肺腺癌细胞STAT5信号传导途径的初步研究

目的探讨STATS在肺腺癌细胞中增殖分化,抗凋亡作用与耐药之间的关系。方法采用浓度递增法诱导A549细胞株形成耐药细胞系,免疫组检测A549及耐药株（A549／CARP）中STATS．LRP、MRP蛋白表达情况。结果成功诱导了A549／CARP耐药细胞株。免疫组化显示A549组、A549／CARP组STATS阳性细胞数差异无统计学意义（P〉0．05）;LRP、MRP阳性细胞数差异有统计学意义（P〈0．01）STATS、LRP、MRP之间均无相关性（P〉0．05）。结论STATS参与了肺腺癌细胞的增殖分化和抗凋亡作用,并没参与介导肺腺癌的耐药;LRP、MRP均参与了诱导肺腺癌细胞的耐药,但二者之间无相关性;LRP、MRP介导的耐药机制与STATS信号传导途径无关;可通过破坏STAT5信号传导来控制肿瘤细胞的生长和繁殖。STATS可能成为肺癌基因治疗的新靶点。     

shRNA沉默EZH2表达对人肺癌细胞增殖和侵袭能力的影响

目的探讨shRNA沉默EZH2表达对人肺癌A549细胞增殖和侵袭能力的影响。方法利用RT-PCR方法检测EZH2在人肺癌细胞株中的表达,特异性shRNA沉默EZH2表达后分析NCI-A549细胞增殖和侵袭能力的变化。结果检测14株非小细胞肺癌细胞中EZH2的mRNA表达,80%的细胞株EZH2较正常肺组织高表达;shRNA阻断EZH2表达可显著降低人肺癌A549细胞的增殖和侵袭能力(P<0.05)。结论 EZH2基因沉默能有效抑制人肺癌细胞的增殖和侵袭能力,为深入研究EZH2在非小细胞肺癌中作用提供了研究基础。     

β-catenin和MMP-2在非小细胞肺癌中的表达及意义

目的探讨β连环素（β-catenin）和MMP-2在非小细胞肺癌中的表达及意义。方法采用免疫组织化学方法检测39例肺癌组织及8例正常对照肺组织中β-catenin和MMP-2的表达,并结合临床和病理资料进行分析。结果1．β-catenin和MMP-2在非小细胞肺癌组织中的胞质表达明显高于对照组,差异具有显著性（P〈0．005）;2．肺鳞癌组织中争catenin的胞质表达低于肺腺癌,胞膜表达高于肺腺癌,差异具有显著性（P=0．02,P=0．041）;3．N1—2肺癌组MMP-2的表达明显高于NO肺癌组,差异具有显著性（P=0．019）;4．非小细胞肺癌细胞β-catenin胞质表达和胞膜表达与MMP-2表达之间不具有相关性（P=0．123）。结论非小细胞肺癌细胞胞质中β-catenin和MMP-2表达明显高于正常人,肺鳞癌组织中β-catenin的胞质表达低于肺腺癌,N1—2肺癌组MMP-2的高表达可能与肺癌转移有关,非小细胞肺癌细胞β-catenin胞质表达和胞膜表达与MMP-2表达之间无相关关系。     

上皮型钙黏附素和β-连环素表达水平与非小细胞肺癌侵袭、转移及预后的关系

目的 探讨上皮型钙黏附素和β-连环素在非小细胞肺癌（NSCLC）发生、发展和转移中所起的作用及其表达水平与预后的关系.方法 采用免疫组化（SABC）法、检测111例NSCLC和23例肺良性病变组织中上皮型钙黏附素和β-连环素的表达水平,分析其与肺癌病理生理特征及患者预后的关系.结果 肺癌组织中上皮型钙黏附素和β-连环素表达水平均显著低于癌旁肺组织和肺良性病变组织（P＜0.01）.上皮型钙黏附素和β-连环素在鳞癌中的表达水平均显著低于腺癌和腺鳞癌,在Ⅲ期肺癌中的表达水平显著低于Ⅰ和Ⅱ期肺癌（P＜0.01）,伴有淋巴结转移肺癌中上皮型钙黏附素和β-连环素的表达水平均显著低于不伴有淋巴结转移者（P＜0.01）.低分化肺癌中上皮型钙黏附素表达水平显著低于中-高分化肺癌（P＜0.05）;β-连环素在低分化肺癌和中-高分化肺癌中的表达水平无显著性差异（P＞0.05）;上皮型钙黏附素和β-连环素高表达组（表达水平≥50%）的5年生存率显著高于低表达组（表达水平＜50%）（P＜0.01）.结论 上皮型钙黏附素和β-连环素表达水平降低与NSCLC的发生、发展、转移有密切关系,检测上皮型钙黏附素和β-连环素在肺癌中表达水平对预测患者预后有重要意义.     

