幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位融合蛋白表达的研究

目的：获得大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（LTB）与幽门螺杆菌保护性抗原热休克蛋白A亚单位（HspA）的融合蛋白。方法：PCR扩增ltB和hspA基因，依次构建至表达载体pIM-1，转化大肠杆菌，SDS-PAGE、免疫印迹分析目的蛋白表达情况。采用GM1ELISA和D( )-半乳糖亲和层析方法检测重组LTB-HspA融合蛋白LTB组分与GM1神经节苷脂结合活性。结果：重组LTB-HspA融合蛋白表达量最高可达细菌总蛋白的25％。免疫印迹检测结果证实为重组LTB-HspA融合蛋白。GM1ELISA和D( )-半乳糖亲和层析方法检测结果证实重组LTB-HspA融合蛋白具有与GM1神经节苷脂结合的活性。结论：LTB-HspA融合蛋白的表达研究，为研制幽门螺杆菌分子内佐剂疫苗打下了基础。     

幽门螺杆菌HpaA-CtxB融合蛋白的表达及其免疫原性研究

目的 :探讨幽门螺杆菌融合蛋白粘附素 霍乱毒素B亚单位 (HpaA CtxB ,HCTB)经口服免疫小鼠后 ,机体产生的免疫应答。方法 :用PCR方法扩增HpaA和CtxB两个目的基因片段 ,将它们分别克隆至pET 32a( )和pQE 30质粒上 ,然后同时插入pQE 30表达载体中 ,构建含双基因的的表达质粒pQE HCTB ,转化E .coliDH5α,经IPTG诱导表达融合蛋白HCTB ;West ernblot分析其免疫反应性。融合蛋白经镍离子柱纯化后 ,HCTB和HpaA分别给小鼠灌胃进行免疫 ,ELISPOT和ELISA分别检测小鼠胃粘膜、派伊尔小结 (Peyer′spatches ,PP)抗原特异性抗体分泌细胞 (ASC) ,和血清IgG、IgA、小肠粘液sIgA和粪便sIgA。结果 :经测序HCTB融合基因片段由 116 1bp组成 ,为编码 387个氨基酸残基的多肽。经SDS PAGE分析相对分子量 (Mr)约为4 0 0 0 0。可溶性表达占全菌的 2 5 %以上 ,经亲和层析后可获得纯度为 92 %以上的重组蛋白。Westernblot分析其能分别与HpaA抗血清和CT抗血清特异性反应。灌胃免疫小鼠后ELISPOT和ELISA检测结果 ,胃和PPsIgA ASC、IgG ASC数量明显增加 ,尤以sIgA ASC为甚 ,同时血清IgA、IgG ,粪sIgA ,肠粘液sIgA也明显高于HpaA组和对照组 (P <0 0 5和P <0 0 1)。结论 :融合蛋白HCTB经口服免疫可有效诱导粘膜免疫应答 ,产生高水平     

幽门螺杆菌napA-ctxB融合蛋白的基因克隆与表达

目的 克隆、表达幽门螺杆菌中性粒细胞激活蛋白napA与霍乱毒素B亚单位ctxB融合基因napA-ctxB(nctB),为制备预防H.pylori感染的疫苗奠定基础.方法 用PCR方法扩增ctxB目的基因片段,克隆至pQE30-napA质粒的napA基因上游,构建含双基因的表达质粒pQE30-napA-ctxB(pQE30-nctB),经测序分析确认后转化E.coli DH5α,经IPTG诱导表达融合蛋白NCTB,融合蛋白NCTB经镍离子柱纯化.结果 PCR扩增出807 bp的目的基因片段nctB.工程菌pQE30-nctB-DH5α经IPTG诱导后,SDS-PAGE显示有新生的蛋白表达条带,Mr为30 000,与预期的一致,约占菌体总蛋白的27%,重组蛋白用Ni2 -NTA 树脂提纯,纯化后的蛋白质经SDS-PAGE分析可见单一条带,图象软件分析表明纯度可达94%以上.Western blot 显示重组蛋白质有良好的抗原性.结论 构建含双基因的表达质粒pQE30-nctB成功,并在大肠杆菌DH5α中高效的表达.     

