结核分枝杆菌4种新抗原的克隆表达及血清学评价

目的 初步评价结核分枝杆菌4种新抗原Rv0432、Rv0674、Rv1566c和Rv1547的血清学诊断价值。方法 以结核分枝杆菌实验室标准参照菌株H37Rv全基因组DNA为模板PCR扩增Rv0432、Rv0674、Rv1566c基因的完整序列,Rv1547基因分为两段（Rv1547-1和Rv1547-2）扩增,与PET-32a表达载体构建重组质粒,重组蛋白利用亲和层析的方法进行纯化。待检测血清和BL21（DE3）菌体蛋白孵育进行预处理。各重组抗原用ELISA对151份待检血清（41份健康组血清和110份细菌学阳性结核患者组血清）进行IgG抗体检测。检测结果用受试者工作特征曲线对其诊断效能进行分析和评价。采用t检验比较目的蛋白在结核患者组和健康组的差异性。结果 成功克隆表达和纯化了蛋白Rv0432、Rv0674、Rv1566c、Rv1547-1和Rv1547-2,ELISA结果显示Rv0432、Rv0674、Rv1566c、Rv1547-1和Rv1547-2的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、约登指数和曲线下面积分别为43.64%~92.73%、80.49%~92.68%、0.92~0.94、0.38~0.80、0.363~0.732和0.649~0.915。目的蛋白在结核组检测到的IgG抗体水平均大于健康组（P<0.000 1）。结论 结核分枝杆菌新抗原Rv0432、Rv0674、Rv1566c、Rv1547-1和Rv1547-2具有良好的血清学检测价值,可作为结核病免疫学诊断的候选抗原。     

基于原核表达的P0蛋白抗体ELISA检测方法

目的 建立基于原核表达的P0蛋白抗体ELISA检测方法.方法 用原核表达的P0蛋白作为包被抗原,制成固相载体.向微孔中分别加入待测样品,然后再加入辣根过氧化物酶标记抗人IgG或IgM进行反应,经过彻底洗涤后,用底物3,3’,5,5’-四甲基联苯胺(TMB)显色.TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化生成黄色.方法.结果 用本研究建立的P0蛋白抗体的ELISA检测方法检测正己烷低浓度接触工人190人,阳性率18.9％;检测高浓度接触工人79人,阳性率27.8％.与104名不接触正己烷健康工人(阳性率2.9％)比较,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 基于原核表达的髓鞘P0蛋白抗体ELISA检测方法适用于大样本人群研究.     

双单抗夹心ELISA方法检测EPF活性

目的 建立双单抗夹心酶联免疫吸附试验法用于测定早孕因子(EPF)。方法筛选可稳定分泌抗EPF单克隆抗体的细胞株，制备腹水型单抗(McAb)并分离纯化，用改良碘化钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记单抗，分析McAb的结合位点，通过抗体配对试验选择合适的捕获和检测McAb，建立双McAb-ELISA检测方法。结果筛选出二株稳定分泌抗EPF抗体的单克隆细胞株；两株单抗识别不同的抗原表位；双McAb夹心ELISA法测EPF活性灵敏度可达0．01udml，线性测定范围在0．01～10ug/ml，2份同批血清标本分别重复8次测定，平均批内变异系数为7．7％，2份不同批血清分别重复6次测定，平均批间变异系数为5．8％。建立的双McAb-ELISA法灵敏度90．2c％和特异度为92．8％。结论 建立的双McAb夹心ELISA法，有优异的灵敏度和特异度，稳定性强，而且简便、快速，适用于血清EPF检测，并有一定的临床应用前景。     

