六亚甲基二乙酰胺对K562细胞作用的实验研究

目的：研究六亚甲基二乙酰胺（HMBA）体外对K562细胞的抑制增殖、诱导凋亡和促进分化的作用。方法：MTT法检测不同浓度HMBA对于K562细胞的增殖抑制率;流式细胞仪（FCM）检测HMBA对于K562细胞周期分布的影响;Annexin V／PI染色方法检测HM—BA诱导K562细胞凋亡的作用;通过瑞氏染色、联苯胺染色和FCM检测分化抗原研究K562细胞分化情况。结果：HMBA可以抑制K562细胞增殖,1、2、3和4mmol／L对K562细胞增殖抑制率分别为21．97％、36．05％、41．56％和47．59％;HMBA可以阻滞K562细胞周期,主要表现为G0／G1期的阻滞;HMBA诱导K562细胞凋亡的作用不明显,4mmol／L的HMBA对K562细胞诱导凋亡率〈5％;HMBA处理后,瑞氏染色显示K562细胞有一定程度的成熟表现,联苯胺染色基本为阴性;K562细胞膜表面CD11b、CD14、CD68和胞质内溶茵酶抗原的表达在HMBA处理前后均为阴性。结论：HM—BA可以抑制K562细胞的增殖,提示具有一定的治疗作用;HMBA对K562的作用机制和阻滞细胞周期有关,诱导凋亡不是主要作用机制;HMBA有促进K562细胞分化的迹象,但分化方向和机制有待进一步研究。     

选择性环氧合酶-2抑制剂NS-398抑制多药耐药细胞株P-糖蛋白

目的：探讨选择性环氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）抑制剂NS-398对多药耐药细胞株K562／ADM细胞P-糖蛋白（P—glycoprotein，P—gP）表达的影响。方法：K562／ADM细胞经浓度分别为10μmol／L、20μmol／L、40μmol／L、80μmol／L、160μmol／L的NS-398处理，24h、48h、72h后用RT—PCR法检测MDRlmRNA的表达、用流式细胞仪检测mdr1蛋白表达。结果：随着Ns-398浓度的升高以及作用时间延长，MDR1 mRNA、P—gp表达降低，不同浓度的药物与测量时间之间存在着交互作用（P〈0．05）。结论：选择性环氧合酶-2抑制剂NS-398可抑制K562／ADM细胞的MDR1／P—gP表达。     

维生素E琥珀酸酯诱导耐药白血病K562／ADM细胞凋亡的研究

目的：研究维生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate，VES)对多药耐药白血病K562／ADM细胞的诱导凋亡作用及分子机制。方法：以体外培养的K562／ADM细胞为研究对象，采用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法检测细胞增殖活性，Wright-Giemsa染色、DNA凝胶电泳和流式细胞术(flow cytometry，FCM)检测细胞凋亡；FCM测定细胞Fas、Bcl-2和p53蛋白表达水平。结果：VES可显著抑制K562／ADM细胞的生长及增殖，P=0．004。光镜下可见K562/ADM细胞呈典型凋亡的形态学改变。DNA凝胶电泳显示典型的凋亡DNA梯形条带。FCM细胞周期分析显示，G1期阻滞，亚G1期细胞比例增高，P=0．005；Fas蛋白表达明显上调，P=0．002；Bcl-2蛋白表达下调，P=0．00～0；p53蛋白表达无明显变化。结论：VES可诱导K562/ADM细胞凋亡，作用机制可能与其上调Fas表达和下调Bcl-2表达有关。     