幽门螺杆菌cagA蛋白的制备级复性和纯化

目的通过优化复性液的组成、pH值、稀释度等,建立幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A(cytotoxin associated gene A,cagA)表达产物的制备级复性及纯化方法。方法以包涵体形式存在的cagA表达产物先用5mL/LTritonX-100进行初步纯化,使其纯度达到约90%;再用含8mol/L脲的变性剂溶解包涵体,用复性液[0.1mol/LTris-HCl、2mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、0.1mmol/L氧化型谷胱甘肽(GSSG)、8mmol/L还原型谷胱甘肽(GSH)及50mmol/L精氨酸(Arg),pH8.0]稀释复性后,用DEAE-HP阴离子交换色谱进行纯化。结果用稀释法复性及液相色谱法纯化,一次可得到100~140mg的cagA。ELISA检测其抗原活性为1∶16000;SDS-PAGE检测纯度为98%。结论用制备级复性、纯化制备的cagA,可作为抗原用于制备检测抗幽门螺杆菌抗体的检测芯片,效果良好,并已获得国家新药批文。     

人幽门螺杆菌热休克蛋白A亚单位的基因克隆及序列分析

目的 获取人幽门螺杆菌（Ｈｐ）热休克蛋白Ａ亚单位（ＨｓｐＡ）的ＤＮＡ（ｈｓｐＡ）,并将它克隆到质粒ＰｉｎＰｏｉｎｔ＾ＴＭ Ｘａ－３中进行核苷酸序列分析。方法 利用ＰＣＲ技术扩增ＨｓｐＡ,并将其它向插入ＰｉｎＰｏｉｎｔ＾ＴＭ Ｘａ－３载体中通过４种荧光染料标记,激光检测的方法进行核苷酸序列分析。结果 ＤＮＡ序列分析表明,所克隆的ＨａｐＡ ＤＮＡ序列与ＧｅｎＢａｎｋ公布的一致。结论 本研究获得了序列正     

幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白A的分离纯化

在对Ｈｐ毒力因子进行的研究中 ,发现ＣａｇＡ基因是Ｈｐ高毒力株的标志基因。其编码产物 细胞毒素相关蛋白Ａ(ＣａｇＡ)是引起人类严重胃部疾患的主要因素之一 ,ＣａｇＡ基因并不存在于所有的Ｈｐ菌株中 ,在中国人中约有 90 %感染者含有此基因。该基因已被克隆和测序 ,含有ＣａｇＡ基因与不含ＣａｇＡ基因的菌株在致病能力上存在显著的差异。目前一致认为含ＣａｇＡ基因的Ｈｐ菌株为高毒株 ,与消化性溃疡 ,萎缩性胃炎及胃癌的发生密切相关。ＣａｇＡ蛋白位于细胞表面 ,是一种亲水性免疫显性蛋白 ,可刺激患者机体产生相应的ＩｇＧ和ＩｇＡ抗…     

幽门螺杆菌HspA-CtxB口服疫苗的研制及免疫原性研究

目的　观察幽门螺杆菌融合蛋白质热休克蛋白A 霍乱毒素B(HspA CtxB ,HCT)经口服免疫在小鼠小肠内的吸收情况及免疫后机体产生的免疫应答。方法　用PCR方法扩增hspA和ctxB 2个目的基因片段 ,将它们分别克隆至pSK(+)质粒上 ,然后插入含T7启动子pET 2 2b(+)的表达载体中 ,构建含双基因的表达质粒pET hct,转化E .coliBL2 1(DE3) ,经IPTG诱导表达融合蛋白质HCT ;融合蛋白质经镍离子柱纯化、复性后 ,与HspA重组蛋白质共同标记同位素1 2 5I,经小鼠灌胃实验观察其在小鼠小肠内的吸收情况 ;HCT和HspA分别给小鼠灌胃进行免疫 ,每周灌胃 2次 ,共 8次 ,末次免疫后 3d起收集小鼠粪便 ,次日眶后静脉采集静脉血 ,分别对标本进行IgG和IgA检测。结果　经测序 ,HspA CtxB(HCT)融合基因片段由 72 6bp组成 ,为编码 2 42个氨基酸残基的多肽。经SDS PAGE和免疫印迹分析检测发现 ,融合基因表达的蛋白质相对分子质量 (M) r 约为 30× 10 3 。标记同位素1 2 5I的HCT和HspA ,经小鼠灌胃实验观察不同时间段的吸收情况 ,结果发现在 10～ 15min时间段 ,HCT组出现吸收峰值 ,约为对照组的 8倍以上 (P <0 .0 0 1) ,且吸收峰值时间明显提前 ;将HCT口服免疫小鼠 ,检测小鼠血清和粪便中的特异性抗体水平。结果HCT组 (A40 5) ,血清IgA ,2 .98     

