富血小板纤维蛋白提取液对牙周膜成纤维细胞成骨能力影响的实验研究

目的：探讨富血小板纤维蛋白提取液（Platelet-rich fibrin extract, PRFe）对牙周膜成纤维细胞（Periodon-tal ligament cell PDLC）增殖、成骨分化的影响,以期为富血小板纤维蛋白在临床的应用提供理论基础。方法：实验分为实验组（P组）和对照组（D组）, P组使用含PRFe的α-MEM成骨诱导培养液（10%胎牛血清、青霉素100mg/L、链霉素100mg/L、10-2mol/Lβ-甘油磷酸钠、10-7mol/L地塞米松、5mg/L抗坏血酸）培养细胞, D组则使用不含PRFe的α-MEM成骨诱导培养液。甲基噻唑基四唑（MTT）法测定1d、3d、5d的细胞增殖数;碱性磷酸酶（ALP）活性检测1d、3d、5d的成骨分化情况;荧光实时定量PCR测定Runx2 mRNA和OCN mRNA基因分别在3d、7d的表达。结果： MTT显示：随培养时间延长,细胞数量逐渐增加,在各时间点, P组细胞的吸光度值（1d：0.235±0.012,3d：0.270±0.014,5d：0.686±0.040）均明显高于 D 组（1d：0.201±0.011,3d：0.286±0.020,5d：0.426±0.024）,差异有统计学意义（P＆lt;0.05）。 ALP活性：随着培养时间延长而增加, P组的增加更为显著,在各时间点, P组的吸光度值（1d：0.124±0.018,3d：0.176±0.013,5d：0.361±0.021）均显著大于D组（1d：0.103±0.011,3d：0.123±0.012,5d：0.162±0.014）,差异有统计学意义（P＆lt;0.05）。荧光实时定量PCR：随着培养时间延长,两组细胞的基因表达量逐渐增加,将D组3d时基因表达水平定义为1,进行组内标准化, P组细胞的Runx2和OCN基因表达量（3d时分别为1.751±0.136,1.510±0.129;7d时分别为2.287±0.165,2.103±0.042）显著高于D组（3d时两个基因均为1;7d时分别为：1.367±0.121,1.208±0.051）,差异有统计学意义（P＆lt;0.05）。结论： PRFe能有效地促进牙周膜成纤维细胞的增殖活性及成骨分化。     

富血小板纤维蛋白对兔脂肪干细胞成骨分化的影响

目的：体外分离培养兔脂肪干细胞（adipose—derived stem cells,ADSCs）,鉴定其分化能力并观察富血小板纤维蛋白（platelet—rich fibrin,PRF）对ADSCs成骨分化的影响。方法：取新西兰兔腹股沟处的脂肪组织,将其分离获得脂肪干细胞,培养至第三代用于实验。分别以油红O、茜素红染色鉴定其成脂和成骨分化能力。取兔耳中央动脉血一次离心法制备PRF膜。将脂肪干细胞分为2组：对照组不含PRF膜;实验组含PRF膜。用碱性磷酸酶（ALP）试剂盒检测不同时间点PRF对ADSCs成骨分化的影响。结果：脂肪干细胞呈长梭形贴壁生长;油红O及茜素红染色均呈阳性;在不同的时间点,实验组ALP活性值均高于对照组（P〈0．05）。结论：ADSCs具有成骨的潜能,且PRF可以促进ADSCs向成骨细胞分化。     

富血小板血浆和浓缩生长因子对人牙周膜细胞增殖和成骨分化影响的研究

目的 研究富血小板血浆(PRP)和浓缩生长因子(CGF)对人牙周膜细胞(hPDLCs)增殖及成骨分化的影响.方法 分离、培养并鉴定hPDLCs;制备人全血、PRP和CGF,分别进行血小板计数;分别将全血(对照组)、PRP(PRP组)和CGF(CGF组)与hPDLCs共培养,CCK-8法检测细胞增殖能力,细胞划痕实验检测...     

富血小板纤维蛋白与富血小板血浆体外释放生长因子的比较及其对脂肪干细胞增殖分化的影响

目的比较富血小板纤维蛋白（PRF）与富血小板血浆（PRP）体外释放生长因子的质量浓度及其对脂肪干细胞（ADSCs）增殖和成骨分化的影响。方法抽取兔耳中央动脉血,一次离心法制备PRF,二次离心法制备PRP,分别将其置于5 mL新鲜的α-MEM培养液中,分别于37 ℃下静置1、7、14、21、28 d,收集PRF与PRP析出液,检测析出液中转化生长因子-β1（TGF-β1）及血小板源性生长因子-AB（PDGF-AB）的质量浓度。将收集的PRF与PRP析出液配置成条件培养液培养ADSCs,观察其对ADSCs增殖及碱性磷酸酶（ALP）活性的影响。结果1）生长因子释放情况：不同时间点的PRF析出液中,14 d时TGF-β1的质量浓度达到最高,7 d时PDGF-AB的质量浓度最高;不同时间点的PRP析出液中,1 d时TGF-β1与PDGF-AB的质量浓度即达最高,以后逐渐下降。2）对ADSCs增殖及ALP活性的影响：PRF析出液中,14 d时对其影响最大;PRP析出液中,1 d时对其影响最大。结论与PRP相比,PRF能够缓慢持久地释放生长因子,更有力地刺激ADSCs的增殖和分化。     

