SPK、S1P蛋白在骨肉瘤中的表达及其临床意义

目的：探讨鞘氨醇激酶1(SPK1)、1-磷酸鞘氨醇(S1P)在骨肉瘤中的表达及其临床意义。方法：选择行手术治疗的73例骨肉瘤病人作为观察对象,选择同期骨软骨瘤手术切除标本31例作为对照,免疫组织化学法检测骨肉瘤组织与软骨瘤组织中SPK1、S1P蛋白表达水平,分析SPK1、S1P表达水平与骨肉瘤临床病理特征的关系,Kaplan-Meier生存曲线分析SPK1、S1P表达与骨肉瘤病人生存率的关系。结果：骨肉瘤组织SPK1阳性表达率为68.49%,高于软骨瘤组织中阳性表达率16.13%(P<0.01);骨肉瘤组织S1P阳性表达率为58.90%,高于软骨瘤组织中阳性表达率22.58%(P<0.01);SPK1、S1P在Eneeking分期为Ⅱ～Ⅲ期和肺转移的病人中阳性表达率较高(P<0.05～P<0.01);SPK1、S1P在病人的不同性别、年龄、肿瘤直径、发病部位、病理类型的阳性表达率差异无统计学意义(P>0.05);SPK1阳性表达组3年生存率低于SPK1阴性表达组(P<0.05);S1P阳性表达组3年生存率低于S1P阴性表达组(P<0.05)。结...     

1-磷酸鞘氨醇及受体1在小鼠肺缺血再灌注损伤中的表达变化和意义

目的 探讨1-磷酸鞘氨醇（sphingosine-1-phosphate,S1P）及其受体1（S1PR1）在肺缺血再灌注损伤（PIRI）肺组织中的表达变化及意义。方法 采用无损伤血管夹阻断小鼠左主支气管、左肺静脉和左肺动脉缺血30 min，松开血管夹，接受再灌注2 h，制作小鼠PIRI模型（n=8），同时设正常对照组（n=8）和假手术组（n=8），3组小鼠均处死后取肺组织。根据肺组织HE染色、湿/干质量比结果论证模型制作情况。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测肺组织中生成S1P的关键限速酶鞘氨醇激酶-1（SphK1）及S1PR1 mRNA表达变化；酶联免疫吸附法（ELISA） 检测肺组织中S1P及S1PR1蛋白含量的变化。结果 与正常对照组和假手术组比较，缺血再灌注可导致肺组织病理评分升高，肺干/湿质量比增高，肺组织SphK1和S1PR1 mRNA表达升高（P<0.05），肺组织中S1P、S1PR1蛋白含量均明显增加（P<0.05）。结论 PIRI后，肺组织中S1P及S1PR1的表达升高，提示S1P/S1PR1信号通路参与了PIRI的病理生理改变过程，可能是PIRI潜在的治疗靶点。     

PC12细胞中Vd介导的SPHK1/S1P通路及其在EAE中的潜在功能

目的 探讨维生素D(V_d)通过鞘氨醇激酶1(SPHK1)影响1-磷酸鞘氨醇(S1P)的合成从而对实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发病过程产生的影响。 方法 体外培养PC12细胞,分别用不同浓度的V_d对PC12细胞进行刺激,分为0、6.25、12.5、25、50、100 nmol/L V_d 组。Western blotting检测SPHK1表达量;RT-PCR检测SPHK1 mRNA的表达;ELISA检测S1P合成量。 结果 加入药物V_d刺激PC12细胞24 h后,不同浓度的V_d组SPHK1表达量较0 nmol/L V_d组减少(P<0.05);RT-PCR检测结果显示,不同浓度的V_d组SPHK1较0 nmol/L V_d 组mRNA亦有下调(P<0.05);不同浓度的V_d组S1P合成量较0 nmol/L V_d 组减少(P<0.05)。 结论 V_d可能通过调节SPHK1的表达来影响S1P的合成,以缓解EAE的发病进程。     

