弓形虫表面抗原SAG1基因的克隆表达、纯化与鉴定

目的：构建弓形虫SAG1基因原核表达质粒,诱导表达重组蛋白SAG1,分离纯化并检测其免疫反应性。方法：设计一对特异引物,体外扩增SAG1目的基因（双酶切纯化后）定向克隆至质粒pET29a（＋）中,转化到大肠埃希菌（Escherichia coli）BL21,采用PCR、双酶切和测序等方法鉴定,并以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析重组蛋白的表达情况,经镍离子柱纯化重组蛋白后,用蛋白质印迹（Western blotting）分析与小鼠弓形虫阳性血清的免疫反应性。结果：重组质粒经PCR、双酶切反应和测序鉴定,产物的大小与结构均与预期值相符,经IPTG诱导后,稳定表达相对分子量（Mr）为28950的蛋白,纯化后的重组蛋白经Western blotting分析显示,与小鼠弓形虫感染血清有特异性反应条带。结论：成功构建重组表达质粒pET29a（＋）-SAG1,使弓形虫表面抗原SAG1在体外获得表达,分离纯化的SAG1重组蛋白有免疫反应性。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）基因真核表达重组质粒，方法 根据ROP2基因已知序列，设计合成一对引物，上，下游引物分别引入EcoRI,SalI酶切位点，用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段，插入pGEX-4T-1质粒，构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2，而后经EcoRI,NotI双酶切除ROP2基因片段，再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果 ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp，重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子，克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2。为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的　构建弓形虫棒状体蛋白2（POP2）基因真核表达重组质粒。方法　根据ROP2基因已知序列,设计合成一对引物,上、下游引物分别引入EcoRI、SalI酶切位点,用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段,插入pGEX-4T-1质粒,构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2,而后经EcoR　I、Not　I双酶切出ROP2基因片段,再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果　ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp,重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子,克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论　在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2,为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

TIZ基因全长扩增和携带其基因的真核表达载体的构建

目的:TIZ基因全长扩增并构建携带其基因的真核表达载体,为进一步的TIZ基因在卵巢上皮癌生物学作用研究奠定基础.方法:采用PCR和DNA测序法扩增卵巢癌组织中TIZ全长基因;利用pcDNA3.1/myc-his(-)C质粒构建pcDNA3.1/myc-his(-)C-TIZ重组质粒;采用AMP(+) LB培养筛选阳性重组质粒克隆;采用PCR、双酶切以及质粒DNA测序以确定pcDNA3.1/myc-his(-)C-TIZ重组质粒的构建成功.结果:(1)从卵巢上皮癌组织中扩增出1 707bp大小片段,经测序和NCBI上与TIZ基因序列进行BLAST比对分析证实为TIZ基因全长.(2)所构建的pcDNA3.1/myc-his(-)C-TIZ重组质粒经PCR、双酶切以及质粒DNA测序确定pcDNA3.1/myc-his(-)C-TIZ(+)重组质粒构建成功.结论:成功扩增了TIZ基因全长并构建pcDNA3.1/myc-his(-)C-TIZ(+)重组质粒,为进一步的探讨TIZ基因在卵巢上皮癌生物学作用奠定了基础.     

幽门螺杆菌尿素通道蛋白ureI基因真核表达载体的构建及表达

目的构建幽门螺杆菌(H.pylori)尿素通道蛋白编码基因(ureI)的真核表达重组载体,并在HeLa细胞中表达,为核酸疫苗的研制奠定基础。方法以H.pyloriSS1株基因组为模板,PCR扩增ureI目的基因片段,定向插入真核表达载体pcDNA3.1(+)多克隆酶切位点中,构建重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;通过酶切、PCR及测序鉴定,筛选阳性重组载体;脂质体法转染重组质粒入HeLa细胞,Western blot检测其在HeLa细胞中的表达。结果以H.pyloriSS1株基因组DNA为模板扩增出特异的ureI基因片段,大小约585 bp;双酶切及测序鉴定证明成功构建了H.pylori真核表达重组载体pcDNA3.1(+)/ureI;该重组质粒能够在HeLa细胞中表达目的蛋白。结论成功构建了真核重组载体pcDNA3.1(+)/ureI,并能在HeLa细胞中表达。     

