抑制作用可能参与TPA诱导胃癌细胞凋亡过程;由TPA诱导的胃癌细胞凋亡可能部分是由于细胞核内PKB蛋白表达和Ser 473位点磷酸化下降所致。     

Ghrelin inhibits palmitate-induced apoptosis in rat endothelial cells and its mechanism

目的 探讨ghrelin对棕榈酸诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡的作用及其与PI3K/Akt通路的关系.方法 大鼠主动脉内皮细胞在含0.3 mmol/L棕榈酸的DMEM培养基中孵育,培养基中加ghrelin及PI3K/Akt的阻断剂LY294002,流式细胞仪Annexin V/PI法检测凋亡,分光光度计检测caspase-3活性,Western blot检测总Akt及磷酸化Akt.结果 棕榈酸作用下大鼠主动脉内皮细胞凋亡率为30.30％±1.98％,显著高于对照组(5.01％±0.52％)(P＜0.01);Ghrelin及棕榈酸共同作用下内皮细胞凋亡率为10.03％ ±0.90％,显著低予棕榈酸组(P＜0.01).Ghrelin引起Akt活化,PI3K/Akt阻断剂LY294002能阻断Akt活化并减轻ghrelin对内皮细胞凋亡的抑制作用.结论 Ghrelin能够抑制棕榈酸诱导的大鼠主动脉内皮细胞凋亡,可能部分是通过PI3K/Akt通路起作用.     

槲皮素通过激活PTEN抑制PI3K/AKT及JNK信号通路诱导人乳腺癌细胞凋亡

目的 研究槲皮素对乳腺癌MCF-7细胞增殖活性以及对第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物/磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (PTEN/PI3K/AKT)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路的影响。方法 采用CCK-8法检测(0、20、40、60、80、100)μmol/L槲皮素对MCF-7细胞增殖的影响;Hochesst33342染色观察细胞核数量以及核型的变化,流式细胞术检测细胞凋亡;免疫荧光细胞化学染色检测PTEN和磷酸化的JNK(p-JNK)表达,Western blot法检测PTEN、磷酸化的PI3K (p-PI3K)、p-JNK、磷酸化的AKT (p-AKT)蛋白水平;加入PI3K/AKT通路抑制剂LY294002处理后,再次采用以上方法检测对细胞凋亡和相关蛋白表达的影响。结果 随着槲皮素浓度的升高,细胞活性下降,细胞生长受到抑制,且具有浓度依赖性;细胞核浓缩增强、细胞凋亡增加;高浓度槲皮素显著增强PTEN蛋白表达和分布,降低p-PI3K、p-AKT蛋白水平,并抑制p-JNK蛋白的核表达。加入PI3K/AKT信号抑制剂LY294002处理细胞后,LY294002和槲...     

RNA干扰抑制乙酰肝素酶对肺腺癌细胞A549增殖、侵袭和凋亡的影响

目的 探讨抑制乙酰肝素酶表达对人肺腺癌细胞A549增殖、侵袭和凋亡的影响.方法 构建靶向人乙酰肝素酶基因短发夹状双链RNA(shRNA)真核表达质粒(pshRNA-Hpa),用脂质体将其转入A549细胞,建立稳定转染细胞株系,经逆转录.PCR和Western blot法检测转染效率后,分别用四甲基偶氮唑蓝(MTT)、Transwell侵袭实验和流式细胞术(AnnexinV-FITC/PI双染法)检测其对A549细胞增殖、侵袭和凋亡的影响.采用Western blot法检测转染后磷酸化蛋白激酶B(PKB/Akt-Ser473)的表达.结果 转染pshRNA-Hpa的A549细胞乙酰肝素酶mRNA及蛋白表达明显低于未处理A549细胞,抑制率分别为54.09%和48.26%,细胞增殖速度减缓,侵袭能力降低,流式细胞术显示早期细胞凋亡率达(12.53±0.34)%,较空白对照组、空载体转染细胞组和阴性对照组明显增加(P＜0.01).同阴性对照质粒相比,转染pshRNA-Hpa的A549细胞Akt-Ser473的磷酸化水平降低52.15%.结论 靶向乙酰肝素酶重组shRNA质粒pshRNA-Hpa能有效抑制A549细胞乙酰肝素酶的表达,并可能通过下调磷酸化蛋白激酶B途径抑制细胞的增殖侵袭、促进细胞的凋亡.     