荧光定量PCR法检测多种肿瘤组织和细胞株中nucleostemin基因的表达

目的 建立实时荧光定量PCR技术检测nucleostemin(NS)基因在多种肿瘤组织及细胞株中的表达。 方法 构建NS基因和内参基因β-actin标准品,用RT-PCR和实时荧光定量PCR检测NS基因在胃癌、结肠癌和直肠癌组织以及胃癌细胞株（BGC-823）、肺腺癌细胞株（A549）、肺巨细胞癌细胞株（PLA801-D95）、结肠癌细胞株（SW620）、人白血病细胞株（K562）、前列腺癌细胞株（PC3）的表达。 结果 NS基因在胃癌、结肠癌以及直肠癌组织中的表达显著高于癌旁组织（P<0.05）,且在BGC-823的表达显著高于其他细胞株（P<0.05）。 结论 NS基因过表达可能在多种肿瘤,尤其在胃肠道肿瘤的发生、发展过程中起重要作用。     

应用CRISPR/Cas 9 系统构建肺癌细胞系获得AMPKα1 基因敲除的稳定细胞株

目的 利用CRISPR/Cas 9 系统在人肺癌细胞系A549 和H460 中获得敲除腺苷单磷酸活化蛋白激酶α1(adenosine monphosphate-activated protein kinase, AMPKα1) 的稳定表达细胞系。方法 根据CRISPR/Cas 9 靶点设计原则,设计三条引导RNA（sgRNA）,分别构建AMPKα1-CRISPR/Cas9 KO 及其HDR 质粒。将质粒转染至A549 和H460 细胞后,筛选稳定的单克隆细胞株。用Western blot 鉴定筛选获得的肺癌细胞株是否表达AMPKα1。实验被分为原始对照组和敲除组,采用MTT 法检测AMPKα1 的肺癌细胞增殖情况。结果 经过CRISPR/Cas 9 系统处理后,筛选获得的A549 和H460 敲除AMPKα1 稳定细胞株与原始细胞株A549 和H460 相比,Western blot 检测不到AMPKα1蛋白质的表达,差异具有统计学意义(t=137.7, 79.17, 均P ＜ 0.000 1)。MTT 结果显示,筛选获得的A549 和H460 敲除AMPKα1 的稳定细胞株与原始细胞株A549 和H460 相比,敲除细胞株的增殖速度明显减弱,差异具有统计学意义（t=3.956 ～ 28.16,均P ＜ 0.05）。结论 CRISPR/Cas 9 系统成功建立敲除AMPKα1 表达的稳定肺癌细胞株,为进一步研究AMPKα1 在肺癌发生发展中的作用提供细胞模型。     

PI3K/Akt信号通路对转化生长因子β1诱导的人肺上皮-间质细胞转分化的影响

目的:探讨磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(Akt)通路在转化生长因子β1(TGF-β1)体外诱导的人肺上皮细胞A549间充质化过程中的作用。方法:将体外培养的A549细胞随机分成3组:正常对照组、TGF-β1组及抑制剂组,正常对照组不加入TGF-β1,TGF-β1组加入10ng/mLTGF-β1,抑制剂组加入TGF-β1(10ng/mL)和PI3K的抑制剂Ly294002(10nmol/L),72h后通过RT-PCR检测各组A549细胞上皮标志物E-钙黏蛋白(E-cad)及间充质细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达的变化,ELISA方法检测间充质细胞标志物纤连蛋白(Fn)表达的变化,Westernblot检测Akt磷酸化(p-Akt)水平的变化。所有实验至少重复3次。结果:正常体外培养的A549细胞有E-cad表达及微量的α-SMA、Fn、p-Akt表达;TGF-β1组E-cad的表达下调,α-SMA、Fn、p-Akt的表达上调;抑制剂组与TGF-β1组比较E-cad的表达上调,α-SMA、Fn、p-Akt的表达明显抑制。结论:PI3K/Akt途径参与TGF-β1介导的肺上皮-间质细胞转分化过程,PI3K特异性抑制剂Ly294002可有效抑制TGF-β1介导的肺上皮-间质细胞转分化过程。     