靶向S1PR3基因shRNA慢病毒表达载体构建及功能鉴定

目的：构建靶向小鼠S1PR3基因的shRNA慢病毒表达载体,并验证其对内皮祖细胞迁移能力的影响。方法依照shRNA设计原则,合成对应的shRNA序列,将其克隆到PHBLV载体中,使用三载体系统进行病毒包装,收集制备成功的病毒,并用荧光显微镜法测定病毒滴度,使用病毒感染EPC后,测定各组细胞中S1PR3蛋白表达情况,选择合适的病毒感染EPC后,测定其对EPC迁移能力的影响。结果成功将shRNA序列克隆到慢病毒表达载体PHBLV-U6-RFP,表达质粒与辅助质粒共转染293细胞后48 h就可以看到细胞中成功表达红色荧光。收集培养成功病毒感染小鼠EPC,可以不同程度干扰细胞中S1PR3蛋白表达,S1PR3蛋白表达受到抑制后,EPC的迁移能力明显减弱。结论我们成功构建了可以有效干扰S1PR3表达的慢病毒载体,并初步观察了其对EPC细胞的迁移能力的影响,为后续进一步调控S1PR3相关的细胞功能的研究奠定了基础。     

SphK/S1P信号通路与肾脏炎症研究进展

肾小球肾炎是慢性肾脏病发展到肾衰竭所经历的慢性的、逐步进展性的肾脏局部炎性反应,包括肾小球系膜细胞增殖、系膜基质合成增多、炎性因子合成增加等。抑制或减轻肾脏炎性反应可以延缓慢性肾炎发展到慢性肾衰竭的病程。近年来发现SphK/S1P信号通路在肾脏炎性反应的过程中发挥了一定的作用,SphK/S1P信号通路可能是临床干预以及治疗肾小球肾炎的另一靶点。     

1-磷酸鞘氨醇受体2抑制小鼠血管通透性研究

目的 研究1-磷酸鞘氨醇受体2（S1PR2）对小鼠血管通透性的作用。方法 将野生鼠和S1pr2-/-鼠(S1pr2基因缺乏)气管内滴注脂多糖（LPS）制备急性肺损伤模型（LPS组）,以气管内滴注生理盐水为对照。通过检测肺伊文思蓝色素漏出,异硫氰酸荧光素（FITC）标记的葡聚糖肺血管渗漏,以及肺组织湿质量/干质量比值,观察S1PR2对血管通透性的影响,并通过Miles分析,观察血管内皮细胞生长因子（VEGF）对皮肤血管内皮通透性亢进反应。结果 与生理盐水组比较, LPS注射增加野生鼠和S1pr2-/-鼠伊文思蓝漏出（P 均<0.01）、FITC标记葡聚糖肺血管外漏出（P 均<0.01）和引起肺水肿。LPS组中S1pr2-/-鼠与野生鼠比较,伊文思蓝漏出量、FITC标记葡聚糖肺血管外漏出更多（P 均<0.01）,肺水肿更重（P <0.001）;LPS组野生型和S1pr2-/-鼠均增加VEGF剂量依赖性的伊文思蓝漏出,在50、100 ng的VEGF诱导下,与野生鼠比较,S1pr2-/-鼠伊文思蓝漏出量均较高（P 均<0.01）。结论 S1PR2参与内皮细胞屏障保护,抑制血管通透性。     

新型前药类S1P1激动剂Syl978的药理活性

通过对新型免疫抑制剂芬戈莫德(FTY720)的结构改造获得具有全新结构的选择性鞘氨醇-1-磷酸1型受体(sphingosine-1-phosphate receptor 1,S1P1)前药类激动剂Syl978。体外S1P受体激动试验表明:其活性磷酸酯形式Syl978-P对S1P1受体具有显著的激动活性,而对于鞘氨醇-1-磷酸3型受体(S1P3)的激动作用较弱,显示良好的受体激动选择性。单次灌胃分别给予SD大鼠0.3,1,3 mg/kg的Syl978都能够显著降低动物外周血淋巴细胞水平,且显示出良好的量效关系。单次灌胃给予SD大鼠10 mg/kg的Syl978对大鼠心率并没有明显影响。研究结果表明,Syl978具有较好的体内外生物活性,具有开发成为治疗自身免疫性疾病药物的良好前景。     