毒死蜱单克隆抗体的制备及ELISA检测方法研究

[目的]制备毒死蜱单克隆抗体,为建立毒死蜱残留检测方法奠定基础。[方法]以毒死蜱原药与3-巯基丙酸为起始原料,合成半抗原并对其进行结构鉴定。利用该半抗原与牛血清蛋白（BSA）和卵清蛋白（OVA）偶联制备毒死蜱人工免疫抗原和包被抗原,再取已免疫的经过筛选的Balb／c小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0融合,用间接ELISA和间接竞争ELISA方法对2株细胞进行鉴定,并测定与其他农药的交叉反应率。[结果]获得两株稳定分泌毒死蜱单克隆抗体的细胞株,其检测范围为0．04～0．42mg／L,半数抑制浓度为0．135mg／L,最低检测限为0．03mg／L,与杀螟硫磷、对硫磷和马拉硫磷几乎没有交叉反应。[结论]成功制备两株分泌毒死蜱抗体的单克隆细胞株,初步建立了毒死蜱间接ELISA检测方法。     

ELISA在食品动植物及其产品安全检测中的应用

酶联免疫吸附法(enzyme—linked immunosorbent assay ELISA)是把抗原和抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的检测技术，如可用碱性磷酸酶标记的IgG定量测定IgG。此法已广泛应用于临床医学、生物学、分析化学、食品分析等领域。本旨在促进该技术在检验检疫安全检测领域的应用和推广。     

河豚毒素单抗ELISA检测试剂盒的研制

目的研制快速检测河豚鱼类中的河豚毒素（tetrodotoxin,TTX）试剂盒.方法在生产的抗TTX单克隆抗体基础上,利用间接竞争酶联免疫吸附方法研制TTX快速检测试剂盒.结果该试剂盒的最低检出浓度为5ng/ml,标准曲线的线性范围为5～500ng/ml,回归方程为Y＝-0.3546x＋1.1006,r=0.99（P〈0.05）;河豚鱼25和100ng/ml 2个水平的加标回收率为72.45%～111.24%;试剂盒常温下可保存225d;与牛血清白蛋白（BSA）无交叉反应;实验室内的变异系数和实验室间的变异系数均〈20%.结论该试剂盒快速、简单、灵敏,可满足实际工作需要.     

竞争性ELISA法检测人尿金属硫蛋白方法的改进及应用

[目的]改进检测人尿金属硫蛋白（UMT）的竞争性酶联免疫吸附法（ELISA）,探讨应用该法测定人尿样标本UMT含量的价值。[方法]分离纯化人肝脏金属硫蛋白（HMT）,制备抗金属硫蛋白单克隆抗体（McAb）,利用待测样品中MT与包被MT竞争结合McAb的原理,建立竞争性ELISA,并检测健康在校大学生298份尿样中的UMT含量。[结果]竞争性ELISA对人UMT最低检出限为9ng／mL,组内和组间的变异系数分别为1．78％一6．72％和5．45％～13：26％,样品的回收率为99．69％～107．25％。尿样检测结果显示运动后UMT含量为（19．73±8．65）ng／μmolCr较运动前的（10．58±5．62）ng／μmolCr明显增加（P〈0．05）;吸烟群体UMT含量为（86．58±30．96）ng／μmolCr,显著高于不吸烟人群[（14．73±6．57）ng／μmolCr]（P〈0．05）。[结论]本法对于检测人UMT具有较好的精密度和准确度,可用于人UMT检测;运动后UMT水平显著升高,吸烟者UMT明显高于正常对照。     

检测脑脊液结核抗体对结核性脑膜炎的诊断价值

目的观察脑脊液中结核分枝杆菌特异性抗体检测对结核性脑膜炎（tuberculous meningitiS，TBM）的诊断价值。方法按照TBM的临床诊断标准和排除标准，选择临床确诊TBM病例30例为研究对象，并选择35例非结核性中枢神经系统疾病作为对照组。收集每个病人在首次腰穿的脑脊液和当天的静脉血标本，用胶体金标记方法进行检测。结果实验组脑脊液检测的阳性率显著高于对照组（P〈0．01），实验组血清的检测阳性率也显著高于对照组（P〈0．01）。脑脊液的敏感度为83．33％，特异度为88．57％；血清的敏感度为70％，特异度为77．14％。脑脊液与血清的检测的阳性率比较无显著差异（P〉0．05）。结论此种混合抗原是一种简便、快捷的诊断TBM的辅助方法。     