幽门螺杆菌Catalase基因的克隆、表达及其抗原性鉴定

目的：构建含人幽门螺杆菌（Hpylori，Hp）过氧化氢酶（catalase，KatA）编码基因的重组质粒，测定、分析其核酸序列，并在E.coli中表达，研究其抗原性。方法：应用PCR技术从HpDNA染色体中扩增KatA编码基因片段，将其T-A克隆和测序，并与GenBank公布的其他Hp菌株的基因序列比较，再将目的基因插入至融合表达载体pGEX-4T-1中进行表达，用GST亲和层析对其进行纯化。纯化产物用于对29株小鼠抗Hp-全菌单克隆抗体（mAb）的鉴定及与Hp啊感染患者血清进行Western blot。结果：KatA基因全长为1 515 bp，并在GenBank上登录（No．DQ333889），与GenBank公布的其他Hp菌株的核酸的同源性为96％～97％，表达的KatA融合蛋白的相对分子质量（Mr）为85 000，29株小鼠抗Hp全菌mAb中有4株mAb是针对KatA的，表达产物可被Hp感染患者的血清特异性识别。结论：重组KatA具有较好的抗原性，为坳检测试剂和疫苗的研究奠定了基础。     

中国人幽门螺杆菌尿素酶B亚单位的基因克隆及序列分析

目的 克隆人幽门螺杆菌（ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ,Ｈｐ）尿素酶Ｂ基因（ｕｒｅＢ）,并分析其核苷酸序列的特性。方法 用ＰＣＲ技术从临床分离的Ｈｐ菌株基因组中扩增出ｕｒｅＢ基因,将其克隆至ｐＨＰ质粒上进行序列分析。结果 克隆得到的ｕｒｅＢ基因长度为１７１３ｂｐ,其核苷酸序列与ＧｅｎＢａｎｋ公布的序列有６１个碱基存在差异,同源为９６４４％,推定的氨基酸序列同源性为９９．６５％。结论：我们所     

幽门螺杆菌napA基因的克隆、表达及免疫反应性分析

目的构建高效表达幽门螺杆菌(Hp)中性粒细胞激活蛋白(NAP)的原核表达系统,为Hp候选疫苗研制打下基础。方法从Hp标准株NCTC11639染色体DNA中扩增napA基因片段,T-A克隆后测序,与GenBank公布的其他Hp菌株的napA基因序列进行比较。目的基因片段酶切后,与表达载体连接,转化至宿主菌,构建napA基因原核表达系统pGEX-4T-1-napA-E.coliTop10。优化诱导表达条件,采用SDS-PAGE鉴定表达产物,GST亲和层析纯化收集重组NAP蛋白,Western blot法鉴定重组NAP的免疫性;采用ELASA法检测胃癌患者Hp阳性血清中抗NAP抗体效价,通过间接ELASA法从29株小鼠抗Hp全菌单克隆抗体(mAb)中筛选抗Hp-NAPmAb。结果所克隆的napA基因全长为435bp,在GenBank上登录(No.DQ341279),与GenBank公布的其他Hp菌株的核苷酸同源性为94%~98%,与国际测序模式株Hp26695、HpJ99同源性达97%,表达的NAP融合蛋白的相对分子质量(Mr)为44000,1mmol/L浓度IPTG诱导4h表达产物量较高,表达产物可被Hp感染患者的血清及兔抗Hp全菌抗体特异性结合,胃癌患者血清中抗NAP抗体效价高于正常人群血清,29株小鼠抗Hp全菌mAb中有3株mAb能与NAP发生强免疫反应。结论成功构建napA基因高效可溶性原核表达系统,重组NAP具有良好的免疫反应性,NAP在胃癌患者血清中高表达可能与胃癌的发病有关,NAP是具有良好前景的抗原。     

