3个鼠源性肿瘤线粒体DNA编码区基因RFLP分析

目的了解线粒体DNA突变在肿瘤发生发展中的作用.方法应用PCR-限制性片段长度多态性分析技术对LA795、CT26和SCC891等3个肿瘤细胞系mtDNA编码区基因片段进行了分析.结果 mtDNA编码区的tRNAMet Glu Ⅰle及NDI基因核酸片段经HaeⅢ等16种内切酶消化后,这些肿瘤细胞系表现出完全相同的酶切图谱,其酶切格局及酶切片段大小完全相同.结论本组肿瘤细胞系mtDNA编码区基因结构相对稳定.     

高低转移小鼠肝癌细胞线粒体DNA遗传变异的研究

目的 检测和分析转移特性不同的两个小鼠肝癌细胞亚系线粒体DNA(mtDNA)的遗传变异,探讨线粒体DNA遗传改变与肿瘤发生发展的关系.方法 PCR-RFLP和序列测定技术.结果 对mtDNA的tRNA Ile GlN Met基因和ND3基因以及D-loop片段进行的扩增和限制性片段长度多态性分析结果 显示,无扩增片段长度呈多态性,且这两个肝癌细胞系mtDNA的所有限制性片段方式和大小完全一致.序列测定发现,这两个肝癌细胞系在线粒体DNA的 D-loop区存在序列差异.结论 mtDNA 非编码区内的遗传改变,反映了肿瘤发生发展过程中环境和遗传因素的影响,有可能与肿瘤细胞的恶性表型有关.     

Study on mitochondrial DNA diversity among 7 inbred strains of mice

Objective：To study the genetic variation of mitochondrial DNA （mtDNA） among common laboratory strains of inbred mice. Methods： The genetic polymorphism of mtDNA among 4 classical laboratory strains of inbred mice and 3 inbred strains of mice established in China was analyzed by polymerase chain reaction coupled with restriction fragment length polymorphism（PCR-RFLP） and PCR coupled with single-stranded conformation polymorphism（PCR-SSCP）. Results： With regard to the D-loop （Displacement loop, D-loop）, tRNA^ Met＋Glu＋Ile, and ND3 （NADH dehydrogenase subunit 3, ND3） gene fragments of mtDNA from these mice,no variation was revealed by PCR-RFLP at 46 restriction enzyme sites. Further analyzed by PCR-SSCP,the D-loop 5＇fragment and 3＇end fragment of mtDNA from these mice also showed no genetic variation. Conclusion： Owing to maternal mode of inheritance of mtDNA,the results indicate that these common inbred strains of mice share the same maternal lineage.     

Mutations of mitochondrion DNA in mouse tumors

Objective： To ascertain the variations of mitochondrion DNA （mtDNA） in mouse tumors and to inquire into the relationship between mutations of mtDNA and carcinogenesis Methods： The variations of D-loop, ND3 and tRNA^Met＋Glu＋Ile gene fragments of mtDNA from six tumor cell lines of mice were analyzed by PCR technology with restriction fragment length polymorphism analysis （polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP） and single strand conformation polymorphism analysis （SSCP-PCR） method. Results： ND3 and tRNA^Met＋Glu＋Ile gene fragments ofmtDNA from the tumors showed no variation in 27 endonuclease sites; D-loop ofmtDNA from Hca-F had an additional endonuclease sites of Hinf I in contrast to that of the inbred mouse. Deeply analyzed by PCR-SSCP, the D-loop ofmtDNA was found to possess mutations in 4 of 6 tumors. Conclusion： D-loop is the hot spot of tumor mtDNA mutation which can act as contributors to the carcinogenic     

胃癌线粒体DNA D-loop区碱基突变的检测分析

目的 研究胃癌患者的癌组织线粒体DNA （mtDNA）D-loop区碱基突变情况,以探讨mtDNA D-loop区碱基突变与胃癌发生发展的相关性.方法 采用聚合酶链反应和DNA测序相结合的方法,对75例胃癌患者癌组织线粒体D-loop 区进行扩增并测序分析.结果 在75例胃癌组织中共有130个位点发生了变化,其中属于基因多态性有101个,基因突变有29个.75例胃癌组织中39例mtDNA D-loop区存在突变,突变率为52%.结论 mtDNA D-loop 区碱基突变可能在胃癌发生发展中发挥重要作用.     

人肝癌SMMC-7721细胞株部分线粒体基因表达的研究

目的:观察人肝癌SMMC-7721细胞株部分线粒体DNA(mtDNA)基因表达的情况.方法:根据人线粒体DNA(mtDNA)基因序列,利用primer premier 5.0生物软件设计了4对PCR引物,分别是扩增D-loop区、ND6、ATPase8-ATPase6、16sRNA基因,采用RT-PCR方法对SMMC-7721细胞线粒体DNA上D-loop区及其他3个基因的表达进行了检测,并与其在正常人肝细胞株(L02)线粒体中的表达作了比较.结果:我们发现,与正常人肝细胞株(L02)相比,在SMMC-7721细胞中,D-loop区、ND6、ATPase8-ATPase6基因表达总体是增高的,16sRNA基因表达基本不变,同时在同一基因两条链(重链和轻链)之间的表达也存在差异.结论:我们认为,由于线粒体DNA编码的多肽均是氧化磷酸化酶复合物的亚单位,这些基因表达的异常可能造成细胞对氧利用障碍,细胞能量产生减少,成为造成SMMC-7721细胞主要以糖酵解的方式提供能量的重要原因之一.     