洛伐他汀对 HL-60、 KG-1、 K562白血病细胞体外作用的研究

目的：观察胆固醇合成抑制剂洛伐他汀（lovatatin,LOV)对HL－60、KG－1、K562白血病细胞增殖、凋亡的影响，并进一步探讨其作用机制。方法：首先利用MTT法、台盼蓝拒染法观察LOV对HL－60、KG－1、K562细胞增殖及活力的影响。再通过细胞形态观察，DNA凝胶电泳，流式细胞术分析，RT－PCR半定量测定bcl-2mRNA水平等技术，系统观察LOV对HL－60、KG－1、K562体外诱导凋亡的情况。结果：（1）LOV抑制HL－60、KG－1、K562细胞增殖，IC50分别为17．16、51．65、58．95μmol/L；(2)LOV诱导HL－60、KG－1、K562细胞凋亡，影响细胞周期进程，细胞阻滞于G1／S期；LOV在诱导HL－60细胞凋亡过程中随作用时间延长，bcl-2表达水平逐渐下降。结论：LOV抑制HL－60、KG－1、K562细胞增殖并诱导凋亡，阻滞细胞周期进程于G1／S期；bcl-2参与了LOV诱导凋亡的基因调控。     

三氧化二砷联合BSO对K562／ADM细胞P-糖蛋白的抑制作用研究

目的研究三氧化二砷（As2O3）联合γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制剂丁硫氨酸亚砜胺（BSO）对肿瘤多药耐药细胞K562／ADM细胞中P-糖蛋白（P—gP）的抑制作用，比较单用As2O3与两药联合的作用效果。方法As2O3组（0．5μmol／L，2．0μmol／L，5．0μmol／L）单独及联合100μmol／LBSO作用于K562／ADM细胞后，分光光度法检测K562／ADM细胞内谷胱甘肽（GSH）含量变化；流式细胞术（FCM）检测P-gp蛋白水平表达变化；反转录一聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测mdr-1 mRNA的表达变化。结果As2O3临床剂量组（0．5μmol／L，2μmol／L）联合BSO24h内即可抑制P-gp和mdr-1mRNA的表达水平，在48h后，临床剂量联合组抑制mdr-1mRNA的作用效果要明显强于单用高剂量组，在72h后，临床剂量联合组抑制P—gP的作用效果要明显强于单用高剂量组。结论临床剂量As2O3联合BSO可有效抑制K562／ADM细胞P—gp及mdr-1 mRNA的表达。     

ERK参与裸鼠体内辛伐他汀诱导K 562细胞凋亡的调控作用

目的：探讨辛伐他汀（simvastatin）作用于裸鼠体内K562细胞后Ras-MAPK信号转导通路胞外信号调节激酶（extracellular signal—regulated protein kinase，ERK）分子水平的变化，以说明ERK参与裸鼠体内辛伐他汀诱导K562细胞凋亡的调控作用。方法：体外培养慢性髓细胞白血病（CML）细胞株K562细胞，构建BALB／c-nu／nu裸鼠的K562细胞移植瘤模型。流式细胞术（FCM）检测对照组和两个辛伐他汀处理组的K562细胞周期变化，TUNEL法检测K562细胞晚期凋亡情况。采用RT-PCR检测K562细胞中Ras-MAPK信号通路N-Ras、ERK1mRNA的差异表达。免疫组织化学标记葡聚糖聚合物（labbled dextran polymer，LDP）法检测P-ERK蛋白水平变化。结果：辛伐他汀能够明显抑制裸鼠K562移植瘤组织的增长，随着辛伐他汀剂量的增加，K562细胞移植瘤体积和质量明显减小（P〈0．05，P〈0．01）。每次注射0．05mg的辛伐他汀能够诱导裸鼠体内K562细胞发生明显的G0／G1期停滞，不同剂量的辛伐他汀能够诱导K562细胞发生明显的凋亡，并随剂量的增加，凋亡率逐渐增高（P〈0．01）；不同剂量的辛伐他汀能够引起N-Ras、ERK1mRNA的表达下调（P〈0．01）。与对照组相比，两个处理组的p-ERK蛋白分别出现表达下调（P=0．01，P〈0．01）。结论：辛伐他汀在体内可能依赖Ras—MAPK信号转导通路ERK基因和蛋白水平的表达下调诱导K562细胞凋亡发生。     