幽门螺杆菌UreB与大肠杆菌LTB基因融合及表达的研究

目的　构建和表达幽门螺杆菌尿素酶B亚单位 (UreB)与大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位 (LTB)的重组融合蛋白 ,并对其基本的生物学及免疫学特性进行研究。方法　采用PCR技术从幽门螺杆菌染色体DNA中扩增出 1713bp的ureB基因 ,并克隆至pFS2 .2载体中与ltB基因融合 ,将ltB ureB融合基因插入改造后的原核表达载体PinPointTMXa Ⅱ ,并在工程菌E .coliJM10 9中诱导表达。结果　经序列分析 ,ltB ureB融合基因由 2 10 3个碱基组成 ,为编码 70 1个氨基酸残基的多肽。SDS PAGE和Westernblot检测发现 ,融合蛋白的相对分子质量 (Mr)约为 75× 10 3 ,并与幽门螺杆菌感染的阳性血清发生抗原抗体反应 ,ELISA检测显示 ,融合蛋白中存在LTB组分。同时发现所表达的融合蛋白无尿素酶活性 ,但保持与LT受体 神经节苷脂GM1结合的活性。结论　LTB UreB融合蛋白有可能用于幽门螺杆菌基因工程疫苗的研究     

Prevention of mucosally induced uveitis with a HSP60-derived peptide linked to cholera toxin B subunit

Oral administration of the uveitogenic peptide (aa 336-351) derived from human HSP60 induced clinical and histological manifestations of uveitis in 65.8% (48/73) of Lewis rats. Uveitis was significantly decreased to 16.7% (11/66) in parallel experiments with the peptide linked to recombinant cholera toxin B subunit (rCTB), also given by mouth (chi(2)=34.2, p<0.0001). The protective efficacy between tolerized and immunized animals was 74.7%. Adoptive transfer of mesenteric lymph node cells from tolerized rats prevented the development of uveitis. A significantly higher proportion of regulatory CD4(+)CD45RC(low)RT6(+) subset of Th2 memory cells were found in the mesenteric lymph nodes (p<0.005) and spleens (p相似文献   

幽门螺杆菌尿素酶B基因的克隆与高效表达

目的克隆并表达幽门螺杆菌尿素酶B基因.方法提取幽门螺杆菌染色体DNA,用PCR方法扩增尿素酶B基因.将其克隆至表达载体pQE30,转化大肠杆菌M15,IPTG诱导表达.结果分离得到了1.7kb的ureB基因片段,并在大肠杆菌中实现了该基医的高效表达.在37℃诱导表达4h后,表达产物约占细菌总蛋白的34.0%.表达以可溶性蛋白和包涵体两种形式存在,其中主要包涵体的形式,目的蛋白占不溶性蛋白的55.8%.结论幽门螺杆菌ureB基因的克隆与表达为Hp疫苗的研制打下了基础.     

免疫佐剂分子CTB基因的克隆与表达

我们采用聚合酶链式反应从霍乱弧菌 5 6 9B和 M0 4 5中扩增得到霍乱弧菌 B亚基基因 ,导入载体p UC18,构建重组质粒 p CTB并转化大肠杆菌 JM10 9,并用限制性酶切分析、聚合酶链式反应、序列分析、硫酸十二烷酸钠 -聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western印迹进行鉴定。实验结果表明我们成功地扩增出 376 bp的霍乱弧菌 B亚基基因 ;构建免疫佐剂分子的重组质粒 p CTB;并在原核系统中表达出 12 KD的霍乱弧菌 B亚基抗原区带。     

Fusions to the cholera toxin B subunit: influence on pentamerization and GM1 binding

The cholera toxin B (CTB) subunit has been used extensively in vaccine research as a carrier for peptide immunogens due to its immunopotentiating properties, where coupling has been obtained either by genetic fusion or chemical conjugation. For genetically fused immunogens both N- and C-terminal fusions have been used. Only shorter extensions have previously been evaluated and in some reports these fusions have impaired the biological functions of CTB, such as the ability to form pentamers and to adhere to its cell receptor, the GM1 ganglioside. Here we report the first systematic study where the same fusion partner has been used for either C-terminal, N-terminal or dual fusions to CTB. The serum albumin binding region (BB, approximately 25 kDa) from streptococcal protein G, which is known to fold independently of N- or C-terminal fusions, was selected as fusion partner. The three fusion proteins CTB-BB, BB-CTB and BB-CTB-BB were expressed in Escherichia coli, where they were efficiently secreted to the periplasmic space, and could be purified by affinity chromatography on human serum albumin (HSA) columns. The CTB fusion proteins were compared for their ability to form pentamers, by gel electrophoresis and size-exclusion chromatography, and it was concluded that all three fusion proteins were able to pentamerize. Interestingly, the C-terminal fusion to CTB showed most efficient pentamerization, while the dual fusion was much less efficient. Purified pentamer fractions from all three fusions where found to react to a monoclonal antibody described to react only to pentameric forms of CTB. In addition, the purified pentamer fractions were analyzed in an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for their ability to bind GM1, and it was found that the C-terminal fusion (CTB-BB) showed significant GM1-binding, but that also the N-terminal and dual CTB fusion proteins bound GM1, although less efficiently. The implications of the results for the design and use of CTB fusion proteins as subunit vaccines are discussed.     