淋巴瘤组织中线粒体DNA突变的研究

目的 通过检测恶性淋巴瘤组织中线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的突变,以探讨mtDNA突变在恶性淋巴瘤发生中的作用.方法 提取38例恶性淋巴瘤组织及其对应患者外周血白细胞的DNA,经PCR扩增部分mtDNA片段,PCR产物直接测序法测定mtDNA序列.以外周血淋巴细胞测序结果作为对照,确定肿瘤组织mtDNA的突变.结果 18例(47.4%)恶性淋巴瘤组织中发现25个突变,25个突变发生在15个核苷酸位点,其中21个突变位于mtDNA的D-Loop区,4个突变位于mtDNA的编码区,D-Loop发生变异的频率是编码区的4.26倍.13个(13/25,52%)突变位于mtDNA多态性位点.结论 恶性淋巴瘤组织中存在mtDNA的突变,mtDNA突变可能与淋巴瘤的发生、进展有一定关系.     

亨廷顿舞蹈病患者mtDNA D环突变及编码区大片段缺失分析

目的:探讨人类mtDNA D环突变及编码区大片段缺失与亨廷顿舞蹈病的关系。方法:采用PCR-DNA测序技术对2个亨廷顿舞蹈病家系的8名患者、20名家系内正常人及20名无关健康个体的mtDNA D环高变区突变及编码区大片段缺失进行检测。结果:患者D环高变区未发现片段缺失/插入突变,高变区Ⅰ的rs16061~rs16171是核苷酸歧变的集中区域。3名患者和16名家系内正常人存在mtDNA编码区大片段缺失。结论:mtDNA D环调控序列的大片段缺失/插入突变及编码区大片段缺失可能不是亨廷顿舞蹈病发病机制中的主要因素。     

小鼠可溶性ST2基因的克隆及其真核表达载体的构建

目的:克隆小鼠可溶性ST2基因并构建其真核表达载体。方法:从小鼠肥大细胞株P815中提取总RNA,逆转录为cDNA,用热启动PCR技术,扩增小鼠可溶性ST2基因全长编码区,经双酶切后,克隆入pcDNA3.1载体中,构建真核表达载体pcDNA3.1-mST2,然后进行酶切鉴定和序列分析。结果:小鼠可溶性ST2基因的PCR产物和重组载体经凝胶电泳和酶切鉴定、测序分析证实,其序列与GenBank中数据一致。小鼠可溶性ST2基因的全长编码序列为1 011 bp,编码336个氨基酸。结论:用热启动PCR技术能方便、准确地获得目的基因片段。成功地克隆小鼠可溶性ST2基因并构建了其真核表达载体,为进一步进行小鼠可溶性ST2蛋白的表达和功能研究奠定了基础。     

线粒体基因D-loop区在胃癌中的突变及多态性研究

目的线粒体基因（mitochondfial DNA，mtDNA）的突变通常被认为与肿瘤的形成有关，本研究检测胃癌组织mtDNA D-loop区的突变及多态性，以探讨两者的相关性．方法PCR扩增和测序检查胃癌组织和相应正常组织的线粒体基因D—loop区全序列，并与线粒体文库记录的Revised Cambridge Reference Sequence（rCRS）进行比对分析．结果15例胃肿瘤中检测出mtDNAD—loop区的162个多态性变异，其中6个（3．7％）为新发现的变异．7例（46．7％）胃癌组织发现体细胞性突变共11次．突变热点集中在HVⅠ区（27．3％）和HVII区（54．5％），并且HVⅡ区较HVⅠ区更易突变．结论D—loop区的高度多态性和突变与胃癌的发生具有相关性．     

人大肠癌线粒体DNA重组质粒的构建及对NIH3T3细胞的转染

目的: 构建pcDNA3. 1( )-mtDNA真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞.方法: 提取大肠癌细胞株(SW480,Lovo,HT29)mtDNA,扩增D-loop区,产物用DNA自动测序法进行序列分析.利用DNA重组技术将其定向插人真核表达质粒pcDNA3. 1( ),并用脂质体法导入NIH3T3细胞.结果: 大肠癌细胞株SW480,Lovo,HT29细胞mtDNA D-loop分别有10,9,8个突变位点.成功克隆1119 kb的mtDNA D-loop区至表达质粒pcDNA3. 1( ),并导入NIH3T3细胞中.结论: 成功构建了pcDNA3. 1( )-mtDNA真核表达重组体,并成功导入NIH3T3细胞中.     

