SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR法测定猴免疫缺陷病毒(SIV)前病毒DNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR方法，测定猴免疫缺陷病毒（SIV）前病毒DNA。方法巢式RT-PCR扩增SIVmac251病毒RNA gag基因上1360-1837之间的长度为477bp的片段，将该片段克隆到pGEMT载体上，构建pGEM-SIV gag477质粒。该质粒经大量扩增纯化后定量，10倍系列稀释后，做出标准曲线，作为SIV前病毒DNA荧光定量检测的外标准品。结果应用Roche公司FastStart DNA Master SYBR Green Ⅰ Kit，该标准品可精确定量到10copies／μL。结论制备的pGEM-SIV gag477质粒外标准品纯度高，SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR法特异性、敏感性高，稳定性好，可用于定量测定猴免疫缺陷病毒（SIV）前病毒DNA载量。     

三种荧光染料 SYBR GreenⅠ、LCGreen PLUS、EvaGreen在实时定量 PCR应用中的比较

目的：探讨定量PCR中三种荧光染料SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen定量效果的差异。方法以三个样品基因组DNA为模板,应用巢氏PCR法先扩增G6PDH大片段,纯化回收产物,定量,并分别以10倍、5倍和2倍倍比稀释,作为定量PCR制作标准曲线的模板。应用real－time PCR仪指定试剂盒检测模板质量,再分别以含有相同Taq酶并分别含有SYBR GreenⅠ、LC Green PLUS、EvaGreen染料的试剂进行小片段定量PCR扩增,每个浓度3复孔。标准曲线拟合,结果分析用仪器自带分析软件完成。结果应用三种荧光染料获得的标准曲线回归系数≥0．98（除1个样品为0．97）,10倍、5倍梯度稀释标准曲线PCR效率为0．8～1．0,2倍稀释标准曲线PCR效率应用SYBR GreenⅠ有2／3样品＞1．2,而后两种染料为0．9～1．2。应用SYBR GreenⅠ较另两种染料的标准曲线误差较大,且样品间分散度也较大。结论在定量PCR中饱和染料LC Green PLUS、EvaGreen的定量效果好于SYBR GreenⅠ。     

鸟苷酰环化酶C质粒标准品的构建

目的:制备人鸟苷酰环化酶C(GC-C)质粒标准品,为实时荧光定量PCR检测GC-C含量,探讨大肠癌患者外周血单个核细胞(PBMC)GC-C mRNA表达水平及临床意义奠定基础。方法:在鸟苷酰环化酶C(GC-C)基因高保守区设计特异性的引物和探针,RT-PCR扩增目的片段并连接于pGEM-T载体,以得到GC-C质粒标准品。结果:经过蓝白斑筛选,PCR或EcoR I酶切初步鉴定,阳性克隆测序分析确定GC-C质粒标准品正确性。结论:正确构建GC-C质粒标准品为RFQ-PCR标准曲线的绘制及GC-C的定量检测奠定了基础。     

ERAP1基因标准品质粒的构建

目的构建人ERAP1基因的重组质粒。方法以成人皮肤组织中总RNA为模板、Random6mers为引物反转录合成cDNA,用该cDNA为模板PCR扩增人ERAP1基因,并克隆到PUC18载体,转化人大肠杆菌DH5α,阳性克隆用酶切和DNA测序鉴定。计算重组质粒原液复制数浓度并制备梯度浓度标准品,real-timePCR构建标准曲线。结果ERAPl目的片段制备成功,获得稳定的重组质粒,保证了目的片段的特异性和序列完整性,标准曲线参数良好,标准品阈值循环数（α）与其相应梯度稀释浓度呈良好线性关系,扩增效率高。结论成功地构建了人ERAPl基因的荧光定量PCR标准品质粒。     

SYBR GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR测定肠道病毒71型(EV71)RNA拷贝数方法的建立

目的建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量RT-PCR方法,测定实验动物等来源的EV71病毒RNA。方法运用EV71VP1保守区引物,优化real time RT-PCR条件,运用NASBA方法扩增EV71病毒RNA,计算拷贝数,经10倍系列稀释做出标准曲线,作为EV71病毒RNA定量检测的外标准品。结果应用Qiagen公司QuantiTect SYBR Green RT-PCR Kit,该标准品可精确定量到100copies/μL,PCR扩增效率达到99.5%。结论 SYBRGreenⅠ荧光染料实时定量PCR法测定EV71病毒RNA拷贝数的方法敏感性高、稳定性好,可用于EV71病毒RNA载量的定量测定。     

