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1.
目的 构建及鉴定人Notch-1基因的RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,寻找最佳RNAi慢病毒载体。方法 针对人Notch-1基因序列,按照RNAi序列设计原则,设计3段RNAi靶点序列(shRNA1~3),通过限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切、T4 DNA连接酶连接,将Notch-1基因序列插入慢病毒载体pLenOR-THM,构建pLenOR-THM-Notch-1重组载体。质粒转化感受态DH5α细菌,筛选阳性克隆,经KpnⅠ和EcoRⅠ双酶切及测序鉴定正确后通过脂质体将慢病毒四质粒系统共转染293T细胞,进行慢病毒包装并测定病毒滴度,观察感染效率。各组病毒载体转染ACC-M细胞后,运用定量逆转录聚合酶链反应和Western blot检测Notch-1基因mRNA和蛋白的表达水平。结果 成功构建慢病毒载体pLenOR-THM-Notch-1,四质粒共转染293T细胞后可见大量绿色荧光;浓缩后的病毒滴度为5.8×108 TU·mL-1;以复感染系数为1时感染293T细胞,感染效率在90%以上。QRT-PCR和Western blot检测结果表明,pLenOR-Notch-1-shRNA3组受抑制程度最高。结论 成功构建了人Notch-1 RNAi慢病毒载体。 相似文献
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目的::构建人CD106基因RNAi慢病毒载体。方法:设计4条靶向CD106的RNA干扰靶点序列(Target 1、2、3、4),合成短发卡结构shRNA并退火成双链DNA,与慢病毒载体重组形成siRNA表达载体,利用PCR和测序鉴定验证获得连接正确的克隆。经由293T细胞包装siRNA慢病毒颗粒,随后将其感染人口腔鳞癌HN12细胞,分别采用Real-time PCR和Western blot方法检测靶基因在mRNA和蛋白质水平的沉默效率。结果:构建的慢病毒载体的PCR鉴定和测序正确,包装病毒后滴度至少达到1×109 TU/ ml。siRNA慢病毒感染人HN12细胞,经Real-time PCR和Western blot检测目的基因CD106的mRNA和蛋白表达较阴性对照载体慢病毒感染组明显下降。结论:成功构建了人靶向CD106RNAi慢病毒载体,并能够在细胞水平上有效沉默靶基因。 相似文献
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靶向细胞分裂周期蛋白6 RNAi慢病毒载体的构建 总被引:1,自引:0,他引:1
目的 探讨细胞分裂周期蛋白6(Cdc6)RNAi慢病毒载体的构建.方法 设计5个靶向Cdc6的RNA干扰靶点序列(Target 1、2、3、4、5),构建靶向Cdc6的RNA干扰载体和Cdc6过表达载体,共转染293T细胞进行外源筛靶,采用Western blot检测Cdc6蛋白表达情况,判断不同靶点的干扰效果,选择两条最佳RNAi有效靶点序列,制备靶向Cdc6的慢病毒载体,并将其转染Tca8113细胞,通过Real-time RT-PCR和Western blot检测Cdc6 mRNA和蛋白表达水平,以MTT法测定Tca8113细胞生长水平.结果 成功构建Cdc6 siRNA表达质粒及Cdc6过表达载体质粒,经外源筛靶实验显示,相对阴性对照组(NC),Target 3和Target 4靶点对Cdc6蛋白表达的敲减作用最显著,敲减率分别为69.15%和84.85%.在Tca8113细胞中,与NC组比较,靶向Cdc6慢病毒载体KD1和KD2组Cdc6 mRNA表达的敲减率分别为50%和65%:Cdc6蛋白表达水平分别下降65.87%和79.38%;Tca8113细胞生长抑制率分别为25.84%和30.34%.结论 成功构建两条靶向Cdc6 RNAi慢病毒载体:Target 3和Target 4. 相似文献
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目的:构建人N-α-乙酰基转移酶10(N-α-acetyltransferase 10, Naa10)基因有效的慢病毒RNAi载体并转染人口腔鳞癌细胞SCC-15,研究其对口腔鳞癌细胞生长的影响。方法:根据人Naa10基因mRNA序列设计合成3个siRNA片段,转染人口腔鳞癌SCC-15细胞株并进行验证,将最有效的干扰序列克隆至pLV-shRNA载体上,测序正确后进行包装,测定病毒颗粒滴度后,将慢病毒感染SCC-15细胞以测定Naa10的表达情况,并通过生长曲线研究干扰Naa10对SCC-15细胞生长的影响。结果:3个靶点的siNaa10 均能有效抑制Naa10基因的表达,其中2号靶点最为有效(P<0.005);重组RNAi质粒pLV-shNaa10经测序证实构建成功, pLV-shNaa10可在293T细胞中成功包装;测定病毒颗粒LV-shNaa10、LV-NC滴度分别为1.2×109 TU/mL和1.0×109 TU/mL;SCC-15细胞感染LV-shNaa10后,Naa10蛋白表达明显降低(P<0.005);干扰Naa10可促进人口腔鳞癌细胞SCC-15的生长。结论:成功构建了Naa10 shRNA慢病毒表达载体,感染人口腔鳞癌细胞SCC-15后,有效抑制了内源性Naa10基因的表达,干扰Naa10可促进SCC-15细胞的生长。 相似文献
