鼠痘病毒荧光定量Taqman-PCR检测方法的建立与应用

目的 建立鼠痘病毒的荧光定量Taqman-PCR检测方法, 以期能快速、准确、灵敏、特异的检出鼠痘病毒。方法 经过比对和筛选, 本研究选取鼠痘病毒的ERPV_027基因480-800位序列段, 作为引物设计位点设计引物和探针, 并对该引物对和探针的特异性、灵敏性、稳定性和重复性进行检测。结果 本研究建立的方法, 对鼠痘病毒的检测极限是68 copies/μL;该方法特异性强, 只对鼠痘病毒特定片段进行特异性扩增, 而对小鼠肝炎病毒、仙台病毒、沙门氏菌等其它病毒、细菌无扩增;该方法稳定性和重复性均较好。结论 本研究成功建立了检测鼠痘病毒的荧光定量Taqman-PCR方法, 该方法特异性强、灵敏度高, 且具有较好的稳定性和重复性, 具有广阔的应用价值。     

鸡胚致死孤儿病毒和鸡减蛋综合症病毒多重PCR检测方法的建立及初步应用

目的 建立鸡胚致死孤儿病毒(CELO)和鸡减蛋综合症病毒(EDS)的多重PCR检测方法并进行初步应用.方法 参照GenBank提供的基因序列,设计了2对特异性引物分别扩增CELO长纤突蛋白和EDS六邻体蛋白的基因序列,建立检测CELO和EDS的多重PCR方法,考察该方法的特异性和敏感性,并使用该方法检测流感疫苗主种子批病毒是否存在外源性禽腺病毒的污染.结果 该多重PCR方法成功扩增得到了两条特异性目的条带,并经测序验证.该方法特异性好,灵敏度显示核酸最低检测量可达10^-4μg/mL.使用该方法检测12批次流感疫苗主种子批病毒,外源性禽腺病毒的检测结果均为阴性.结论 成功建立鸡胚致死孤儿病毒和鸡减蛋综合症病毒的多重PCR检测方法,灵敏度高,特异性好.在流感疫苗主种子批病毒的外源性禽腺病毒的检测中具有很高的使用价值和应用前景.     

大鼠体内彗星试验方法的建立与应用研究

目的 建立大鼠肝细胞和外周血淋巴细胞的体内彗星试验方法,并应用该方法对遗传毒性阳性物甲磺酸乙酯（EMS）和环磷酰胺（CPA）进行检测。方法 选择SD雄性大鼠为实验动物,分别给予不同剂量EMS和CPA。给药结束后,采集外周血样本和摘取动物左侧肝叶组织样本,铺制成单细胞凝胶玻片。玻片经裂解、解旋、电泳、中和、脱水等步骤后,得到可观察的实验标本。染色标本,并在40×荧光显微镜下观察拍照,使用专业分析软件对单细胞电泳图像进行分析和测定。结果 成功建立了基于大鼠肝细胞和外周血淋巴细胞的体内彗星试验方法。经该方法检测,EMS结果为阳性,CPA结果为阴性,EMS适合作为本方法的阳性对照。结论 成功建立大鼠体内彗星试验方法,并可应用于遗传毒性检测。     

两种筛选玄参中清除过氧亚硝基活性成分的在线检测方法比较研究

建立柱后HPLC-DAD-(Luminol-ONOO^-)-CL(方法1)和柱前ONOO^--HPLC-DAD(方法2)两种简单、快速在线检测清除ONOO^-的方法,将这两种方法应用于从玄参中筛选具有清除ONOO^-作用的活性物质,并结合HPLC-ESI-Q-TOF MS/MS对主要的活性成分进行鉴定。方法1从玄参中共筛选出了P1(decaffeoylacteoside)、P9(acteoside)、I6(6″-O-feruloylharpagide)、P11(cis-acteoside)、P13(angoroside)等5个具有清除ONOO^-作用的活性成分,方法2从玄参中筛选出了P9和P13两个具有清除ONOO^-作用的活性成分。两种筛选方法各具特点:方法1需要的仪器系统较为复杂,操作简单检测灵敏度高;方法2需要的仪器简单,操作相对方法1繁琐且灵敏度低。但是筛选结果表明,方法1和方法2均可以从复杂体系中快速地筛选出具有清除ONOO^-作用的活性物质,这两种方法可以为中药复杂体系中天然ONOO^-清除剂的快速发现提供技术平台。     