宫颈癌p16基因甲基化研究新方法

目的建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测宫颈癌p16基因甲基化的方法，以期达到早期诊断宫颈癌。方法正常基因组DNA经修饰后进行PCR，构建含有DNA甲基化β-aetin的重组质粒，克隆阳性质粒作为标准品用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR进行检测，建立检测的标准曲线。利用建立好的方法进行检测临床60例宫颈癌组织中p16基因启动子区域5’CpG岛甲基化状态。结果结果显示正常对照组织及癌旁p16基因无甲基化，60例宫颈癌标本的甲基化率为28．33％（17／60）。结论SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR用于p16基因甲基化检测为宫颈癌的早期诊断提供了一种有效的方法。     

利用SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测大鼠P物质mRNA方法的建立

目的：建立检测大鼠P物质（SP）mRNA的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法，为检测大鼠SP基因表达提供有效的手段。方法：提取大鼠中脑总RNA，扩增SP基因片段，将其克隆入pMD-18T载体，制作标准品质粒；应用SYBR Green Ⅰ双链嵌合染料，对连续稀释的标准品质粒进行实时PCR分析，评价所建立方法的检测灵敏度；对PCR产物进行溶解曲线分析评价其特异性。结果：标准品质粒构建成功，经酶切及测序鉴定，目的片段已插入pMD-18T载体；所建立的实时定量PCR方法的最低检测限度为10⁴个拷贝/反应，在每反应10⁴～10⁹拷贝范围内，Ct值（荧光信号达到设定阈值所经历的循环数）与起始模板浓度具有良好的线性关系，r=0.998。结论：所建立的检测大鼠SP mRNA的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法具有敏感性高、特异性强和线性范围广等特点，适用于对大鼠各种组织SP的大量样本检测。     

NIDD基因TaqMan探针的制备及其在实时荧光定量PCR方法中的应用

目的：制备NIDD基因TaqMan探针建立检测NIDD基因荧光定量PCR（FQ-PCR）,以进一步研究NIDD的表达情况。方法：采用RT-PCR法,从出生后一天的SD大鼠脑组织mRNA中扩增NIDD基因的部分编码序列区（CDS）片段,克隆入pGEM-T载体,筛选阳性克隆、酶切鉴定及序列测定。采用TaqMan探针,以重组质粒为模板绘制标准曲线。结果：RT—PCR法扩增出一特异产物与预期长度112bp相符,DNA序列测序的结果与C,eneBank提供的已知序列（AB098078）比较,所克隆的NIDD基因片段与其中的112bp完全相同,与NIDD基因100％同源。以重组质粒为模板绘制标准曲线,相关系数r大于0．99,反应效率显示为1,各点变异系数小于10％。结论：采用RT．PCR和T载体技术成功制备出可应用于FQ-PCR的NIDD基因TaqMan探针。     

建立SYBR Green实时RT-PCR定量检测大鼠I型胶原mRNA水平方法

目的：基于双链嵌合荧光染料SYBR Green Ⅰ,建立一种快速、灵敏的检测大鼠Ⅰ型胶原mRNA表达水平的实时逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法．方法：提取大鼠肝脏总RNA,RT-PCR扩增Ⅰ型胶原基因部分片段,将其克隆入pMD18-T载体用作参比品．基于SYBR GreenⅠ双链嵌合染料建立检测大鼠Ⅰ型胶原mRNA表达水平方法．其中对一系列连续稀释的参比品进行实时PCR分析,评价所建立方法的检测灵敏度;对PCR产物的熔解曲线进行分析评价其特异性．结果：重组质粒构建成功,经测序鉴定,目的片段已插入pMD18-T载体内．所建立的实时RT-PCR方法的最低检测限度为1个拷贝／反应,在每反应10^0～10^7拷贝范围内,CT值（C代表cycle,T代表threshold;CT值指荧光信号达到设定的阈值所经历的循环数）与起始模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0．991．结论：所建立的基于SYBR GreenⅠ双链嵌合染料的大鼠Ⅰ型胶原PCR检测方法具有敏感性高、特异性强和线性检测范围广等特点,适用于进一步的各种组织的大量样本检测．     

实时定量聚合酶链反应检测前列腺癌抗原3方法的建立

目的 建立检测前列腺癌抗原3(PCA3)基因的实时定量聚合酶链反应(PCR)方法.方法 应用反转录-PCR扩增PCA3后,通过琼脂糖凝胶电泳和基因测序进行鉴定.应用SYBR Green实时荧光定量PCR检测PCA3和建立相应的标准曲线,使用熔解曲线分析扩增产物的特异性.同时在临床标本中验证所建立的PCA3检测方法的效能...     