乳铁蛋白对人牙周膜细胞增殖迁移分化的影响

目的：观察乳铁蛋白（lactoferrin,LF）对体外培养的人牙周膜细胞（HPDLCs）增殖、迁移和成骨分化的影响。方法：原代培养并鉴定人牙周膜细胞,稳定传代后用 MTT 比色法、Transwell 法及划痕试验检测浓度分别为0、10、20μg／ml 的乳铁蛋白对牙周膜细胞增殖和迁移的影响;矿化条件下,0、10、20μg／ml 的乳铁蛋白作用牙周膜细胞后,茜素红染色法和实时荧光定量 PCR 检测矿化能力及成骨相关基因的表达。结果：10、20μg／ml 乳铁蛋白均能促进 HPDLCs 增殖、迁移（P ＜0．05）。10、20μg／ml 乳铁蛋白组矿化结节数量增多（P ＜0．05）,碱性磷酸酶（ALP）、骨钙蛋白（OCN）、骨桥蛋白（OPN）表达量均有升高（P ＜0．05）。结论：乳铁蛋白能够促进人牙周膜细胞增殖、迁移与成骨分化。     

TNF-α对人牙周膜细胞表达Asporin的影响

目的：检测TNF-α对人牙周膜细胞Asporin表达的影响,初步探讨Asporin在牙周炎致病过程中扮演的角色,为牙周炎的发病机制研究提供线索.方法：改良酶消化法体外分离培养人牙周膜细胞,qRT-PCR检测在不同浓度TNF-α （0.5、1、2、5、10 ng/mL）作用下牙周膜细胞Asporin的表达及使用1 ng/mL的TNF-α作用于牙周膜细胞3、6、24和48 h后,牙周膜细胞中Asporin的表达;应用免疫细胞化学检测Asporin在牙周膜细胞中表达定位和在TNF-α作用下的表达变化,其结果用Image-Pro Plus （IPP）软件分析.结果：qRT-PCR结果显示,1ng/mL TNF-o能最大程度降低人牙周膜细胞中Asporin的表达（P＜0.05）,TNF-α作用后3h开始,Asporin表达下降,作用24 h,48 h后,其表达降低最为明显（P＜0.05）.免疫细胞化学的检测结果与qRT-PCR一致.结论：TNF-α能显著下调人牙周膜细胞Asporin的表达,推测Asporin可能参与了牙周炎的发生发展过程.     

富血小板血浆对人牙周膜细胞增殖及分化的影响

目的:探索不同浓度富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对人牙周膜细胞体外增殖和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性的影响.方法:两步离心法制备PRP,用酶联免疫吸附法检测血浆、PRP、激活后PRP上清液中转化生长因子-β1(transforming growth factors-β1,TGF-β1)和血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factorAB,PDGF-AB)的水平.分别用2%、5%、105、20%激活后的PRP作用于人牙周膜细胞,以DMEM培养液为阴性对照.在作用24h和72h后,用细胞计数试剂盒检测细胞增殖状况,以对硝基磷酸二钠为底物,检测细胞ALP的活性.用SPSS10.0软件包中的方差分析和配对t检验进行统计学分析.结果:激活后的PRP上清中,TGF-β1和PDGF-AB的水平均高于未经激活的PRP和血浆.各浓度PRP促细胞增殖和ALP活性的作用均显著强于阴性对照组(P＜0.001);各浓度PRP 72h时促细胞增殖和ALP活性的作用均高于24h时(P＜0.01);不同浓度PRP组问存在显著差异(P＜0.001),PRP浓度从2%渐增至10%时,细胞增殖和ALP活性随之增加;当PRP浓度达到20%时,促细胞增殖作用开始下降,而促ALP活性作用继续增强.结论:在1～3d内,PRP对人牙周膜细胞的体外增殖和ALP活性均有促进作用,并在一定范围内呈剂量依赖关系.     