1-磷酸鞘氨醇受体2(S1PR2)通过保护肠黏膜屏障功能缓解炎症性肠病的作用

目的研究1-磷酸鞘氨醇受体2(S1PR2)通过保护肠黏膜屏障缓解炎症性肠病的作用。方法构建S1PR2基因敲除鼠。用硫酸葡聚糖钠盐(DSS)诱导结肠炎。血清荧光素异硫氰酸酯(FITC)浓度测定体内外小鼠肠道渗透性。酶联免疫吸附实验(ELISA)测定细胞悬液中的肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和干扰素-γ(IFN-γ)水平。结果野生型(WT)小鼠存活率及体重高于S1PR2-/-小鼠,差异有统计学意义(P0.05)。S1PR2-/-小鼠的结肠缩短比WT小鼠更明显,差异有统计学意义(P0.05)。DSS处理组小鼠结肠细胞悬液中IFN-γ、IL-6和TNF-α浓度较对照组水平升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论 S1PR2通过保护肠黏膜屏障功能缓解炎症性肠病。     

SPK1基因转染对大鼠骨髓间充质干细胞的影响

目的观察鞘氨醇激酶-1（SPK-1）基因修饰对大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性的影响。方法分别用携带SPK-1和绿色荧光蛋白（GFP）的腺病毒载体,感染大鼠骨髓间充质干细胞后用WesternBlot的方法检测SPK1蛋白表达,用[32P]ATP掺入法检测SPK-1酶活性,用MTT法测定细胞增殖,用特殊诱导剂在体外向成骨和成脂细胞诱导后检测碱性磷酸酶的活性及油红O染色,用AnnexinV-PI双标法检测去血清诱导后细胞凋亡比例。结果Ad-SPK感染大鼠骨髓间充质干细胞后可有效表达SPK-1蛋白且有较高的酶活性;基因转染不影响MSC的增殖和向成骨、成脂细胞的分化,但可显著抑制去血清诱导的细胞凋亡。结论腺病毒介导的SPK-1基因转染不影响MSC的增殖、分化等干细胞基本特性,但可显著增强其抗凋亡能力。     

CR1在红细胞免疫中的研究进展

目的总结Ⅰ型补体受体(CR1,CD35)在红细胞免疫中的研究进展。方法通过阅读有关文献,了解红细胞CR1在红细胞免疫研究中的地位。结果CR1分子有其特定的编码基因、分子结构、生物学特性,广泛参与体内免疫复合物(IC)的清除。结论CR1是红细胞执行免疫功能的主要分子基础。     