实时荧光定量RT-PCR方法在登革热小鼠模型中的评估及应用

目的评估登革病毒实时荧光定量RT-PCR方法,应用于登革热小鼠模型关键指标的检测。方法首先,选择合适的特异引物和探针,分子生物方法制备质粒标准品,优化PCR体系和反应条件;其次,评估该实时荧光定量RT-PCR方法的灵敏性、特异性及稳定性;最后,验证该方法对登革病毒感染小鼠血清和组织样本的适用性。结果成功确定一步法实时荧光定量RT-PCR方法;该方法较为灵敏,最低检测线为49. 6 Copies/μL;方法特异性好,未见非特异性扩增;方法稳定性好,样本Ct值标准差均小于0. 5,且CV﹤5%;登革病毒感染小鼠模型样品的检测结果符合实验预期。结论该qRT-PCR方法可作为关键指标检测方法,用于登革热小鼠模型病毒的定量检测及评估。     

腋臭粉及含汞制剂微生物限度检查方法研究

目的 建立有效、简便的方法对腋臭粉及含汞制剂进行微生物限度检查。方法 通过加入中和剂硫代乙醇酸钠来中和氧化汞,以达到破坏供试品抑菌活性的目的。细菌数测定采用离心沉淀-中和-薄膜过滤法,霉菌和酵母菌数测定以及控制菌检查采用中和-培养基稀释法。结果 细菌、霉菌和酵母菌计数方法验证实验中,实验组和稀释剂对照组的菌回收率均不低于70%,控制菌检查结果符合要求。结论 该方法有效、简便,可行性强,可作为腋臭粉及含汞制剂的微生物限度检查方法。     

ProCOUNT与单平台ISHAGE方法检测外周血及采集物中CD34~+细胞绝对计数的比较

目的评估ProCOUNT方法和单平台ISHAGE方法检测外周血及其采集物中CD34+细胞绝对计数的优缺点。方法采用流式细胞仪ProCOUNT方法和单平台ISHAGE方法,对23份动员外周血及50份采集物行CD34+细胞绝对计数,并对2种方法所得的结果进行Spearman相关分析和配对t检验。结果Spearman相关分析结果:ProCOUNT方法和单平台ISHAGE方法所得的CD34+细胞绝对数、CD34+细胞百分比高度相关(r均>0.9,P均<0.001)。配对t检验分析结果:ProCOUNT方法和单平台ISHAGE方法检测动员外周血的CD34+细胞绝对数分别为(42.7±7.5)μL-1和(52.1±7.2)μL-1(P<0.01),CD34+细胞百分比分别为(0.26±0.07)%和(0.13±0.05)%(P<0.01);检测采集物中CD34+细胞绝对数分别为(3 515.2±684.7)μL-1和(3 923.8±711.1)μL-1(P<0.01),CD34+细胞百分比分别为(0.79±0.18)%和(0.83±0.17)%(P=0.056)。ProCOUNT方法所得的结果均低于单平台ISHAGE方法所得的结果。结论ProCOUNT方法和单平台ISHAGE方法检测CD34+细胞绝对计数和百分比所得结果具有高度相关性,但前者所得结果要低于后者。     

优化整体原位杂交方法检测基因在幼鼠大脑中的表达

目的 优化整体原位杂交方法,用于检测基因在幼鼠大脑中的时空表达分布。方法 通过摸索最佳蛋白酶K的消化时间,改良杂交缓冲液成分,并延长杂交时间和漂洗时间,对整体原位杂交方法进行优化,并用优化的方法检测了Cdh6、Bhlhb5和Lmo4mRNA在出生后7天的小鼠大脑中的整体表达分布。结果 采用优化的整体原位杂交方法成功地检测了3种mRNA在幼鼠全脑的区域性表达特征,特异性杂交信号强,非特异性背景低。结论 成功优化了幼鼠全脑原位杂交方法,为开展后续的研究打下基础。     