机械力作用下人牙周膜细胞Osterix mRNA和蛋白的表达

目的研究在机械力作用下人牙周膜细胞内Osterix（Osx）mRNA和蛋白的表达变化,探讨Osx与正畸牙周组织骨改建的关系。方法组织块法培养人牙周膜细胞,采用离心加力装置对细胞分别加载1、2、4、6、8、12 h的机械力。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）、Western blot及细胞免疫荧光化学技术分别检测不同时间点Osx mRNA和蛋白的表达变化及其细胞定位。结果在正常人牙周膜细胞中,Osx mRNA表达微弱,蛋白未见表达;在机械力加载4 h后,Osx mRNA表达开始明显增强（P<0.01）,蛋白呈现弱表达（P<0.05）;加载8 h时,Osx mRNA和蛋白表达显著增强（P<0.01）;持续增加至加力12 h。同时,加力4 h后,少量细胞的胞质内开始呈现微弱的绿色荧光;12 h后,阳性表达主要集中在胞核内。结论机械力可诱导人牙周膜细胞Osx表达增强及活化。Osx可能参与了细胞内生物力学信号的转导,从而可能在正畸牙周组织的骨改建过程中发挥着重要作用。     

富血小板纤维蛋白对牙髓细胞增殖与分化的影响

目的:评估牙髓细胞在富血小板纤维蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)存在下的体外增殖及成骨分化的能力,为PRF作为支架材料、牙髓细胞作为种子细胞构建组织工程骨,进行前期研究。方法:3月龄比格犬拔除乳磨牙获得乳牙牙髓细胞;恒牙牙髓细胞从16月龄成年比格犬磨牙获得。静脉取血离心10 min获得PRF。实验分4组:对照组(普通培养基不加入PRF);实验组A(普通培养基加入PRF);实验组B(成骨诱导培养基不加入PRF);实验组C(成骨诱导培养基加入PRF)。分别于1、4、7和11d测定细胞数量、MTT值、半定量碱性磷酸酶值、成骨相关基因Q-PCR值,并于21d测定钙结节吸光度值。结果:PRF是一种可以促进牙髓细胞增殖的,无毒性作用的纤维网状支架结构;细胞水平上PRF促进了两种细胞的成骨分化:钙结节以及碱性磷酸酶半定量数值都明显上调(P<0.05);基因水平上,4个时间点成骨相关基因的表达量都显著增加(P<0.05),且乳牙牙髓细胞的表现均优于恒牙牙髓细胞。结论:可使用PRF和牙髓细胞复合构建组织工程骨。     

周期性张应力对人牙周膜细胞Periostin表达的影响

目的:研究在机械力作用下人牙周膜细胞(h PDLCs)内Periositn(PN)m RNA和蛋白的表达变化。方法:采用组织块酶消化法培养h PDLCs,经鉴定后将第4代细胞随机分为4个实验组和1个对照组(非加力组),4个实验组分别采用Flexcell-5000 Tension System应力加载系统对h PDLCs加载6、12、24、48 h的周期性张应力;然后采用q RT-PCR、Western blot分别检测各组h PDLCs中PN m RNA和蛋白的表达变化。结果:在正常h PDLCs中表达PN m RNA和蛋白;与对照组相比,加力6 h后,PN m RNA和蛋白的表达水平均明显降低(P<0.05);加力12 h后,PN m RNA和蛋白的表达均逐渐升高,并持续至24 h达最高水平(P<0.05);而在加力48 h时,PN m RNA和蛋白表达均明显下降,并恢复至对照组的表达水平(P>0.05)。结论:机械力可诱导h PDLCs中PN的表达增强及活化,且具有时间依赖性;提示PN可能参与了细胞内生物力学信号的转导。     

富血小板血浆对牙周膜成纤维细胞的增殖、迁移和分化的影响

目的: 体外研究不同浓度的富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)对牙周膜成纤维细胞(periodontal ligament fibroblasts,PDLFs)的增殖、迁移和分化的影响.方法:不同浓度PRP(10, 50, 100, 200, 300, 500 ml/L),加入到原代培养的人PDLFs,培养时间为3、 5、 7 d,MTT法测定细胞增殖效果,transwell系统测定细胞迁移效果,AKP试剂盒测定碱性磷酸酶活性.结果:PRP有明显促进增殖作用,以200 ml/L浓度PRP效果最好,更高浓度促进作用反而减低.细胞迁移效果中,各浓度组均比阴性对照组效果好,尤其是100 ml/L的效果最佳.对于碱性磷酸酶活性,也具有明显的促进作用,以300 ml/L的效果最佳.结论:PRP在一定浓度范围内对人PDLFs功能有明显促进效果,但是在更高浓度下,这种促进效果反而减低.     

miR-203介导TNFα调控牙周膜干细胞成骨分化

目的:体外研究miR-203介导TNFα调控人牙周膜干细胞(human periodontal ligament stem cell,hPDLSCs)成骨分化能力及其分子机制.方法:qPCR检测人牙周膜干细胞成骨诱导前后TNFα和成骨基因的表达;qPCR及茜素红染色检测TNFα对牙周膜干细胞成骨分化能力及miR-203...     