老年男性初发2型糖尿病患者鞘氨醇-1-磷酸与骨代谢的相关性

目的探讨鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate, S1P）与骨转换标志物、骨密度和骨折发生风险的相关性。方法纳入59例老年男性初发2型糖病患者作为2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus, T2DM）组,49例非糖尿病居民作为非糖尿病（non diabetes mellitus, NDM）组,收集临床资料,采集静脉血,检查骨密度,计算FRAX评分,比较两组一般资料、糖脂代谢和骨代谢生化指标、骨密度、骨折发生风险及S1P水平的差异,分析S1P与骨转换标志物、骨折发生风险和糖代谢指标的相关性。结果与NDM组比较,T2DM组空腹血糖（fasting plasma glucose, FPG）、糖化血红蛋白（glycosylated hemoglobin Alc, HbAlc）、游离脂肪酸（free fatty acids, FFA）显著升高（P＜0.01）,总胆固醇（total cholesterol, TC）、甘油三酯（triglycerides, TG）、 低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein cholesterol, LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol, HDL-C）差异无统计学意义（P≥0.05）;T2DM组甲状旁腺激素（parathyroid hormone, PTH）显著降低（P＜0.01）,钙（calcium, Ca）、磷（phosphorus, P）差异无统计学意义（P≥0.05）;T2DM组骨钙素（osteocalcin, OC）、骨型碱性磷酸酶（bone alkaline phosphatase, BALP）、β-Ⅰ型胶原C端肽（β cross-linked c-telopeptide, β-CTX）显著降低（P＜0.01）,Ⅰ型胶原氨基端延长肽（procollagen type 1 n-terminal propetide, PlNP）、 抗酒石酸酸性磷酸酶-5b（tartrate-resistant acid phosphatase-5b, TRACP-5b）和不同部位骨密度差异无统计学意义（P≥0.05）;T2DM组10年内主要骨质疏松性骨折风险FRAX评分（FRAX 10-year major osteoporotic fracture risk score, FRAXM）和10年内髋部骨折风险FRAX评分（FRAX 10-year hip fracture risk score, FRAXH）显著升高（P＜0.01）;T2DM组血清S1P显著高于NDM组（P＜0.01）。NDM组S1P与TRACP-5b呈正相关（P＜0.05）;T2DM组S1P与5种传统骨代谢标志物均无相关性（P≥0.05）。两组血清S1P与骨密度、FRAXM和FRAXH均无相关性（P≥0.05）。两组血清S1P与FPG和HbAlc均无相关性（P≥0.05）。结论老年男性T2DM组血清S1P水平升高,S1P与传统骨转换标志物、骨密度、FRAXM和FRAXH无相关性。NDM组血清S1P与TRACP-5b呈正相关。     

重组人白介素1受体Ⅰ型细胞外基因在毕赤酵母的表达

目的 构建白介素1受体Ⅰ型细胞外基因(可溶性白介素1受体Ⅰ型,sIL-1R Ⅰ)的pPICZαA-sIL-1R Ⅰ重组表达载体,利用毕赤酵母表达技术表达sIL-IR Ⅰ蛋向.方法 采用RT-PCR技术扩增基因sIL-1R Ⅰ.经酶切连接构建重组质粒pPICZαA-sIL-IR Ⅰ,转化E.coli Stb13;阳性克隆经测序成功后,把pPICZαA-sIL-IR Ⅰ重组质粒电转入毕赤酵母菌株GS115,PCR对阳性克隆进行鉴定,以及对GS115转化子表型筛选.确定表型后,对重组菌株进行甲醇诱导蛋白表达.提取菌体蛋白和上清液进行Western blotting检测以鉴定蛋白表达属于菌内表达还是分泌表达.结果 pPICZαA-sIL-IR Ⅰ重组质粒构建成功;pPICZαA-sIL-IR Ⅰ成功电转入酵母菌GS115:转化子表型筛选结果为甲醇诱导缓慢型Muts:对培养上清和菌体蛋白进行Western blotting检测结果:上清没有检测到蛋白,在菌体内检测到蛋白.结论 成功运用毕赤酵母表达体系表达sIL-1R Ⅰ蛋白,为sIL-IR Ⅰ的研究和应用提供实验基础.     

腺病毒介导的可溶性Ⅰ型补体受体基因转染对急性心肌缺血的保护作用的实验研究

目的:探讨腺病毒介导的可溶性Ⅰ型补体受体(soluble complement receptor type 1,sCR1) 基因转染对急性心肌缺血的保护作用.方法:开胸阻断小鼠左冠状动脉前降支起始部30 min后开放,实验组(14只)在开放冠状动脉前5 min于缺血区注射携带sCR1和LacZ的混合腺病毒液(100 μl,1010噬斑形成单位);对照组(13只)注射LacZ腺病毒液(100 μl,1010噬斑形成单位).术后2周时利用超声心动图检查心功能,并于检查后立即取标本行病理检查.结果:术后2周时,各项超声指标实验组都明显优于对照组(P<0.05);尤其是反映梗死范围大小的梗死范围率,差异非常显著(P<0.01).病理检查见实验组动物心肌梗死区域小于对照组,H-E染色显示实验组注射sCR1腺病毒的范围内存活心肌细胞明显多于对照组.结论:缺血心肌再灌注前注射sCR1腺病毒可以明显减小梗死范围,提高远期心脏功能.     