二甲亚砜对K562/ADM耐药细胞株耐药性的逆转作用

目的：研究二甲亚砜对K562／ADM耐药细胞的逆转作用。方法：通过加入二甲亚砜后耐药细胞的生长情况，逆转倍数的计算，细胞内过氧化物染色的阳性程度以及电镜下观察耐药细胞诱导前后的变化。结果：二甲亚砜诱导K562／ADM耐药细胞前后生长情况有显著差异且逆转借故为4．0，Pox染色阳性程度明显递增，电镜下可观察诱导后K562／ADM耐药细胞有向成熟分化趋势。结论：二甲亚砜对逆转K562／ADM的耐药性是有益的。     

丝裂原活化蛋白激酶信号转导系统对Vp-16诱导分化作用的影响

目的：探讨丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）信号转导系统对依托泊苷（Vp-16）诱导K562细胞分化作用的影响。方法：采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定细胞增殖活性；流式细胞仪解析细胞周期；硝基四氮唑蓝（NBT）还原实验检测细胞向单核／巨噬系统分化。结果：0．1～0．8μg／mL的Vp-16抑制K562细胞增殖，引起细胞G2/M期阻滞，诱导细胞向单核／巨噬系统分化；细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinases，ERK）抑制剂PD98059降低Vp-16的诱导分化作用。P＜0．05；p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinases，p38 MAPK）抑制剂SB203580增强Vp-16的作用，P＜0．05；而C-JUN氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinascs，JNK）抑制剂SP600125对Vp-16的诱导分化作用无明显影响，P〉0．05。结论：在Vp-16诱导K562细胞向单核／巨噬系统分化过程中，ERK正向，p38MAPK负向调节Vp-16的诱导分化作用。     

三氧化二砷诱导K562/ADM细胞凋亡中mdr1和Survivin基因的表达

目的:探讨三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)诱导白血病多药耐药K562/ADM细胞凋亡过程中mdr1和Sur vivin基因的表达变化。方法:应用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖活性,细胞形态学、DNA片段化和细胞周期改变观察K562/ADM细胞凋亡;流式细胞术(FCM)测定Caspase3活性;RT PCR检测Sur vivin和mdr1mRNA的表达。结果:ATO可抑制K562/ADM细胞增殖,并出现典型凋亡形态改变,DNA电泳出现梯状条带(DNAladder);细胞周期分析显示,2～5μmol/LATO作用24h,细胞被阻滞在G2/M期,G1期细胞减少;72h时Sub G1期细胞分别为25.6%和52.9%。2～5μmol/LATO作用24～48h,mdr1mRNA和SurvivinmRNA表达水平明显下降,48h时mdr1mRNA的抑制率分别为83.4%和87.8%,SurvivinmRNA为21.6%和68.6%。ATO作用后,Caspase3活性明显增强,活化Caspase3由17.9%增加到47.4%。结论:ATO降低K562/ADM细胞mdr1和Survivin基因表达,解除P gp和Survivin对Caspases的抑制效应而促进耐药细胞凋亡。     

维生素E琥珀酸酯诱导耐药白血病K562/ADM细胞凋亡的研究

目的:研究维生素E 琥珀酸酯(vitamin E succinate , VES)对多药耐药白血病K562/ADM细胞的诱导凋亡作用及分子机制。方法: 以体外培养的K562/ADM细胞为研究对象,采用噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT) 比色法检测细胞增殖活性, Wright Giemsa染色、DNA凝胶电泳和流式细胞术(flowcytometry, FCM)检测细胞凋亡;FCM测定细胞Fas、Bcl-2 和p53 蛋白表达水平。结果:VES可显著抑制K562/ADM细胞的生长及增殖,P= 0 .004。光镜下可见K562/ADM细胞呈典型凋亡的形态学改变。DNA凝胶电泳显示典型的凋亡DNA梯形条带。FCM细胞周期分析显示,G1 期阻滞,亚G1 期细胞比例增高,P=0 .005;Fas蛋白表达明显上调,P=0. 002;Bcl -2蛋白表达下调,P=0. 000;p53蛋白表达无明显变化。结论:VES可诱导K562/ADM细胞凋亡,作用机制可能与其上调Fas表达和下调Bcl 2表达有关。     