TNF-α刺激下人牙周膜干细胞对CD3+T细胞功能的影响

目的:研究在TNF-α刺激下牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)对CD3+T细胞功能的影响.方法:分别获取20-30岁患者的健康离体牙8例,分离培养获得PDLSCs;采用免疫磁珠法分离获取20-30岁健康患者的CD3+T细胞;PDLSCs与CD3+T细胞共培养,PDLSCs加炎症因子(TNFα 10ng/mL)与CD3+T细胞共培养,PDLSCs与CD3+T细胞比例分别为1∶10、1∶20、1∶50、1∶100,共培养时间为48h;共培养48h后分别提取不同组的RNA并反转录为cDNA,检测凋亡、炎症及增殖相关基因的变化.结果:两组细胞生长状态良好;随共培养组PDLSCs比例的降低,正常共培养组CD3+T细胞caspase3/8、IL-6,TNFα mRNA表达水平均降低,在1∶50时趋于稳定;随共培养组PDLSCs比例的降低,炎症因子共培养组CD3+T细胞caspase3/8、IL-6、TNFα mRNA表达水平均降低,在1∶20时趋于稳定.当PDLSCs与CD3+T细胞比例分别为1∶20时H-PDLSCs(Healthy-Periodontal ligament stem cells)、I-PDLSCs(Inflammatory-Periodontal ligament stem cells)对CD3+T细胞CCND-1基因有显著抑制作用,H-PDLSCs对CD3+T细胞CCND-1的抑制作用最显著.结论:在恰当的比例时,正常及炎症PDLSCs对CD3+T细胞的凋亡及炎症因子分泌均有抑制作用,在PDLSCs与CD3+T细胞比例1∶20时,可能是由于炎症因子的存在增强了其抑制作用.     

TNF-α刺激下人牙周膜干细胞对CD3+T细胞功能的影响

目的:研究在TNF-α刺激下牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)对CD3+T细胞功能的影响.方法:分别获取20-30岁患者的健康离体牙8例,分离培养获得PDLSCs;采用免疫磁珠法分离获取20-30岁健康患者的CD3+T细胞;PDLSCs与CD3+T细胞共培养,PDLSCs加炎症因子(TNFα 10ng/mL)与CD3+T细胞共培养,PDLSCs与CD3+T细胞比例分别为1∶10、1∶20、1∶50、1∶100,共培养时间为48h;共培养48h后分别提取不同组的RNA并反转录为cDNA,检测凋亡、炎症及增殖相关基因的变化.结果:两组细胞生长状态良好;随共培养组PDLSCs比例的降低,正常共培养组CD3+T细胞caspase3/8、IL-6,TNFα mRNA表达水平均降低,在1∶50时趋于稳定;随共培养组PDLSCs比例的降低,炎症因子共培养组CD3+T细胞caspase3/8、IL-6、TNFα mRNA表达水平均降低,在1∶20时趋于稳定.当PDLSCs与CD3+T细胞比例分别为1∶20时H-PDLSCs(Healthy-Periodontal ligament stem cells)、I-PDLSCs(Inflammatory-Periodontal ligament stem cells)对CD3+T细胞CCND-1基因有显著抑制作用,H-PDLSCs对CD3+T细胞CCND-1的抑制作用最显著.结论:在恰当的比例时,正常及炎症PDLSCs对CD3+T细胞的凋亡及炎症因子分泌均有抑制作用,在PDLSCs与CD3+T细胞比例1∶20时,可能是由于炎症因子的存在增强了其抑制作用.     

中药黄芩苷对脂多糖刺激人牙周膜成纤维细胞分泌肿瘤坏死因子-α的影响

目的研究中药黄芩苷对脂多糖（LPS）刺激人牙周膜成纤维细胞（HPLFs）分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的影响。方法采用原代培养HPLFs技术和酶联免疫检测方法（ELISA），检测培养上清液中TNF-α的水平。结果0．001～10μg／ml黄芩苷和2μg／ml地塞米松均可显著抑制LPS刺激HPLFs分泌TNF-α的活性（P〈0．01），而不同浓度组之间比较，抑制作用无显著性差异（P〉0．05）。结论黄芩苷对LPS刺激HPLFs合成和分泌TNF-α有显著抑制作用，与地塞米松抗炎效果相近，作用机制与抑制TNF-α等炎性细胞因子过度产生有关，揭示了黄芩苷可能的抗炎作用机制。