外源性导入肝细胞生长因子对人肺腺癌A549细胞增殖、黏附、移动和侵袭的影响

目的探讨外源性导入肝细胞生长因子(HGF)对人肺腺癌A549细胞增殖、黏附、移动和侵袭能力的影响及对其受体c-Met和上皮钙粘蛋白(E-cad)表达的调节作用。方法培养人肺腺癌细胞系A549细胞,按照给予外源性HGF(rh HGF)的浓度分为4组(0、20、40、80 ng/m L)。运用MTT法检测HGF对细胞增殖、黏附的影响,运用transwell小室观察各组间A549细胞侵袭和转移的变化,并采用免疫细胞化学检测rh HGF对c-Met和E-cad的作用。结果 rh HGF明显促进A549细胞增殖,提高黏附能力,40 ng/m L组最显著。rh HGF处理组A549细胞移动、侵袭能力明显增加(P0.05)。rh HGF刺激下,cMet表达无明显改变,E-cad表达下调。结论 HGF可通过下调E-cad的表达来增强肿瘤细胞移动、侵袭能力,促进NSCLC的恶性进展。     

阻断STAT3信号转导通路抑制人非小细胞肺癌细胞侵袭转移的体外研究

【目的】观察JAK2激酶特异性抑制剂AG490对非小细胞肺癌A549细胞侵袭的影响,探讨通过药物阻断STAT3信号转导通路在治疗非小细胞肺癌中的作用。【方法】应用AG490处理非小细胞肺癌A549细胞。噻唑蓝法检测各组细胞的增殖情况;平板克隆形成实验检测细胞克隆形成率;利用B0yden小室体外侵袭模型检测A549细胞体外粘附和侵袭力;Westernblot检测STAT3信号转导通路成员的表达。【结果】AG490明显抑制非小细胞肺癌细胞增殖和细胞克隆形成（P〈0．05）,降低细胞粘附力和体外侵袭力（P〈0．05）,并可抑制JAK2／STAT3信号转导通路活化,使STAT3、CyclinE1蛋白的表达水平明显下降（P〈0．05）。[结论]STAT3信号转导通路参与癌细胞侵袭调控,阻断STAT3通路活化可以抑制非小细胞肺癌细胞侵袭。     

GANT61对肺癌细胞H1703和A549的活力和侵袭力的影响

【目的】观察新型Hh通路抑制剂GANT61对肺癌细胞H1703和A549的生长抑制情况。【方法】培养H1703和A549细胞,加入8．00μmol／L GANT6172h后采用MTT法检测细胞生长情况;Western blot法观察GANT61对Gli-1和Gli-2蛋白表达的影响;观察GANT61对细胞侵袭能力的影响。【结果】H1703和A549细胞培养24h、48h和72h光吸收值均明显低于H1703和A549细胞空白组（P〈0．05）;H1703和A549细胞加入GANT6124h后Gli-1和Gli-2蛋白相对表达量分别为（0．12±0．01）,（0．09±0．01）和（0．41±0．05）,（0．15±0．01）较空白组均明显减少,且差异有显著性（P〈0．05）;H1703和A549加入GANT6124h平均穿膜细胞数分别为（44．35±8．84）个和（67．12±4．71）个,明显低于H1703和A549空白组（130．12±7．83）个和（160．21±4．55）个（P〈0．05）。【结论]GANT61能明显抑制H1703和A549的细胞活力和侵袭能力,可能成为肺癌靶向治疗的新药物。     

Increased sensitivity of human lung adenocarcinoma cells to cisplatin associated with downregulated contactin-1