弓形虫复合基因SAG1-BAG1的构建、表达及重组抗原的免疫反应性分析

目的构建并表达弓形虫复合基因SAG1-BAG1及分析重组抗原的免疫反应性。方法利用PCR扩增弓形虫SAG1基因,利用RT-PCR扩增弓形虫BAG1基因,通过酶切连接分别将SAG1、BAG1基因克隆到pET28a表达载体中构建复合基因SAG1-BAG1。将质粒pET28a-SAG1-BAG1转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,Western-blot分析该重组蛋白的免疫反应性。结果复合基因SAG1-BAG1全长约1 407 bp,重组蛋白相对分子质量约为50 000,表达量约占菌体总蛋白的10%,Western-blot分析显示重组蛋白具有良好的免疫反应性。结论成功构建并表达弓形虫复合基因SAG1-BAG1。     

结核分支杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6基因真核表达重组质粒的构建及鉴定

目的 :构建结核分支杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6真核表达重组质粒。方法 :以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板 ,用PCR法对ESAT - 6基因进行扩增 ,PCR反应产物经酶切后 ,克隆于真核表达载体pcDNA3.1( )上。结果 :构建了结核杆菌基因ESAT - 6真核表达重组质粒pcDNA3.1( ) -ESAT - 6 ,测序报告ESAT - 6基因已正向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( )上。结论 :结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT - 6真核表达重组质粒的成功构建为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下了基础。     

弓形虫SAG1基因在大肠杆菌中的高效表达及重组抗原对弓形虫感染的检测

目的 在原核系统中高效表达弓形虫表面抗原SAG1并利用重组抗原检测弓形虫感染。方法 将截短的SAG1基因经PCR扩增后,定向亚克隆入原核表达载体pET-30a( ),酶切鉴定出阳性重组子并经序列测定证实读码框正确,将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,以IPTG诱导表达,对融合的表达产物进行纯化和复性,通过免疫印迹和ELISA实验检测其特异的免疫反应性。结果 成功构建截短型SAG1在原核系统中的重组表达质粒,并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中得到了高效表达,其表达量占细菌裂解液中总蛋白量的31．58％。经过简易的纯化和复性过程,该重组抗原（rSAG1）能被弓形虫感染的人血清所识别。用rSAG1构建的ELISA试剂盒对弓形虫病的检测具有高度的敏感性和特异性。结论 截短型SAG1在大肠杆菌中得到了高效表达,重组抗原经纯化和复性后,能有效检测弓形虫的感染,可用于构建弓形虫病检测试剂盒。     

结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6基因测序质粒及真核表达重组质粒的构建

目的 构建结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT—6基因测序质粒及真核表达重组质粒，为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测打下基础。方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，用PCR法对基因ESAT—6进行扩增，将扩增的产物连接于测序载体pUCm—T上，经测序反应确定无误，再将PCR反应产物经酶切后，克隆于真核表达载体pcDNA3．1( )上。结果 构建了结核杆菌基因ESAT—6的重组测序质粒，并对其进行了测序。真核表达重组质粒pcDNA3．1( )—ESAT—6亦构建成功。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT—6真核表达重组质粒的成功构建为结核病的诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及相应抗原、抗体的制备打下基础。     