酪氨酸羟化酶重组质粒标准品构建

目的:用T-A克隆法构建含酪氨酸羟化酶(TH)基因的重组质粒,并用实时定量PCR(RQPCR)方法制备标准品。方法:提取小鼠肾上腺髓质组织总RNA,逆转录为cDNA后进行RT-PCR,回收纯化电泳胶,T-A克隆与pGEM-T载体连接,转化Top-10感受态细菌,蓝白斑筛选出阳性菌落后,大量提取质粒,再进行RQPCR反应,最后制得含TH的重组质粒标准品。结果:肾上腺髓质TH的表达,PCR扩增,菌液PCR,测序鉴定均证实TH重组到pGEM-T载体上,经RQPCR定量后得到TH重组质粒标准品的标准曲线。结论:该方法能大量制备TH质粒标准品,并且可推广应用。     

小鼠pMSV-Slfn5-GFP表达质粒构建及基因结构分析

目的 构建小鼠pMSV-Slfn5-GFP基因重组表达质粒及基因结构分析.方法 提取小鼠肝脏组织中总RNA,反转录为cDNA.PCR扩增小鼠Slfn5编码序列片段,并与pGEM-T Easy载体连接,连接产物转化到大肠埃希菌DH5α中.挑取阳性克隆提取质粒,经限制性内切酶H pα工和Xho Ⅰ双酶切鉴定.酶切鉴定正确的质粒送Macrogen USA测序.测序正确的质粒通过HindⅢ和XhoⅠ与pMSV-GFP连接,并命名为pMSV-Slfn5-GFP.通过UCSC(http://genome.ucsc.Edu/)分析小鼠Slfn5及其家族基因组结构,并通过NCBI确定Sgn5的蛋白结构域.结果 Slfn5全长基因序列克隆到表达载体pMSV-GFP中,酶切鉴定片段大小为2.65 kb.Slfn5的AAA_4蛋白结构域由phylogeny.fr确定了该结构在Slfn蛋白家族中的保守性.结论 成功构建了小鼠pMSV-Slfn5-GFP全长基因表达载体.     

人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达水平检测方法的建立

目的：建立实时荧光定量PCR检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达水平的检测方法,并构建相应质粒标准品,为进一步研究基因功能奠定基础。方法：提取人肠系膜动脉组织总RNA,采用RT-PCR方法获取sGCα、sGCβ、GAPDH基因片段,与pMD-18T vector连接,并转化到大肠杆菌DH5α细胞,通过PCR和测序鉴定重组质粒。提取含目的基因的质粒作为标准品,采用SYBR GreenⅠ法检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达和构建标准曲线。结果：人肠系膜动脉平滑肌存在sGCα和sGCβ基因表达,质粒标准品经过PCR鉴定并测序,与数据库公布的序列完全一致,标准曲线线性关系好,相关系数R2〉0.99。结论：建立了稳定的定量检测方法,并成功用于检测人肠系膜动脉平滑肌sGCα和sGCβ基因表达,构建质粒标准品能用于后续实验。     

人端粒酶逆转录酶启动子调控的真核荧光表达载体的构建与表达

目的:克隆人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子,构建真核表达载体pEGFP-C3-hTERTp.方法:PCR方法扩增出hTERTp,依次克隆至pGEM-T Easy载体和重组载体pEGFP-C3上.经酶切和测序鉴定后,重组质粒pEGFP-C3-hTERTp转染人胚肾293A细胞,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况.结果:成功扩增出276 bp的hTERTp,测序结果与GenBank中hTERT启动子DNA序列完全一致.重组载体pEGFP-C3-hTERTp转染293A细胞能观察到荧光表达.结论:成功构建了hTERT启动子调控的真核绿色荧光表达载体pEGFP-C3-hTERTp,其能够在人胚肾293A细胞中表达.     

淋巴瘤Bcl-2/IgH融合基因实时定量PCR检测方法的研究

目的 建Bcl-2/IgH融合基因实时定量PCR检测方法.方法 以淋巴瘤患者Bcl-2/IgH融合基因的纯化DNA作为标准品,淋巴瘤患者骨髓和外周血为样本,建立SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量PCR(Real-time Quantitative PCR,RQ-PCR),并对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行测定.结果 构建的RQ-PCR方法检测Bcl-2/IgH融合基因的敏感性迭10-7 水平;标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.13,0.99;管间变异和批问变异分别为6.54%,6.73%,1.90%和3.59%,6.30%,5.49%.结论 建立的SYBR Green Ⅰ荧光染料RQ-PCR方法灵敏,标准曲线的相关性好,方法的稳定性和重复性较好.     