Contactin-1 (CNTN-1), a glycosyl phosphatidylinositol anchor neural cell adhesion molecule (ACAM), is thought to function not only in nervous system development but also in the invasion and metastasis of several tumours. To investigate whether CNTN-1 is involved in multidrug resistance (MDR) in lung adenocarcinoma, CNTN-1 expression was compared between MDR human lung adenocarcinoma A549/cisplatin (A549/DDP) cells and its progenitor A549 cells. The comparison showed that CNTN-1 expression in A549/DDP cells was significantly higher than in A549 cells both at the mRNA level and the protein level. In order to confirm the physiological function of the abnormal expression, lentivirus-mediated short hairpin RNA (shRNA) was used to silence CNTN-1. Cell cytotoxicity assay and cell apoptosis assay revealed that silencing CNTN-1 both in A549 cells and in A549/DDP cells not only rendered cells more sensitive to cisplatin than the negative control, but also increased the cisplatin-induced apoptosis. Metastasis and invasion assays demonstrated that CNTN-1 knockdown reduced metastasis and invasion but did not affect A549 or A549/DDP cell proliferation. To investigate whether the abnormal expression of CNTN-1 is associated with characteristics of patients with non-small cell lung cancer (NSCLC), immunohistochemistry was used to detect CNTN-1 expression in 143 tissue samples from NSCLC patients and the results showed that the degree of CNTN-1 expression positively correlated with lymphatic invasion in patients with lung adenocarcinoma who received adjuvant cisplatin- or carboplatin-based treatment after surgery. Thus, we concluded that CNTN-1 is closely related with MDR of lung adenocarcinoma. Additionally, CNTN-1 is a novel marker to predict chemotherapeutic efficacy of patients with lung adenocarcinoma, especially with regard to cisplatin- or carboplatin-based regimens.     

过表达SOCS5对非小细胞肺癌增殖、迁移和侵袭的作用及机制研究

摘要：目的?分析细胞因子信号传导抑制因子5(SOCS5)对非小细胞肺癌(NSCLC)细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响，并探讨其可能的作用机制。方法?应用癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析SOCS5在肺癌组织中的表达情况； western blot检测SOCS5在NSCLC细胞系PC-9、A549和SPC-A-1及正常支气管上皮细胞系16HBE中的表达水平；选择SOCS5表达水平最低的NSCLC细胞系进行SOCS5过表达质粒转染，实验设对照(NC)组和SOCS5过表达质粒转染(oe-SOCS5)组。采用MTS试验检测各组细胞增殖能力；划痕试验检测各组细胞迁移能力；Boyden试验检测各组细胞侵袭能力；western blot检测各组细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路活性。结果?TCGA数据库分析结果显示，SOCS5?mRNA在肺腺癌和肺鳞癌组织中的表达水平显著低于正常肺组织(P<0.05)。western blot结果显示，SOCS5蛋白在PC-9、A549和SPC-A-1细胞中的表达水平均低于其在16HBE细胞中的表达水平(P<0.05)；选择表达水平最低的PC-9细胞进行SOCS5过表达质粒转染，结果发现与NC组相比，oe-SOCS5组PC-9细胞增殖、迁移和侵袭能力均降低(P<0.05)；western blot结果显示，与NC组相比，oe-SOCS5组细胞pPI3K、pAkt和pmTOR蛋白的表达水平均降低(P<0.05)。结论?SOSC5在NSCLC中呈异常低表达，过表达SOCS5可抑制NSCLC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活可能是作用机制之一。     