胃癌细胞诱导凋亡过程中蛋白激酶B的表达意义

蛋白激酶B(PKB／Akt)是一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶家族，其与蛋白激酶A，蛋白激酶C有着广泛的同源性，多种细胞外因子均可以诱导PKB／Akt活性，调节细胞生长代谢活动。PKB／Akt的生物学功能之一是能够与细胞内的一些凋亡相关因子相互作用，抑制细胞凋亡，维持细胞生长。因此探讨蛋白激酶PKB／Akt在肿瘤诱导凋亡过程中的表达状况，     

PKB在类胰蛋白酶诱导基因表达中的作用

目的：探讨蛋白激酶B(PKB)在类胰蛋白酶（tryptase）诱导基因表达中的作用。 方法： 采用RT-PCR和Western blotting 方法，检测tryptase对ECV304细胞PKB（Akt）的表达及其活性和对转录因子AP-1、NF-κB p65亚单位、JNK、p38MAPK、趋化因子IL-8表达的影响。 结果： 在ECV304中1 μg/L tryptase可使PKB蛋白质磷酸化水平增加并促进PKB、转录因子NF-κB P65亚单位、AP-1和趋化因子IL-8的表达，但对JNK、p38MAPK表达影响不大。PI3K特异性抑制剂LY294002可抑制PKB的表达增加，同时可抑制NF-κB P65亚单位和IL-8的表达增加；反义PKB质粒瞬时转染ECV304，可抑制PKB、AP1、NF-κB P65亚单位和IL-8的表达增加；PAR2的抗体可抑制PKB的磷酸化，但不能阻断PKB表达。 结论： 在ECV304细胞tryptase经其膜受体PAR2通过PI3K促进PKB的磷酸化而激活之，通过其下游途径促进趋化因子IL-8、转录因子AP-1、NF-κB P65亚单位和PKB本身的表达增加。     

沙眼衣原体pORF5 蛋白通过激活PI3K / Akt 信号通路抑制细胞凋亡

目的:探讨沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)pORF5 蛋白对细胞凋亡的影响,并进一步分析其分子机制,为阐明Ct 致病机制提供实验依据。方法:pGEX-6p/ pORF5 重组质粒转化XL1-blue 大肠杆菌,IPTG 诱导表达GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白经谷胱甘肽琼脂糖凝胶4B 纯化及蛋白酶切除GST 标签后得到pORF5 蛋白。用不同浓度的pORF5 蛋白刺激HeLa 细胞,Western blot 检测不同时间Bax 和Bcl-2 的表达水平以及PI3K/ Akt 磷酸化水平,Hoechst 33342 及流式细胞技术分析细胞凋亡情况;HeLa 细胞经PI3K/ Akt 特异性抑制剂LY294002 预处理1 h 后,再用pORF5 蛋白刺激24 h,测定细胞凋亡率,并进一步分析凋亡相关蛋白Bax 和Bcl-2 的表达水平及PI3K/ Akt 磷酸化水平。结果:凋亡相关蛋白Bax 和Bcl-2 的表达变化与pORF5 蛋白浓度呈现一定的浓度和时间依赖性,当pORF5 蛋白浓度达10 μg/ ml 时,Bax 表达下调,Bcl-2 的表达上调,当升高至15 μg/ ml 时,Bax 和Bcl-2 的表达量变化最明显;15 μg/ ml 的pORF5 蛋白刺激HeLa 细胞24 h,Bax 和Bcl-2 表达变化最明显;流式细胞检测结果显示:pORF5 蛋白刺激组较TNF鄄琢处理组和未处理组细胞凋亡率分别降低了27.3% (P<0.01)和8.4% (P<0.05);Akt 在pORF5 蛋白刺激15 min 后发生磷酸化,30 min 后磷酸化水平达到峰值,用PI3K 抑制剂LY294002 预处理Hela 细胞后,发现Akt 的磷酸化显著减少,Bax 蛋白表达明显上调,Bcl-2 表达明显下调;LY294002 处理组细胞凋亡率相比于对照组增加了13.0% (P<0.01)。结论:pORF5 蛋白通过激活PI3K/ Akt 信号通路调节Bcl-2 和Bax 蛋白的表达抑制细胞凋亡。     