沙眼衣原体ompA真核表达重组体的构建及鉴定

目的 扩增D型沙眼衣原体ompA基因，构建真核表达重组质粒，为核酸疫苗的研制做准备。方法 用PCR技术从D型Ct基因组DNA中扩增ompA基因片段，重组入pUCm—T克隆载体。将pUCm—T／ompA中的ompA外源基因片段经酶切、连接等反应，亚克隆入pcDNA3．1( )真核表达载体，再经含氨苄青霉素的LB培养基筛选，酶切、PCR扩增及测序鉴定。结果 从D型ct基因组DNA中扩增出特异的ompA基因片段，筛选出pUCm—T／ompA；经亚克隆，筛选鉴定出pcDNA3．1( )／ompA重组质粒。结论 成功地构建了pUCm—T／ompA重组质粒和pcLDNA3．1( )／ompA重组质粒，为Ct核酸疫苗的研制提供实验基础。     

Survivin基因真核表达载体的构建及鉴定

  目地 构建pcDNA3.1-Survivin基因的真核表达载体并鉴定。方法 提取大鼠肝细胞总RNA,RT-PCR 法扩增Survivin cDNA 片段, 双酶切构建pcDNA3.1-Survivin, 重组载体。结果 重组真核表达载体经PCR、酶切鉴定及测序证实正确。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3.1-Survivin。     

HGFK1基因真核表达载体的构建及鉴定研究

目的构建携带人HGFK1基因的真核表达载体pcDNA3.1（-）-HGFK1。方法通过PCR方法从已经构建好的病毒穿梭载体中扩增出HGFK1基因,构建pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表达载体,经PCR、酶切、测序、蛋白表达等方法进行鉴定。结果PCR、酶切、测序以及蛋白表达证实pcDNA3.1（-）-HGFK1载体序列正确。结论本研究成功构建了pcDNA3.1（-）-HGFK1真核表达载体,可为后续进行肝癌细胞的生物学研究提供帮助。     

乙肝病毒核心抗原强制泛素化DNA疫苗的构建

目的 构建乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)强制泛素(Ub)化的DNA疫苗表达质粒.方法 以BALB/c小鼠肝脏mRNA为模板,RT-PCR扩增Ub单体基因片段,并将其羧基端第76位氨基酸突变为丙氨酸;以HBV pADR为模板,PCR扩增HBcAg基因片段,并根据N末端法则将其第1位氨基酸突变为精氨酸;利用重组PCR技术拼接Ub-HBcAg融合基因,纯化后连接pUCm-T载体,酶切鉴定正确后将Ub-HBcAg片段插入真核表达质粒pcDNA3.1(-),构建重组真核表达质粒Ub-HBcAg-pcDNA3.1(-),并行酶切鉴定和基因测序.结果 构建的HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗经基因测序证实目的 基因插入方向正确,突变与预期相符;其余基因序列与GenBank发布序列完全一致.结论 成功构建了HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗.     

乙肝病毒核心抗原强制泛素化DNA疫苗的构建

目的构建乙型肝炎病毒核心抗原（HBcAg）强制泛素（Ub）化的DNA疫苗表达质粒。方法以BALB/c小鼠肝脏mRNA为模板,RT-PCR扩增Ub单体基因片段,并将其羧基端第76位氨基酸突变为丙氨酸;以HBVpADR为模板,PCR扩增HBcAg基因片段,并根据N末端法则将其第1位氨基酸突变为精氨酸;利用重组PCR技术拼接Ub-HBcAg融合基因,纯化后连接pUCm-T载体,酶切鉴定正确后将Ub-HBcAg片段插入真核表达质粒pcDNA3.1（-）,构建重组真核表达质粒Ub-HBcAg-pcDNA3.1（-）,并行酶切鉴定和基因测序。结果构建的HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗经基因测序证实目的基因插入方向正确,突变与预期相符;其余基因序列与GenBank发布序列完全一致。结论成功构建了HBcAg强制Ub化融合基因DNA疫苗。     

人MCHR1真核表达载体的构建

目的 构建人MCHR1真核表达载体.方法 采用PCR方法,以人胎脑cDNA文库为模板扩增人MCHR1基因的全长cDNA编码区序列,利用DNA重组技术将其定向插入到真核表达载体pcDNA3.1( ),酶切和测序鉴定.结果 酶切和测序鉴定正确,表明pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体构建成功.结论 pcDNA3.1( )/MCHR1真核表达载体成功构建,为进一步研究MCHR1的功能提供了良好的实验基础.     