外泌体lncRNA H19在miR-7/KLF4/VEGF调控人肺腺癌细胞迁移和侵袭中的作用研究

目的 探讨外泌体长链非编码RNA H19（lncRNA H19）调控人肺腺癌细胞迁移和侵袭作用及机制。方法 收集确诊肺腺癌并经影像学诊断已发生远处转移患者（转移组）或无远处转移患者（非转移组）以及正常人群（正常对照组）各30例外周血标本,分离单核细胞获得血浆上清液分离外泌体,同时取培养人肺腺癌细胞系A549细胞时收集的培养上清液分离外泌体,实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测并比较组间外泌体lncRNA H19 mRNA表达差异。并采用慢病毒介导的lncRNA H19特异性小干扰RNA（shRNA）构建稳定敲低lncRNA H19的人肺腺癌A549细胞模型,荧光素酶验证lncRNA H19通过吸附结合微RNA-7（miR-7）,划痕实验、Transwell实验检测稳定敲低lncRNA H19对A549细胞迁移、侵袭能力的影响,蛋白免疫印迹法检测稳定敲低lncRNA H19对miR-7及其下游的信号通路蛋白Kruppel样因子4（KLF4）和血管内皮生长因子（VEGF）蛋白表达水平的影响。结果 外泌体被成功分离。与非转移组肺腺癌患者相比,转移组肺腺癌患者外周血外泌体lncRNA H19 mRNA表达增加（P < 0.01）。A549细胞中,与对照细胞相比,稳定敲低lncRNA H19细胞的外泌体lncRNA H19 mRNA表达减少（P <0.01）。 细胞划痕实验和Transwell实验显示,敲低lncRNA H19的A549细胞迁移和侵袭的能力下降。野生型 lncRNA H19 与 miRNA-7共转染后A549细胞荧光度值下降（P < 0.01）,突变型lncRNA H19与miRNA共转染后A549细胞荧光度值未见明显变化（P > 0.05）。A549细胞中,稳定敲低lncRNA H19后KLF4和VEGF蛋白表达水平均有所下调（P均< 0.05）。结论 外泌体lncRNA H19可能在肺腺癌细胞迁移和侵袭过程中发挥作用,且这种作用可能与竞争性结合miR-7及KLF4/VEGF信号通路有关。     

KAI1基因在不同转移潜能人肺癌细胞株中的表达

目的：探讨人肺癌细胞转移潜能与KAI1基因表达的关系。方法：应用real-timeRT-PCR技术检测不同转移潜能的人肺癌细胞株和正常人成纤维细胞株MRC-5中KAI1基因mRNA的表达水平及差异。结果：人肺癌细胞株中KAI1基因mRNA表达水平均显著低于正常肺成纤维细胞株MRC-5;不同转移潜能人大细胞肺癌细胞株中KAI1基因mRNA表达水平有明显差异。结论：KAI1基因表达降低与人肺癌细胞的转移潜能高低有关。     

基质金属蛋白酶及CD15在肺癌浸润、转移中的作用

目的 探讨基质金属蛋白酶（MMP-2,MMP-9）及其抑制剂（TIMP-1,TIMP-2）和细胞粘附分子CD15在肺癌浸润和转移中的作用,是否能为临床肺癌的诊断和治疗提供一种新的,有效的手段。方法 通过免疫组化方法检测47例肺癌标本中MMP-2 MMP-9,TIMP-1,TIMP-2和CD15的表达情况。结果 腺癌中MMP-2,TIMP-1阻性表达率明显高于鳞癌（P〈0.01）,鳞癌中MMP-9的阳性表达率高于腺癌（P〈0.01）;低分化者MMP-9的阳性表达率高于高,中分化者（P〈0.05）;有淋巴结转移者MMP-2,MMP-9和CD15的阳性表达率高于无淋巴结转移者（P〈0.01）;无淋巴结转移者中TIMP-1的阳性表达率高于有淋巴结转移者。结论 肺癌组织中MMP-2,MMP-9,TIMP-1和CD15的阳性表达可能是肺癌恶性程度和预后判断的指标。     

CCL21/CCR7轴对人肺癌A549细胞VEGF-C表达影响的研究

目的研究二级淋巴组织趋化因子/CC趋化因子受体7(CCL21/CCR7)轴对肺癌A549细胞血管内皮细胞生长因子-C(VEGF-C)表达的影响。方法实时定量PCR及Western Blot法检测CCL21作用前后A549细胞及A549-CCR7细胞VEGF-C mRNA及蛋白的表达。结果 CCL21作用下无论是在mRNA水平还是蛋白水平A549-CCR7细胞VEGF-C的表达均较A549细胞高。结论 CCL21与其受体CCR7结合能够促进A549细胞VEGF-C的表达,CCL21/CCR7轴可能参与了肺癌淋巴结转移的过程。进一步研究CCL21/CCR7轴和VEGF-C的关系可能有助于阐明肺癌淋巴结转移的机制。