基于抗病毒活性检测的板蓝根质量生物评价方法及优化研究

目的 建立基于抗病毒活性检测的板蓝根质量生物评价方法并进行优化研究。方法 分别采用红细胞凝集活性检测法和流感病毒神经氨酸酶（NA）活性检测法,建立板蓝根抗病毒活性生物测定方法,并对所建立的两种方法进行对比分析与优选。结果 两种方法可用于对不同样品进行活性检测和区分,结果重复性较好（RSD＝7.0%、5.78%）;Pearson相关性分析表明板蓝根凝集活性与NA抑制活性之间具有显著相关性（P＜0.01,r＝?0.81）,进一步印证了凝集活性测定法与抗病毒药理作用的关联性;在安全性、经济性、简便性和实用性等方面凝集活性检测法优势明显,可作为板蓝根质量生物测定的优选方法。结论 本研究优选凝集活性检测法用于板蓝根质量的生物测定,与抗流感病毒药效相关,提高了其现行质量控制水平,并为中药质量生物测定方法的研究提供参考。     

对胃粘膜损伤有辅助保护功能的评价试验中的病理学方法的探讨与建议

目的 建立科学的大体病理学检查和组织病理学诊断的评分原则、更合理的评分标准以及合理的统计学方法,为保健食品对胃粘膜损伤有辅助保护作用提供更为科学、可行的评价方法。方法 通过对大鼠胃黏膜急性损伤酒精模型的全面分析,针对现行方法中评价方法的缺点,根据病变特点及病理学检查的原则和半定量分析方法,以及相应的统计学方法等信息化处理,进行方法学探讨。结果 大体病理学检查按照病变所占面积以及在整个胃粘膜所占的比例;组织病理学诊断根据病变累及粘膜层的深度作为判定粘膜受损严重程度的主要依据,其他各种病变作为参考因素。分别分为未见异常(0分)、轻度病变(1分)、中度病变(2分)和重度病变(3分)。统计学方法采用Ridit统计学方法分析病理学半定量的结果。结论 从大体病理学、组织病理学的评价方法以及数据处理方法和结果判定等方面,提出了对胃粘膜损伤有辅助保护功能的动物实验相对更为科学、可行的评价方法的建议。     

冠心苏合胶囊微生物限度检查方法的验证

目的 确认冠心苏合胶囊微生物限度的检查方法和条件,保证检验方法的科学性、准确性及完整性。方法 采用《中国药典》2010年版（一部）附录“微生物限度检查法”项下相关内容进行方法学验证,通过回收率的比较来确定适宜的检查方法。结果 细菌计数检查采用低速离心-薄膜过滤法;霉菌和酵母菌计数及控制菌检查采用常规法。结论 该方法有效可行,可用于冠心苏合胶囊微生物限度检查。     

梁氏距离法的建立及其在卫生机构消毒质量综合评价中的应用

本文通过创立梁代距离系数并在优劣距离法、密切值法和相对差距和法等综合评价方法的基础上建立起来的一种综合评价方法——梁氏距离法。应用此方法综合评价广西北海市1995～1999年市区医疗卫生机构消毒质量状况,收到了良好的效果。该方法的优点是:①科学性较强。该方法引进了优劣距离法、密切值法和相对差距和法等评价方法的原理和方法,因而具有较高科学性;②原量简明,操作方便,方法易于掌握;③结果直观;④灵敏度较高;⑤能充分得用原始资料的信息;⑥能体现各指标在评价中的实际作用,因而评价结果客观性较高;⑦使用方法灵活,可根据数据的性质等情况对方法的各个步骤进行取舍。该方法的缺点是:①要求各被评价对象的指标要一致且各指标的数值要齐全;②要求指标的数值不能为负值。本文认为该方法为一实用的综合评价方法,特别适合在广大基层推广使用。     

检测痕量单纯疱疹病毒Ⅱ型荧光定量PCR方法的建立

目的 建立一种高敏感度的检测痕量单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)DNA的实时荧光定量PCR方法,为针对HSV-2潜伏感染的治疗性疫苗和抗病毒药物疗效提供一个评价方法。方法 依据HSV-2糖蛋白D(gD)基因序列,使用序列比对软件,选取其保守区序列设计引物及TaqMan探针并进行筛选;以gD基因重组质粒pcDNA3-HSV-2 gD作为标准模板,对该检测方法的反应条件进行优化,提高其检测特异性、敏感度和重现性。结果 该检测方法特异性好,检测的最低拷贝数可达到2个拷贝,线性范围为2×10⁰~2×10⁸拷贝/反应,是普通PCR敏感度的10³倍。该检测方法组间和组内变异系数均低于5%,说明该检测方法具有良好稳定性。结论 本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法用于检测痕量HSV-2 DNA具有特异、敏感、定量和重现性好的优点。     