K562／Adm多药耐药细胞株生物学特性的进一步研究

采用流式细胞仪及逆转录－多聚酶链式反应技术对所建立的Ｋ５６２／Ａｄｍ细胞株生物学特性进一步研究。结果表明该耐药细胞对化疗药物的摄取能力明显降低，细胞跨膜糖蛋白Ｐ－１７０及编码该蛋白的ｍｄｒ－１ｍＲＮＡ具有过度表达。细胞酶学研究发现耐药细胞Ｇ６ＰＤ及６ＰＧＤ活性明显升高，尤以Ｇ６ＰＤ为著。该细胞为多药耐药性及其相关机制的研究提供一良好模型。     

槲皮素恢复柔红霉素在白血病耐药细胞K562/ADM和HL-60/ADM中的分布

背景与目的：槲皮素是一种天然黄酮类中药成分,儿有多种生理活性,最近发现其有逆转白血病细胞耐药的作用,本研究旨在探讨槲皮素恢复柔红霉素在白血病耐药细胞的分布从而达到逆转耐药的机制：方法：通过MTT体外药敏法检测槲皮素对柔红霉素的增敏作用并确定逆转的浓度范围,作用于K562／ADM、HL-60／ADM细胞及相应敏感株K562和HL-60,借助激光共聚焦显微镜观察槲皮素怍用前后柔红霉素在亚细胞水平的分布变化：结果：20～40μmol／L槲皮素在体外能日月显提高柔红霉素对K562／ADM和HL-60／ADM的敏感性,恢复柔红霉素在亚细胞水平的分布,使其回归细胞核内,从而逆转多药耐药。结论：黄酬类中药槲皮素能够成为蒽环类药物治疗白血病中有效的化疗增敏剂。     

川芎嗪联合三氧化二砷逆转K562/ADM细胞多药耐药的实验研究

目的探讨川芎嗪与三氧化二砷联合逆转耐药人红白血病细胞株K562/ADM多药耐药的效果。方法采用WST-8法测定细胞的药敏性及抗药性逆转,应用流式细胞术检测细胞凋亡、细胞内ADM浓度、P-gp蛋白的表达,采用免疫细胞化学二步法检测细胞GST-π表达。结果非细胞毒性浓度的TMP（20μg/ml）及As2O3（0.5μmol/L）可降低ADM对K562/ADM细胞的IC50（P〈0.05）,2种药物联合应用对ADM的逆转倍数明显高于两者单独应用（P〈0.05）,而且也高于两者单独应用之和;两者以非细胞毒性浓度联合应用提高K562/ADM细胞内ADM浓度和细胞凋亡百分率,作用大于两药单独应用,并且明显下调细胞P-gp和GST-π表达（P〈0.05,P〈0.01）。结论非细胞毒性剂量的TMP和As2O3,均可部分逆转有多药耐药表型的细胞株K562/ADM对阿霉素的耐药性,两者联合应用效果优于单独应用,具有协同作用,其机制可能与下调P-gp和GST-π表达有关。     

环孢霉素A逆转白血病耐药细胞系K562／VCR耐药性的研究

为寻找克服Ｐ－糖蛋白介导肿瘤多药耐药的途径。选择环孢霉素Ａ（ＣｓＡ）作为耐药逆转剂,分别采用台盼蓝拒染法、ＭＴＴ法和免疫组化法分析ＣｓＡ对人白血病细胞株的毒性及逆转效果,观察ＣｓＡ及长春新碱（ＶＣＲ）对Ｋ－５６２／ＶＣＲ生长的抑制作用及检测Ｋ５６２／ＶＣＲ细胞膜Ｐ－ｇｐ的表达情况,结果显示,ＣｓＡ在非毒性剂量浓度４μｇ／ｍｌ以下能逆转细胞耐药,与ＶＣＲ合用能抑制Ｋ５６２／ＶＣＲ生长;Ｋ５６２／ＶＣ     