抑制Akt通路对前列腺癌细胞株糖酵解影响的探讨

目的:探讨LY294002和氯化钴对PC3和DU145细胞糖酵解的影响及可能的机制.方法:不同浓度的LY294002、氯化钴和LY294002联合氯化钴处理PC3和DU145细胞,检测细胞的葡萄糖消耗、Akt的磷酸化、HIF-1α的蛋白表达和几个基因的mRNA表达.结果:LY294002减少PC3细胞Akt的磷酸化、H...     

抑制PPAR-α表达对ET-1诱导的心肌肥大和PI3K/Akt/GSK3β-NFATc4通路的影响

目的：研究过氧化物酶体增殖物激活受体-α（PPAR-α）在病理性心肌肥大中的作用及其信号机制。方法:应用Invitrogen's Stealth RNAi抑制心肌细胞PPAR-α的表达;采用［3H］-亮氨酸掺入法和RT-PCR检查心肌细胞蛋白质合成和心房利钠因子(ANF) mRNA的表达;采用Western blotting法检测Akt/GSK3β的磷酸化表达;应用免疫荧光技术检测NFATc4的胞核移位。结果: (1)RSS304168 是最有效的PPAR-α RNAi,特异性地抑制了PPAR-α 的表达。(2)非诺贝特预处理抑制了内皮素-1(ET-1)诱导的心肌细胞肥大（蛋白质合成和ANF mRNA的表达）;SS304168加强了ET-1的诱导效应,而且逆转了非诺贝特对心肌肥大的抑制效应。(3)非诺贝特降低了ET-1诱导的Akt/GSK3β的磷酸化表达,RSS304168增强了ET-1的诱导效应,ET-1和RSS304168的上述作用可被PI3K阻断剂LY294002所阻断;RSS304168逆转了非诺贝特对Akt/GSK3β的磷酸化表达的负性调控作用。(4)非诺贝特抑制了ET-1诱导的NFATc4的胞核移位;而RSS304168加强了ET-1的诱导作用,逆转了非诺贝特对NFATc4胞核移位的抑制作用。结论:PPAR-α激活可以通过PI3K/Akt/GSK3β-NFATc4通路抑制ET-1诱导的心肌肥大反应。     

赖氨大黄酸通过抑制EGFR信号通路诱导宫颈癌CaSki细胞凋亡

目的 研究赖氨大黄酸(RHL)对人宫颈癌CaSki细胞增殖、凋亡的影响及EGFR信号通路在其中的作用.方法 应用MTT法检测RHL对CaSki细胞增殖的影响;应用流式细胞仪检测细胞凋亡,应用Western blot检测EGFR信号通路蛋白表达水平及其蛋白磷酸化水平.结果 RHL能有效抑制宫颈癌CaSki细胞增殖,48和72 h的ⅠC50值分别是84.57 μmol/L和74.79μmol/L,RHL能诱导CaSki细胞凋亡,随药物浓度的增加,细胞凋亡率也逐渐升高;RHL能够抑制EGFR、AKT蛋白磷酸化,并显著下调NF-κB、BCL-2及Survivin蛋白的水平(P＜0.01),同时RHL还上调BAX蛋白的表达(P＜0.01).结论 RHL可能通过EGFR/AKT/NF-κB/Survivin信号通路诱导CaSki细胞凋亡.     