人MT1-MMP真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达及意义

目的：克隆人膜型基质金属蛋白酶1（MT1-MMP）基因,构建真核表达载体,并检测其在人肝癌细胞HepG2中的表达。方法：采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从人正常肝组织中扩增MT1-MMP全长cDNA,将之与pMD18-T载体连接,测序后将该片段亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1中。将构建好的pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体经酶切鉴定后,采用脂质体法转染入HepG2细胞,经G418筛选,得到阳性克隆细胞株。应用RT-PCR检测转染前后该细胞株MT1-MMP mRNA表达水平。结果：①RT-PCR获得长度约为704 bp的目的片段,与预期片段相符;②将pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定,得到约5 400 bp和704 bp两个片段,测序结果证实所插入目的片段与GenBank中MT1-MMP cDNA序列匹配;③重组质粒转染株MT1-MMP mRNA表达水平（1.66±0.43）明显高于空质粒组（1.21±0.25）和对照组（1.19±0.18)(P<0.01）。结论：成功构建pcDNA3.1/MT1-MMP真核表达载体,并在人肝癌细胞株HepG2中稳定表达。     

日本血吸虫Rho GTPase DNA疫苗及亚单位疫苗的构建和分析

目的 构建日本血吸虫大陆株Sj-Rho GTPase-like真核及原核表达重组质粒，并进行鉴定分析。方法 用PCR法将Sj-Rho GTPase-like基因从已剪切阳性克隆中扩增出来，亚克隆至pcDNA3.1和pGEX-5X-3中，分别经PCR、双酶切、测序、SDS-PAGE和Western blot等方法鉴定。结果 PCR和测序均证明Sj-Rho GTPase-like基因疫苗构建成功，重组蛋白经SDS-PAGE电泳可观察到与预期分子量相应的条带，转印后可被水牛感染血清识别。结论 成功构建了Sj-Rho GTPase-like基因的两种重组载体，为保护性免疫研究打下基础。     

人巨细胞病毒IE1真核表达载体的构建与表达

目的构建人巨细胞病毒（HCMV）IEl真核表达载体，观察其在真核细胞内的表达，为HC—MVIEl核酸疫苗的相关研究奠定基础。方法将质粒pNEBl93-IEl用Sal I、BamH I双酶切与载体pEGFP—C1连接构建重组载体pEGFP—C1-IEl；双酶切鉴定后，取重组载体pEGFP—C1-IEl用EcoR I 、Hind Ⅲ／双酶切与载体pcDNA3．1（-）连接构建重组质粒pcDNA3．I（-）-IEl，双酶切和测序鉴定；将重组质粒pcDNA3．1（-）-IEl转染HeLa细胞，RT—PCR检测IElmRNA的表达。结果重组载体pEGFP—C1-IEl和pcDNA3．1（-）-IEl双酶切后均可切出约1476bp目的片段；重组载体pcDNA3．1（-）-IEI测序结果登录C,enBank，作BLAST分析，含有1476bp目的基因片段，无碱基错配和移码突变，与读码框完全-致；转染重组载体pcDNA3．1（-）-IEl的细胞中可扩增出约1476bp的目的条带。结论成功地构建了真核表达载体pcDNA3．1（-）-IEl，且其能在真核细胞内袁达。     

14-3-3基因真核表达载体的构建

目的克隆人14-3-3基因并构建真核表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3。方法从胎脑组织中提取总RNA,用RT-PCR方法获得人14-3-3基因的全长cDNA,将其插入pCUm-T载体中;序列测定后,重组携带14-3-3基因的表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3。结果经限制性内切酶酶切分析、PCR和DNA序列测定证实目的基因已插入重组质粒。结论成功构建了14-3-3真核表达载体pcDNA3.1（＋）-14-3-3,为进一步研究14-3-3在帕金森病中的作用奠定了良好的基础。