Experimental Study on the Mechanism of Reversal of Leukemia Multidrug Resistance by Proteasome Inhibitor Bortezomib

OBJECTIVE In this study, we applied multidrug resistant leukemia cell line expressing mdr1-mRNA to observe changes in mdr1-mRNA, the P-gp, cell cycle and apoptosis before and after bortezomib was used, in order to explore the mechanism of reversal of leukemia multidrug resistance by the proteasome inhibitor bortezomib.METHODS Flow cytometry (FCM) was used to detect the intracellular drug concentration, expression of P-gp, cell apoptosis and cell cycle status of K562/DNR cells before and a er treatment with different concentrations of bortezomib. Fluorescence quantitative PCR was applied to detect the mdr1-mRNA expression in K562/DNR and K562/S cells.RESULTS Bortezomib could increase the intracellular DNR content in K562/DNR cells, but showed no e. ect in K562/S cells.5-100 nmol/L bortezomib could significantly reduce the P-gp/mdr1-mRNA expression in K562/DNR cells in vitro, and showed a dose-dependent effect. There was a statistically significant di. erence (P < 0.05) between di. erent concentration groups and the control group. P-gp/mdr1-mRNA expression was negatively correlated with cell apoptosis (r = -0.912 and P < 0.01). After treatment with different concentrations of bortezomib for 24 h,K562/DNR cells in G2 + M phases were significantly increased,while cells in G0 + G1 phases and S phase were significantly decreased, accompanied by an increased apoptotic rate.CONCLUSION Bortezomib can induce G0 + G1 phase to G2 + M phase, and thereby enhance the chemosensitivity of leukemia, and may also reverse the multidrug resistance in leukemia mediated by P-gp overexpression encoded by mdr1 gene. This confi rms that bortezomib can reverse leukemia multidrug resistance at the levels of nucleic acid and protein molecules.     

NF-κB信号通路的激活对白血病细胞K562／A02多药耐药的影响

 目的　研究K562细胞株及其耐药细胞株K562／A02 NF-κB活性的差异性表达,探讨白血病多药耐药（MDR）发病机制。方法　用MTT法检测K562／A02的耐药倍数,观察细胞生长的形态学变化,PI单染法检测K562／S、K562／A02细胞周期分布,并用RT-PCR 方法检测mRNA的表达、流式细胞仪检测P糖蛋白（P-gp）表达及其功能,Western blotting方法检测细胞核NF-κB p65表达,比较K562与K562／A02白血病耐药细胞株之间的差异性。结果　与K562细胞不同,耐药细胞株K562／A02细胞生长特性发生改变,呈半贴壁生长,与K562／S细胞相比,K562／A02细胞的 G0／G1期、S期比例增高,G2／M期细胞比例减低,差异有统计学意义（P＜0.05）,凋亡细胞比例差异无统计学意义（P＞0.05）,且检测到mdr1 mRNA及细胞膜P-gp表达增高以及细胞核内NF-κB p65表达明显增加。结论　NF-κB信号通路的激活即NF-κB p65细胞核内转位可能参与了白血病MDR的形成。     

硫化砷对K_(562)/ADM细胞HSP70蛋白表达的影响

目的 :探讨硫化砷 (As2 S2 )对K5 6 2 及其耐药细胞株K5 6 2 ADM细胞膜HSP70蛋白表达的影响。方法 :采用流式细胞仪 (FCM)测定K5 6 2 和耐药细胞K5 6 2 ADM细胞膜HSP70蛋白表达及细胞凋亡 ,利用RT PCR方法检测HSP70的mRNA水平。结果 :硫化砷能增加细胞膜HSP70蛋白表达 ,且与时间及浓度成正相关 ,而在mRNA水平上仍有较高的表达。K5 6 2 ADM细胞膜HSP70蛋白表达和细胞凋亡率均高于K5 6 2 细胞。结论 :硫化砷能增加细胞膜HSP70蛋白表达 ,且这种改变可能对细胞凋亡率产生一定影响