羟氯喹通过PI3K/Akt通路对系统性红斑狼疮外周血单个核细胞凋亡的作用研究

目的：探讨羟氯喹对SLE患者外周血单个核细胞的凋亡作用及其相关机制。方法：对30例活动期SLE患者及15例正常健康人抽血分离PBMCs细胞进行培养,分为正常对照组、SLE组、羟氯喹5 mg/L、羟氯喹25 mg/L组,MTT法检测细胞生长抑制,采用Annexin V/PI流式细胞仪细胞检测凋亡率,Western blot方法检测BAX、BCL-2、PI3K、pAKt及mTOR等相关蛋白的表达影响。同时加入羟氯喹HCQ 25 mg/L和PI3K/AKT通路抑制剂LY294002 20 μmol/L,作用SLE患者的PBMCs细胞48 h,检测PBMCs细胞生长抑制和凋亡率。结果：SLE组比正常对照组PBMCs细胞生长抑制率和凋亡率显著升高（P<0.05）;与SLE组相比,羟氯喹5 mg/L和25 mg/L组细胞生长抑制率和凋亡率显著升高（P<0.05）。羟氯喹组与SLE组比较,PI3K、pAKt、mTOR、bcl-2的表达明显下降,差异有统计学意义（P<0.05）,bax和caspase-3的表达增加,差异有统计学意义（P<0.05）。PI3K/AKT抑制剂 LY294002能够阻断羟氯喹导致的SLE患者PBMCs细胞凋亡。结论：羟氯喹能够通过PI3K/Akt信号通路促进SLE患者体外PBMCs的凋亡。     

诱导细胞凋亡青蒿琥酯抗食管癌作用机制研究

 [摘要] 目的 研究青蒿琥酯诱导食管癌细胞凋亡作用及探讨青蒿琥酯抗食管癌作用机制。方法 不同浓度的青蒿琥酯(Artesunate, Art)(0、10、20、40μg/ml) 作用Eca109细胞24h,流式细胞术（Flow cytometry, FCM）方法检测细胞凋亡、周期及细胞中bcl-2和bax蛋白的表达量。结果 青蒿琥酯作用Eca109细胞24h后,与对照组相比,细胞凋亡率显著增高P<0.05,且具有剂量依赖性。青蒿琥酯组与对照组相比,Eca109细胞中bcl-2蛋白表达水平及细胞增殖指数显著降低P<0.05,而bax蛋白表达量显著增高P<0.05,且具有剂量依赖性。结论 青蒿琥酯可以通过调节Eca109细胞中bcl-2、bax蛋白表达水平和细胞增殖,从而诱导Eca109细胞产生凋亡,起到抗食管癌作用。     

软脂酸对INS-1胰岛细胞TXNIP表达的影响

目的:2型糖尿病患者体内持续高水平的游离脂肪酸会损伤胰岛β细胞。硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)是内源性的硫氧还蛋白(Trx)抑制蛋白。已知高糖刺激可引起TXNIP表达上调,促进胰岛β细胞凋亡,而游离脂肪酸对TXNIP的影响尚不明确。本实验旨在研究软脂酸对TXNIP表达的影响及机制。方法:在使用不同浓度和不同作用时间的软脂酸充分预实验的基础上,确定使用添加0.5 mmol/L软脂酸的RPMI-1640培养基培养INS-1胰岛细胞24 h,测定细胞TXNIP的表达变化、细胞凋亡情况及可能的调控因子变化。结果:与对照组相比,软脂酸组TXNIP的mRNA水平和蛋白表达量均明显增高(P0.01),软脂酸组凋亡明显高于对照组(P0.01)。软脂酸组的核因子κB(NF-κB)蛋白磷酸化水平升高(P0.01),使用不同的NF-κB抑制剂PDTC和SN50均可阻断软脂酸诱导的TXNIP表达上调。结论:饱和脂肪酸软脂酸可通过增加NF-κB磷酸化而上调TXNIP的表达,从而诱导INS-1胰岛细胞凋亡。     

CD137 ligand‐mediated reverse signals increase cell viability and cytokine expression in murine myeloid cells: Involvement of mTOR/p70S6 kinase and Akt