四种检测法在乙腈沉淀法去除血清蛋白中的比较

目的比较四种方法在乙腈沉淀法去除血清蛋白中的检测效果,建立一种能快速检测去蛋白率的方法。方法用乙腈沉淀法去除血清蛋白,分别应用四种不同的检测分析方法,方法Ⅰ通过真空冻干;方法Ⅱ通过真空干燥;方法Ⅲ通过设立对照调零;方法Ⅳ通过挥干乙腈,分析血清蛋白的去除率。结果方法Ⅰ和方法Ⅱ耗时长、设备要求高;方法Ⅲ耗时最短、方法简便;方法Ⅳ耗时较短、但容易产生实验误差,方法Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的蛋白去除率结果比较,差异无统计学意义（P〉0.05）,与方法Ⅳ比较,差异有统计学意义（P〈0.05）。结论方法Ⅲ为最佳的分析测定分析方法,可用于快速方便了解乙腈的去蛋白率。     

叠加电泳装置浓缩蛋白质

用叠加电泳装置取连续性和非连续性方法进行蛋白质浓缩.连续性方法用人血清白蛋白(HSA)和人血清进行实验;前者回收率80.7±1.2%,浓缩速度22.5ml/h;后者回收率70.5%,速度16.5ml/h。非连续性方法用 HSA 和 cyt.c 混合液进行实验;电泳50分钟,前者回收率88.9±0.8%,后者的残存率在0.2%以下。两种方法浓缩倍数约大5～16倍.     

多学科联合管理模式对社区糖尿病患者心身康复管理效果研究

背景　近年来,国家大力推行以基层医疗卫生机构为主的糖尿病防治工作。2015年,《关于做好高血压、糖尿病分级诊疗试点工作的通知》明确了基层医疗卫生机构负责高血压和糖尿病的临床初步诊断,按照疾病诊疗指南和规范制定个体化、规范化的治疗方案;同时鼓励社区卫生服务中心与上级医院构建医联体,创建合理分工协作机制,引导糖尿病的防治结合和关口前移,逐步实现社区首诊、双向转诊。目的　探讨多学科联合管理模式对社区糖尿病患者心身康复的管理效果,旨在丰富家庭医生签约服务内涵。方法　选取2017年1月—2018年1月在太仓经济开发区社区卫生服务中心下属太平和惠阳两家社区卫生服务站管理随访的2型糖尿病患者222例为研究对象,采用抛硬币法分为干预组（n=110）和对照组（n=112）。干预组采用多学科联合管理模式,对照组采用常规管理模式。比较干预前及干预后3、6、12个月的血压、糖化血红蛋白（HbA1c）;比较干预前及干预后6、12个月的空腹血糖（GLU）、血脂〔三酰甘油（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）〕及干预前、干预后12个月的生活质量调查表（SF-36）各维度评分。结果　干预方法和时间在收缩压上存在交互作用（P<0.05）,干预方法、时间在收缩压上主效应显著（P<0.05）;干预方法和时间在舒张压上不存在交互作用（P>0.05）,干预方法在舒张压上主效应不显著（P>0.05）,时间在舒张压上主效应显著（P<0.05）;干预方法和时间在HbA1c上不存在交互作用（P>0.05）,干预方法、时间在HbA1c上主效应显著（P<0.05）。干预方法和时间在GLU上存在交互作用（P<0.05）,干预方法、时间在GLU上主效应显著（P<0.05）;干预方法和时间在TG上不存在交互作用（P>0.05）,干预方法、时间在TG上主效应显著（P<0.05）;干预方法和时间在TC上不存在交互作用（P>0.05）,干预方法在TC上主效应显著（P<0.05）,时间在TC上主效应不显著（P>0.05）;干预方法和时间在HDL-C上存在交互作用（P<0.05）,干预方法在HDL-C上主效应显著（P<0.05）,时间在HDL-C上主效应不显著（P>0.05）;干预方法和时间在LDL-C上不存在交互作用（P>0.05）,干预方法、时间在LDL-C上主效应显著（P<0.05）。干预后12个月,干预组患者生理职能、生命活力、社会功能、精神健康评分高于对照组（P<0.05）。结论　经多学科联合管理后12个月,糖尿病患者血压、HbA1c、GLU和血脂指标较对照组均有改善,SF-36中生理职能、生命活力、社会功能、精神健康评分的改善好于对照组。多学科联合管理能充分调动患者治疗积极性,使糖尿病得到良好控制。     