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目的:构建人PERK基因的shRNA慢病毒载体,检测其对人牙髓细胞(dental pulp cells,DPCs)PERK基因表达的抑制作用.方法:针对人PERK基因的cDNA序列,设计并合成针对人PERK基因的shRNA表达序列,将其连接到载体hU6-MCS-CMV-EGFP中.测序正确后,将构建的目的载体和包装质粒共转染293T细胞,72 h后收获并浓缩得到重组慢病毒颗粒.筛选最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI),将病毒感染人牙髓细胞,通过实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,RT-PCR)和蛋白质免疫印迹(Western blot)技术检测PERK基因mRNA和蛋白的表达水平,验证干扰效果.采用SPSS24.0软件包对数据进行统计学分析.结果:成功构建LV-PERK-RNAi慢病毒载体,病毒滴度为3×108 TU/mL,最适MOI=30;RT-PCR和Western印迹法检测显示,与空白对照组相比,PERK基因的mRNA和蛋白质表达水平显著下降,在mRNA水平的表达抑制率约为63%.结论:成功构建PERK干扰慢病毒表达载体,为后续的研究创造了条件. 相似文献
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E2F-1基因RNAi慢病毒载体的构建与鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
目的:构建和鉴定靶向E2F-1基因的RNA干扰慢病毒载体。方法:体外合成两对互补并编码靶向E2F-1基因的特异性短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列和一个阴性对照组的寡核苷酸,克隆到pLKO.1-PURO-U6(Age I/EcoR I)质粒载体中,经酶切和测序鉴定所构建的重组载体是否正确,将以上质粒分别和包装质粒混合物共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。各组病毒载体转染Tca8113细胞后,运用Real-Time PCR和Western检测三组E2F-1 mRNA和蛋白的表达水平。结果:经酶切和测序证明,pLKO.1-PURO-U6-E2F-1shRNA序列正确;转染后,各组慢病毒载体中,第一组质粒感染后的Tca8113细胞中E2F-1基因的核酸电泳条带明显减弱,Western检测出E2F-1蛋白的表达降低。结论:靶向E2F-1基因的shRNA慢病毒载体构建成功,并可特异性沉默E2F-1基因的表达,为研究E2F-1在口腔鳞癌的发生发展中的作用提供了初步的实验基础。 相似文献
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目的 构建 microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体,并验证其过表达或抑制表达microRNA-223的效率。方法 设计针对microRNA-223前体的过表达基因片段及针对microRNA-223成熟体的反义片段,应用聚合酶链反应(PCR)调取目的基因及通过退火反应获得双链DNA寡聚核苷酸片段。并通过基因重组技术将目的 基因片段及反义片段分别克隆到GV229及GV232慢病毒载体中,进行PCR鉴定及DNA测序比对分析,构建相应的 microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体。利用荧光定量PCR法检测microRNA-223表达水平。结果 对阳性克隆进行PCR鉴定及DNA测序证明,microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体构建成功。microRNA-223过表达慢病毒载体能显著提高细胞中microRNA-223表达水平,microRNA-223抑制表达慢病毒载体能明显抑制细胞中microRNA-223表达水平。结论 成功构建microRNA-223过表达慢病毒载体及抑制表达慢病毒载体,为进一步研究microRNA-223对口腔癌发生发展的影响及其机制提供了稳定的细胞转染载体。 相似文献