IgG subclass response to Helicobacter pylori and CagA antigens in children

Specific serum IgG subclass antibodies against Helicobacter pylori antigens and recombinant CagA were analysed in 75 symptomatic children with histologically confirmed H. pylori infection. H. pylori stimulated an IgG1 predominant response, and IgG3 titres showed a positive association with peptic ulcer disease, chronicity of antral inflammation and density of H. pylori colonization. Two methods used for assessing serum IgG CagA antibody status, i.e. Western blotting and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), were concordant. CagA stimulated an IgG1 and IgG3 predominant humoral response. Total CagA IgG titres were higher in children with active and more severe chronic antral inflammation. These findings suggest that in children the systemic humoral immune response to H. pylori infection may reflect gastroduodenal pathology.     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位Th表位的免疫学特性研究

采用MHC限制性分析、ELISA方法、淋巴细胞增殖实验等方法研究幽门螺杆菌(Hp)尿素酶B亚单位(UreB)的H- 2~d限制性Th表位U_(546-561)、U_(229-244)、U_(237-251)的免疫学特性。发现抗I-E~d抗体能够抑制U_(546-561)对CD4~+T淋巴细胞的刺激,抗I-A~d抗体能够抑制U_(229-244)、U_(237-251)对CD4~+T淋巴细胞的刺激作用。U_(229-244)、U_(229-244)能刺激CD4~+T淋巴细胞分泌IL-4和IL-10,U_(237-251)刺激CD4~+T淋巴细胞分泌IFN-γ、IL-2,且U_(546-561)、U_(229-244)、U_(237-251)三个表位肽免疫BALB/c小鼠能够引起针对各自免疫多肽和rUreB的CD4~+T细胞应答。结果表明U_(546-561)为I-E~d限制性Th2表位,U_(229-244)为I-A~d限制性Th2表位、U_(237-251)为I-A~d限制性Th1表位。三个表位之间具有协同刺激效应,可以用于Hp表位疫苗的研究。     

重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位疫苗鼻腔免疫的实验研究

目的:探讨基因工程疫苗Hp重组尿素酶B亚单位(rUreB)鼻腔接种的免疫效果。方法:以rUreB不同剂量或加不同佐剂滴鼻免疫BALB/c小鼠。末次免疫7 d后,收集血清及胃黏膜、小肠黏膜、鼻黏膜及气管黏膜冲洗液,用ELISA法检测抗rUreB特异性抗体。结果:rUreB鼻腔免疫后各实验组血清特异性IgG及各黏膜冲洗液中特异性IgA的水平均明显增高,与对照组相比较差异显著(P<0.01)。20μg剂量组与10μg剂量组相比较,仅血清特异性IgG水平增高,其它黏膜特异性IgA的水平未见增高。大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)的佐剂效果较霍乱毒素B亚单位(CTB)强,卡泊波可增强鼻腔接种疫苗在胃黏膜洗液中的抗体应答水平。结论:CTB、LTB、卡泊波均可作为rUreB鼻腔黏膜接种的佐剂。HprUreB鼻黏膜接种,不仅可诱导血清特异性抗体反应,而且能引起多个黏膜部位的免疫应答,是一种方便、有效、廉价的免疫途径。     

幽门螺杆菌尿素酶B亚单位W/O/W型复乳剂的研制

目的 制备重组幽门螺杆菌尿素酶B亚单位(rUreB)复乳剂，研究其物理性质及免疫效率。方法 设计处方采用二步法制备复乳，显微镜观察乳滴结构及粒径分布，以电导法测定包封率，以经典法、离心法及电导法观察复乳的稳定性，免疫印迹观察抗原制备成复乳剂后免疫反应性的变化，以动物实验观察rUreB复乳的免疫效率。结果 制备的rUreB复乳性质稳定、包封率98．3％、粒径大小主要在2～10μm，免疫印迹及小鼠口服免疫后特异性抗体测定结果表明，该复乳具有良好的免疫原性，剂量小、免疫效率高。结论 将幽门螺杆菌尿素酶B亚单位制备成复乳剂可得到高效、廉价、使用方便的疫苗，复乳是一个很有潜力的黏膜疫苗传送系统。