Cross‐linking of CD137 ligand (CD137L), a member of the TNF family, with recombinant CD137‐Fc (rCD137‐Fc) protein enhanced adherence of bone marrow‐derived macrophages, and increased the expression of ICAM‐1, IL‐1β, IL‐6, M‐CSF and phosphotyrosine proteins. In RAW264.7 cells, a murine myeloid cell line, rCD137‐Fc not only increased adherence but also cell multiplication, in a manner comparable to LPS or M‐CSF. In addition, it up‐regulated expression of IL‐1β, IL‐1 receptor antagonist, IL‐6, COX2, tenascin C, neuropeptide Y and M‐CSF mRNA. Neutralization of M‐CSF by incubating the RAW264.7 cells with anti‐M‐CSF mAb did not prevent the CD137L signal‐induced viability. Viability was blocked by PP2, an Src tyrosine kinase inhibitor, rapamycin, an mTOR inhibitor and LY294002, a PI3K inhibitor, but not by Wortmannin, another PI3K inhibitor. Cross‐linking of CD137L increased phosphorylation of Akt and p70S6 kinase. The latter was blocked by PP2, rapamycin or LY294002, but not by Wortmannin, whereas phosphorylation of Akt was blocked by LY294002 or Wortmannin. These findings demonstrate that reverse signals evoked by CD137L regulate immune functions in macrophages.     

Nerve Growth Factor Protects the Ischemic Heart via Attenuation of the Endoplasmic Reticulum Stress Induced Apoptosis by Activation of Phosphatidylinositol 3-Kinase

Background: Increased expression of nerve growth factor (NGF) has been found in the myocardium suffered from ischemia and reperfusion (I/R). The pro-survival activity of NGF on ischemic heart has been supposed to be mediated by phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B (PI3K/Akt) signaling pathway. Endoplasmic reticulum (ER) stress, which is activated initially as a defensive response to eliminate the accumulated unfolded proteins, has shown a critical involvement in the ischemia induced myocardial apoptosis. This study was aimed to investigate whether NGF induced heart protection against I/R injury includes a mechanism of attenuation of ER stress-induced myocardial apoptosis by activation of PI3K/Akt pathway.Methods: Isolated adult rat hearts were perfused with a Langendörff perfusion system. Hearts in the Sham group were subjected to 225 min of continuous Krebs-Henseleit buffer (KHB) perfusion without ischemia. Hearts in I/R group were perfused with KHB for a 75-min of equilibration period followed by 30 min of global ischemia and 120 min of KHB reperfusion. Hearts in the NGF group accepted 45 min of euilibration perfusion and 30 min of NGF pretreatment (with a final concentration of 100 ng/ml in the KHB) before 30 min of global ischemia and 120 min of reperfusion. Hearts in K252a and {"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"LY294002","term_id":"1257998346","term_text":"LY294002"}}LY294002 groups were pretreated with either a TrkA inhibitor, K252a or a phosphatidyl inositol 3-kinase inhibitor, {"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"LY294002","term_id":"1257998346","term_text":"LY294002"}}LY294002 for 30 min before NGF (100 ng/ml) administration. Cardiac hemodynamics were measured from the beginning of the perfusion. Cardiac enzymes and cardiac troponin I (cTnI) were assayed before ischemia and at the end of reperfusion. Myocardial apoptosis rate was measured by TUNEL staining, and expression of glucose-related protein 78 (GRP78), CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein (CHOP), caspase-12, total- and phospho-(Ser473)-Akt were assessed by Western blot analyses.Results: NGF pretreatment significantly improved the recovery of post-ischemia cardiac hemodynamics. Reduced creatine kinase-MB (CK-MB), lactate dehydrogenase (LDH) activity and cTnI levels, as well as decreased myocardial apoptosis ratio were observed in the NGF group. The improvement of NGF on recovery of cardiac function and alleviation of myocardial injury were completely abolished by K252a or {"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"LY294002","term_id":"1257998346","term_text":"LY294002"}}LY294002. GRP78, caspase-12 and CHOP were highly expressed in ischemic myocardium, while NGF significantly inhibited the overexpression of these proteins which were involved in ER stress-induced myocardial apoptosis. NGF pretreatment also induced phosphorylation of Akt. When the activation of PI3K/Akt pathway is blocked by {"type":"entrez-nucleotide","attrs":{"text":"LY294002","term_id":"1257998346","term_text":"LY294002"}}LY294002, the NGF induced suppression of the apoptosis-related proteins expression was reversed.Conclusions: NGF pretreatment may protect the ischemic heart via inhibition of the ER stress-induced apoptosis; this pro-survival effect is mediated by PI3K/Akt pathway.