淋巴瘤Bcl-2/IgH融合基因实时定量PCR检测方法的研究

目的建立Bcl-2/IgH融合基因实时定量PCR检测方法。方法以淋巴瘤患者Bcl-2/IgH融合基因的纯化DNA作为标准品,淋巴瘤患者骨髓和外周血为样本,建立SYBR GreenⅠ荧光染料实时定量PCR（Real-time Quantitative PCR,RQ-PCR）,并对方法的灵敏性、稳定性、重复性进行测定。结果构建的RQ-PCR方法检测Bcl-2/IgH融合基因的敏感性达10^-7水平;标准曲线的斜率和相关系数分别为-3.13,0.99;管间变异和批间变异分别为6.54%,6.73%,1.90%和3.59%,6.30%,5.49%。结论建立的SYBR GreenⅠ荧光染料RQ-PCR方法灵敏,标准曲线的相关性好,方法的稳定性和重复性较好。     

人前列腺特异性抗原mRNA实时荧光POR定量标准品的构建

目的 构建实时荧光定量PCR（FQ-PCR）的标准品以定量检测人前列腺特异性抗原（PSA）mRNA的表达。方法 以Trizol裂解抽提法提取LNcaP细胞的总RNA。以RT-PCR法制备PSAcDNA目的片段并进行扩增；以A-T载体克隆法制备重组质粒，并转化EcoliDH5。菌提取重组质粒，联合用氨苄青霉素筛选法和筛选法、EcoRI限制性酶切和序列分析法鉴定特异性重组质粒。用聚乙二醇沉淀法提纯质粒并检测）．260nm吸光度，确定原液的重组质粒的拷贝浓度并以此制备FQPCR梯度标准品。结果 PSAcDNA目的片段成功制备并获得稳定的重组质粒。保持了目的片段的特异性和序列的完整性。结论 成功构建了实时荧光定量PCR标准品。     

人心房肌KCh1P2和SK2基因表达检测及方法研究

目的 检测人心房肌KChIP2和SK2基因表达,并构建相应质粒标准品,为进一步研究基因功能奠定基础.方法 提取人心房肌组织总RNA,采用RT-PCR方法获取KChIP2、SK2、GAPDH、β-actin目的 片段,与pMD-18T vector连接成重组质粒,转化到大肠杆菌DH5α中,通过PCR和测序鉴定.提取含目的 基因的质粒作为标准品.采用Taqman探针法与SYBR Green Ⅰ法分别检测人心房肌SK2与KChIP2基因表达和构建标准曲线.结果 人心房肌存在KChIP2和SK2基因表达.质粒标准品经过PCR鉴定并测序.与Pubmed数据库完全一致,标准曲线线性关系好,相关系数R2>0.99.结论 成功检测人心房肌KChIP2和SK2基因表达,构建的质粒标准品能用于后续实验.     

人FHIT基因实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的：建立检测人脆性组氨酸三联体（fragile histidine triad,FHIT）基因的荧光定量RT-PCR方法。方法：根据GenBank中人FHIT基因序列,在保守区设计合成一对特异引物,将PCR扩增得到的FHIT基因克隆至PMD18-T载体上,构建的重组质粒标准品倍比稀释后运用SYBR Green I染料法绘制标准曲线,并进行融解曲线分析。结果：FHIT基因的标准品稀释度在1×107～1×103copies/μl范围内具有良好的线性关系,Ct值线性范围为14.28～28.36,相关系数为0.998,融解曲线分析表明,产物为特异的单峰,Tm为92.3±0.1℃。结论：建立了人FHIT基因实时荧光定量RT-PCR方法,为在mRNA水平对人FHIT的定量分析奠定了基础。     

小鼠脑脊髓炎病毒非编码蛋白片段实时荧光定量PCR标准品的构建

目的 构建小鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)非编码蛋白(UTR)片段标准品,用于实时荧光定量 PCR检测小鼠脑脊髓炎病毒.方法 RT-PCR 扩增TMEV UTR片段上80~1094 nt之间长度为1 014 bp的片段,将目的 片段连接至pMD18-T载体,转化至DH5a感受态细胞.分别经 PCR鉴定和序列测定验证重组质粒.分光光度计测量重组质粒的吸光值,换算成拷贝数浓度后作10倍梯度稀释制得质粒标准品.然后进行实时荧光定量PCR分析,绘制标准曲线.结果 TMEV UTR片段成功克隆至pMD18-T载体中,测序结果 表明重组质粒中插入的UTR序列正确,实时荧光定量PCR分析10倍梯度系列稀释的质粒标准品所得到的标准曲线良好,统计学分析显示Ct值与标准品浓度的对数存在良好线性关系,回归系数在0.99以上.结论 成功构建了TMEV UTR 片段实时荧光定量PCR标准品,为今后TMEV实时荧光定量PCR检测打下了基础.