白色念珠菌ITS2的实时荧光定量PCR快速检测方法的建立及评价

目的 建立一种快速鉴定白色念珠菌的实时荧光定量PCR检测方法。方法 在白色念珠菌核糖体RNA编码基因（rDNA）中的内转录间隔区2（ITS2）上设计特异性引物和TaqMan-MGB探针,通过实时荧光定量PCR分析系统建立白色念珠菌的检测方法,对其敏感度、重复性和特异性进行方法学评价,并在模拟白色念珠菌血症的血标本中初步探讨其应用价值。结果 所建方法对白色念珠菌纯菌液的准确检测下限为10¹CFU/ml,相应的批内、批间变异系数（CV）分别为1.57%和2.20%。对135株白色念珠菌临床分离株、其他非白念菌株、细菌临床分离株和血液标本进行检测,结果显示该方法特异性为100%。另外,对于模拟白色念珠菌血症的血标本,该方法的最低检测下限为10²CFU/ml。结论 所建方法具有特异性和敏感度高、重复性好的特性,可适用于临床上白色念珠菌引起的血流感染的快速鉴定。     

RP-HPLC测定藏木香中土木香内酯和异土木香内酯含量

目的 建立了反相高效液相色谱法同时测定藏木香中土木香内酯和异土木香内酯的方法.方法 采用Phenomenex Kromasil C18色谱柱(4.6mm&#215;250mm,5.0μm);流动相为乙腈-0.04%磷酸溶液(50:50);检测波长:194 nm;流速:1.0 mL&#183;min-1.结果 异构体土木香内酯和异土木香内酯达到基线分离,含量测定的线性良好,线性范围和相关系数分别为0.07～4.80μg&#183;L-1 (r=0.999 8),0.07～4.85μg&#183;L-1 (r=0.999 8);回收率分别为97.5%和102.1%;方法精密度良好,RSD分别为1.56%和1.87%(n=5);方法重现性良好,RSD分别为1.67%和0.92%(n=5).结论 所建立的方法简便、快捷、准确,重现性好,可用于藏木香药材及其制剂的质量控制.     

几种模式识别方法在大鼠高脂血症代谢组学研究中的应用

目的： 探讨不同的模式识别方法在分析大鼠高脂血症代谢组学实验数据中的应用。方法： 采用高脂饲料喂养的方法,建立大鼠高脂血症模型。同时,以GC/MS为技术基础的代谢组学研究大鼠高脂血症的发病过程,并对图谱进行分析,将分离得到内源性代谢物,分别应用主成分分析(PCA)、软独立建模分类法(SIMCA)、非线性映射(NLM)3种模式识别方法对数据进行分析。结果： SIMCA和NLM在样本分类的效果上优于PCA,且NLM可表现出样本的经时变化规律;而PCA和SIMCA能更好地解释与疾病相关的内源性代谢物的信息,3种方法所得的结果可以互相印证和补充。结论： 在代谢组学研究中,可以运用多种模式识别方法对数据进行分析处理,以得到更可靠和全面的信息。     

中医预防瘟疫的特点和方法

归纳中医预防瘟疫的六个特点和六种方法。其特点主要是注重“防变”;强调综合预防;中药材药源丰富;方法简便易于掌握;副作用小的优点;效果比较理想。其方法主要是用药物来预防,简便验廉;用隔离来预防相互传染;用空气消毒来预防;用蒸煮的方法来消毒;积极消灭虫害,切断传播途媒介;同时改进消毒方法,强调在发病过程中,以阻止病邪深入发展与传变。这些方法在当今都是具有十分重要的现实意义。