基因芯片筛查糖尿病线粒体基因突变

目的建立一种快速、准确的高通量检测线粒体DNA突变的基因芯片技术,并探讨这些突变与糖尿病的关系。方法以尼龙膜为介质,通过紫外交联固定28个待测突变位点的野生型和突变型探针,并采用该基因芯片对200例2型糖尿病患者和210名健康对照的线粒体tRNA leu（UUR）基因及ND1基因进行筛查,DNA测序进一步确证突变位点,Mfold和Antheprot软件预测变异型基因及蛋白质二级结构。结果成功研制可检测28个突变位点的线粒体DNA芯片,在糖尿病组检出tRNA leu（UUR）基因13290C突变2例（1．0％）,ND1基因突变23例：G3316A突变6例（3．0％）、13394C突变5例（2．5％）、A4164G突变8例（4．0％）,T4216C突变2例（1．0％）,T3593C（0．5％）和A3606G突变各1例（0．5％）;对照组检出G3316A突变1例（0．5％）、A4164G突变5例（2．4％）。这些突变位点的测序结果与基因芯片检测结果一致。两组间仅13394C突变率差异有统计学意义（P=0．027）。G3316A突变导致丙氨酸→苏氨酸,13394C突变导致酪氨酸→组氨酸,13593C突变导致缬氨酸→丙氨酸,T4216C突变导致酪氨酸→组氨酸,A3606G和A4164G突变分别为亮氨酸和蛋氨酸的无意义突变,前4种突变型的ND1蛋白二级结构不同于野生型。结论线粒体DNA芯片是一种快速可靠的高通量基因突变检测方法,ND1基因13394C突变可能参与了线粒体基因缺陷型糖尿病的发病。     

颞下颌关节骨关节病髁突软骨细胞线粒体DNA突变的实验研究

目的:探讨颞下颌关节骨关节病髁突软骨细胞线粒体DNA突变及其意义.方法:去除左侧部分关节盘建立大鼠颞下颌关节骨关节病模型,培养骨关节病(术后3月)和正常髁突软骨细胞.采用32对引物,使用PCR技术部分重叠扩增全长线粒体DNA,并将PCR产物进行时间温度梯度电泳,对电泳条带与正常有差异的PCR产物进行测序.结果:在35个具有异质性突变特点的PCR产物中,发现42个异质性突变,tRNA和D-loop具有高突变率.结论:颞下颌关节骨关节病髁突软骨细胞线粒体DNA存在突变.     

An Ile93Met substitution in the UCH-L1 gene is not a disease-causing mutation for idiopathic Parkinson’s disease

Objective To ascertain whether a coding mutation(Ⅱe93Met) in ubiquitin carboxy-terminal hydrolase(UCH-L1) gene plays a role in idiopathic Parkinson‘s disease(IPD).Methods Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism assay(PCR-RFLP) was used to distingusih the wild-type(two DNA fagments of 34 and 126bp)from the variant allele(three fragments of 34,60 and 66bp)because the mutation created a new site for restriction engonuclease Bsm F1.DNA was isolated from various blood samples using a phenolchlorofom extraction.     

人大肠癌线粒体DNA重组质粒的构建

目的 了解大肠癌细胞株(SW480,LoVo,HT29)线粒体DNA的突变,克隆突变的大肠癌线粒体DNA(mtDNA)基因,构建pcDNA3.I(+)-mtDNA真核表达重组体,并导入NIH3T3细胞,以探讨线粒体基因突变与肿瘤发生的关系。方法 提取大肠癌细胞株(SW480,LoVo,HT29)mtDNA,扩增D-LOOP区,产物用DNA自动测序法进行序列分析。利用DNA重组技术将其定向插人真核表达质粒pcDNA3.1(+),并用脂质体法导人NIH3T3细胞。结果 检测出大肠癌细胞株SW480、LoVo、HT29细胞mtDNAD-LOOP分别有10、9、8个突变位点。成功克隆1119bp的mtDNAD-LOOP区至表达质粒pcDNA3.1(+),并导入NIH3T3细胞中。结论 线粒体DNAD-LOOP区是一个具有高度多态性和突变性的区域,在大肠癌细胞株中突变率较高。     

人大肠癌线粒体DNA重组质粒的构建

目的了解大肠癌细胞株（SW480，LoVo，HT29）线粒体DNA的突变，克隆突变的大肠癌线粒体DNA（mtDNA）基因，构建pcDNA3．1（＋）-mtDNA真核表达重组体，并导入NIH3T3细胞，以探讨线粒体基因突变与肿瘤发生的关系。方法提取大肠癌细胞株（SW480，LoVo，HT29）mtDNA，扩增D-LOOP区，产物用DNA自动测序法进行序列分析。利用DNA重组技术将其定向插人真核表达质粒pcDNA3．1（＋），并用脂质体法导人NIH3T3细胞。结果检测出大肠癌细胞株SW480、LoVo、HT29细胞mtDNAD—LOOP分别有10、9、8个突变位点。成功克隆1119bp的mtDNAD—LOOP区至表达质粒pcDNA3．1（＋），并导入NIH3T3细胞中。结论线粒体DNAD-LOOP区是一个具有高度多态性和突变性的区域，在大肠癌细胞株中突变率较高。