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目的:构建针对人雌激素受体-β(estrogen receptor-β,ER-β)基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)真核表达载体质粒.方法:根据GeneBank数据库提供的ER-β基因核苷酸序列,选择设计能转录小发卡结构RNA的DNA序列,将此双链DNA 片段克隆至载体pS ilencer3.1-H1-neo中构建重组表达载体,转化DH5α菌株,提取质粒进行序列测定.结果:经测序证明与设计的相同,获得人ER-β基因的siRNA 表达载体质粒.结论:成功构建了针对ER-β基因的RNA干扰重组表达载体,为下一步ER-β基因的RNA 干扰奠定了基础. 相似文献
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目的 构建生长分化因子15(growth differentiation factor 15,GDF15)基因过表达慢病毒载体。 方法 根据GDF15 mRNA的基因序列,合成GDF15基因,构建至过表达载体并转化至感受态细胞,再进行测序验证。重组慢病毒载体经过测序鉴定后,转染293T细胞,包装生产慢病毒。用慢病毒转染293T细胞,再用Western blot检测GDF15的表达情况。 结果 测序结果证实GDF15 基因正确插入载体中。慢病毒转染293T细胞后,GDF15基因在蛋白质水平上表达显著增加。 结论 GDF15基因过表达慢病毒载体构建成功,并有效增强GDF15基因在293T细胞中的表达。 相似文献
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目的 构建BimS真核质粒过表达载体及鉴定并转染ACC-2细胞,观察其在细胞中上调BimS蛋白表达及促凋亡作用.方法 根据人BimS基因设计引物,扩增目的基因片段,挑选阳性克隆,分别采用PCR扩增电泳和DNA测序鉴定.分为对照组和实验组将构建的质粒表达载体转染ACC-2细胞,通过定量PCR和Western biot检测其基因和蛋白相对表达水平,检测细胞凋亡率和超微结构的变化.结果 实验组细胞凋亡明显,凋亡率为(29.6±0.3)%;对照组细胞凋亡率仅为(0.83±0.2)%,实验组与对照组细胞凋亡率比较具有统计学差异(Pp<0.05).电镜下实验组细胞呈典型的细胞凋亡形态学改变,对照组细胞形态未发生变化.结论 BimS真核质粒过表达载体构建成功,并能显著上调ACC-2细胞中BimS mRNA、蛋白表达及诱导细胞凋亡. 相似文献
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RNA干扰技术在口腔医学领域应用的研究进展 总被引:1,自引:0,他引:1
RNA干扰技术是过去几年分子生物学领域最重要的发现之一。目前,RNA干扰已经成为研究基因功能、细胞信号传导、细胞分化、发病机制和基因治疗的一种有力工具。下面就RNA干扰的作用机制,RNA干扰在口腔医学中的研究应用作一综述。 相似文献
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目的:应用RNA干扰技术抑制人舌癌细胞株Tca8113中内源TEAD基因的水平,观察TEAD基因对舌癌细胞生物学行为的影响。方法:构建针对TEAD基因特异性siRNA真核表达载体,将其转染至Tea8113,采用RT—PCR法检测转染后的Tca8113细胞中TEAD基因的表达。采用CCK8技术检测细胞的增殖情况,采用Transwell法检测细胞的迁移情况。实验数据采用SPSSl3.0软件包进行单因素方差分析。结果:siRNA干扰Tea8113细胞后,TEAD基因的表达水平显著下降(P〈0.05),细胞生长缓慢,体外侵袭能力下降。结论:通过RNA干扰技术阻断TEAD的表达,可抑制,rca8113细胞的生长、增殖、迁移,提示TEAD基因在舌癌的发生、发展过程中起着重要作用。 相似文献
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目的 应用RNA干扰技术抑制人舌癌细胞株Tca8113和SCC-4中RhoA基因的表达,探讨RhoA基因表达下调对舌癌细胞侵袭的影响。方法登录Genbank数据库确定人RhoA基因序列,针对RhoA的基因序列设计短链RNA,利用Lipofectamine2000介导法将RhoA-siRNA转染至舌癌Tca8113和SCC-4细胞。采用实时荧光定量聚合酶链反应检测转染后的舌癌细胞中RhoA mRNA的表达,蛋白质印迹法检测RhoA、半乳糖凝集素-3(galectin-3)和基质金属蛋白酶-9(MMP-9)蛋白的表达,Transwell小室检测细胞的侵袭能力。结果舌癌细胞转染RhoA-siRNA后,RhoA的基因和蛋白表达下降,galectin-3和MMP-9蛋白表达下降,细胞体外侵袭能力降低。结论RhoA-siRNA可以有效地抑制舌癌Tca8113和SCC-4细胞中RhoA的表达,通过降低galectin-3和MMP-9的表达从而降低细胞的侵袭能力。RhoA在舌癌的侵袭和转移中可能发挥重要的作用。 相似文献