奥美沙坦对肥胖大鼠肝脏甘油三酯代谢的影响

目的 观察血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂奥美沙坦对胰岛素抵抗的Zucker肥胖大鼠(ZF鼠)肝脏甘油三酯(TG)代谢的影响.方法 8周龄ZF鼠(22只)及其对照(ZL鼠,12只)分别给予含0.01%奥美沙坦饮用水治疗4周.结果 奥美沙坦在两组大鼠均明显降低了血压.ZF鼠的胰岛素敏感性指数[SI,(0.31±0.22)μU·ml-1·min-1·10-4vs(3.54±0.30)μu·ml-1·min-1·10-4,P＜0.01)]和葡萄糖效应[(SG,(1.35±0.51)min-1·10-2vs(3.40±0.14)min-1·10-2,P＜0.01)较ZL鼠明显减低,而血糖水平明显升高[(11.4±2.6)mmol/L vs(9.2±0.6)mmol/L,P＜0.01],奥美沙坦治疗后SI和SG明显改善.ZF鼠血TG浓度为ZL鼠的6倍,奥美沙坦治疗明显降低了ZF鼠的血游离脂肪酸水平[治疗前2.70±0.69 mmol/L vs治疗后(1.98±0.43)mmol/L,P＜0.01],但对血TG水平无明显影响(P＞0.05).奥美沙坦使ZF鼠肝甘油三酯分泌率(TGSR)下降了50%[(0.56±0.08)mg·min-1·100 g-1 vs(0.30±0.07)mg·min-1·100 g-1,P＜0.01].奥美沙坦治疗后(12.8±1.7)mg/g,肝脏甘油三酯含量比治疗前[(22.7±4.2)mg/g明显降低,P＜0.01)],而肝胆固醇含量不受影响.奥美沙坦治疗后ZF鼠肝细胞脂滴沉积明显得到改善.结论 奥美沙坦对肥胖大鼠肝脏甘油三酯的产生和积累有明显的抑制作用;这一作用不依赖于药物的降压效应.     

2型糖尿病大鼠心肌脂联素及其受体1的表达

目的 观察2型糖尿病大鼠心肌病变中心肌脂联素(adiponectin,APN)以及心肌脂联素受体1(adiponectin receptor 1,AdipoR1)的表达情况,探讨心肌APN、AdipoR1的表达与糖尿病心肌病变的关系.方法 23只雄性Wistar大鼠随机分为正常对照组(A组,n=10)和糖尿病组(B组,n=13).用高糖高脂饲料加小剂量链脲佐菌素建立2型糖尿病大鼠模型.喂养3个月后应用免疫组织化学方法测定心肌AdipoR1的表达.用酶联免疫吸附法检测血浆和心肌APN水平.通过颈动脉插管测等容舒张期左室内压力下降最大速率(-dp/dtmax)和等容收缩期左室内压上升的最大速率(+dp/dtmax).结果 与A组比较,B组糖尿病大鼠3个月时出现心脏重量/体重水平升高(P<0.05),等容舒张期左室内压降低,血浆和心肌APN水平以及心肌AdipoR1表达水平降低(P<0.05). 结论 2型糖尿病大鼠心肌APN及其AdipoR1表达水平的降低可能与糖尿病心脏肥大和心功能降低有关.     

Preliminary study on Herpes simplex virus type 1 infection of human oral epithelial cell in vitro

Objective： To explore the functions and mechanisms of herpes simplex virus type I（HSV-1） while infecting human oral epithelial cells in vitro（being similar to the infection in vivo）. Methods：An abundance of HSV-1 strains amplified in Vero cells were used to infect human oral epithelial cells. The culture supernatant was collected to infect Vero cells again. Morphology of HSV-1 was identified by inverted microscope and transmission electron microscope. Nucleic acid of the virus was detected by PCR. Results：The infected human oral epithelial cells didn＇ t display an obvious cytopathic effect（CPE） under inverted microscope（while Vero cells which were infected by the culture supernatant showed typical（CPE）. The virus particles were not observed in the cytoplasm nor in nucleus of human oral epithelial cells, however under transmission electron microscope in the cytoplasm of Vero cells, the nucleic acid of HSV-1 could be detected in infected human oral epithelial cells, by PCR. Conclusion-HSV-1 can successfully infect human oral epithelial cells. This model may provide a useful approach for studying the pathogenesis of herpes virus-associated periodontal disease.     

红细胞1型补体受体在系统性红斑狼疮患者中的表达及意义

目的通过检测红细胞1型补体受体(CR1)在系统性红斑狼疮(SLE)患者中的表达,探讨其临床意义。方法采用流式细胞术检测50例SLE患者和30例健康对照者红细胞CR1表达的水平,并对SLE患者病情活动程度行SLE疾病活动指数(SLEDAI)积分,分为活动期组与稳定期组,同时将活动期组红细胞CR1表达与稳定期组相比较;并分析SLE活动度指标与CR1表达的相关性。结果①SLE患者组红细胞CR1表达明显低于健康对照组,差异具有统计学意义(P<0.01)。②SLE患者活动期组红细胞CR1表达明显低于稳定期组,两组间CR1表达有显著性差异(P<0.01)。③SLE患者SLEDAI积分与CR1表达呈显著负相关(r=-0.971,P<0.01)。结论 SLE患者红细胞CR1表达的变化与疾病活动有明显的相关性,可以作为评判SLE病情活动的指标之一。     

Effects of angiotensin-converting enzyme inhibitors and angiotensin II type 1 receptor blockers on lymphangiogenesis of gastric cancer in a nude mouse model

Background Angiotensin-converting enzyme inhibitors （ACEI） and angiotensin II type 1 receptor blockers （ARB） can inhibit tumor growth by inhibition of angiogenesis. This study was designed to study the anticancer effects of ACEI and ARB on tumor growth and lymphangiogenesis in an implanted gastric cancer mouse model. Methods A model of gastric cancer was established by subcutaneously inoculating human gastric cancer cell line SGC-7901 into 60 nude mice. One week later, all mice were randomly divided into 5 groups. A control group received physiologic saline once daily for 21 days. Mice in the 4 treatment groups received one of the following agents by gavage once daily for 21 days： perindopril, 2 mg/kg; captopril, 5 mg/kg; Iosartan, 50 mg/kg; or valsartan, 40 mg/kg. Twenty-one days after treatment, all the mice were sacrificed and the tumors were removed. Tumor sections were processed, and immunohistochemical methods were used to observe the expressions of vascular endothelial growth factor C （VEGF-C）, matrix metalloproteinase 7 （MMP-7）, and lymphatic microvessel density （LMVD）.
Results Tumor volume was significantly inhibited in all ACEI and ARB groups, compared with the control group （all P 〈0,01）. LMVD in the ACEI and ARB groups was also significantly lower than that of the control group （all P 〈0.01）. In the ACEI groups, the expressions of VEGF-C and MMP-7 were both significantly decreased, compared with the control group （all P 〈0.05）. In the ARB groups, expression of VEGF-C was significantly decreased compared with the control group （all P 〈0.05）. However, no significant difference was found in the expression of MMP-7 between ARB groups and the control group.
Conclusion In a mouse model, ACEI and ARB might inhibit gastric cancer tumor growth by suppressing lymphangiogenesis.