GLCA与ELISA法检测乙型肝炎表面抗原比较

胶体金免疫层析试纸条法 (GLCA)由于其操作简单、快速、特异性高、试剂稳定 ,不需特殊设备 ,且可随时单份测定 ,受到了基层检验工作者的欢迎 ,常用于门诊、受血者、体检等 ,为此 ,我们应用此法与酶联免疫吸附试验 (ELISA )检测HBsAg的结果进行了比较 ,现报告如下。1　材料与方法1 1　标本来源　市红十字医院受血者血清 168份 ,市疾控中心体检阳性血清 95份。1 2　试剂　GLCA试剂由北京蓝十字生物有限公司提供 ,ELISA试剂为上海科华生物技术有限公司产品。1 3　方法　 2 63份血清以GLCA、ELISA 2种方法平分测定 ,操作按说明书严…     

基因重组壳质酶融合蛋白抗原用于丝虫病血清学诊断

目的　应用基因重组壳质酶融合蛋白抗原酶联免疫吸附试验方法检测微丝蚴（Ｍｆ）血症沙鼠、正常沙鼠和班氏丝虫微丝蚴,探讨该方法在丝虫病血清学诊断中的价值及在现场推广前景。方法　用丝虫性单克隆抗体Ｍｆ１ 识别的微丝蚴壳质酶融合蛋白与祖系克隆的核苷酸系列基础引物合成寡核苷酸并进行ＰＣＲ扩增,以Ｐｍａｌｃ 为载体表达、亲和层析纯化。试验动物分别用壳质酶抗原和布鲁马来丝虫感染期幼虫接种免疫和感染,用ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳,免疫印渍技术分析壳质酶抗原的功能性蛋白分子。以酶联免疫吸附试验方法检测试验血清特异性抗体水平,并与Ｍｆｘｔ 抗原进行比较。结果　壳质酶抗原的特异功能性蛋白相对分子量为６９ ０００ 。壳质酶抗原检测微丝蚴血症长爪沙鼠和微丝蚴血症患者血清抗体阳性率为１００％ 。Ｍｆｘｔ 抗原检测的血清抗体阳性率为８０％ 。壳质酶抗原检测的正常沙鼠和正常人血清标本结果均为阴性,Ｍｆｘｔ 抗原在正常人血清中出现５％ 假阳性。流行区非微丝蚴血症者壳质酶抗原和Ｍｆｘｔ 抗原的假阳性率分别为５％ 和２０％ 。结论　基因重组壳质酶抗原酶联免疫吸附试验方法用于丝虫病血清学诊断敏感性高,特异性强,操作简便易行,具有实用价值和推广前景。     

Immunogenicity and therapeutic effects of recombinant Ag85AB fusion protein vaccines in mice infected with Mycobacterium tuberculosis

The immune function of tuberculosis (TB) patients is disordered. By using immune regulators to assist chemotherapy for TB the curative effect might be improved. In this study, a vaccine containing Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) recombinant Ag85AB fusion protein (rAg85AB) was constructed and evaluated. The mice were immunized intramuscularly three times at two-week intervals with Ag85AB fusion protein combined with Corynebacterium parvum adjuvant (rAg85AB+CP). In comparison to control mice that received either CP alone or saline, the mice that received rAg85AB+CP had significantly higher number of T cells secreting IFN-γ and higher levels of specific antibodies of IgG, IgG1 and IgG2a isotypes in sera. The specific antibodies also had higher ratios of IgG2a to IgG1, indicating a predominant Th1 immune response. To test for immunotherapy of TB, M. tuberculosis infected mice were given three intramuscular doses of 20 μg, 40 μg or 60 μg of rAg85AB in rAg85AB+CP, or phosphate-buffered saline (PBS), or CP or Mycobacterium phlei (M. Phlei) F.U.36. Compared with the PBS group, 20 µg, 40 µg and 60 µg rAg85AB+CP and M. phlei F.U.36 groups reduced the pulmonary bacterial loads by 0.13, 0.15, 0.42 and 0.40 log₁₀, and the liver bacterial loads by 0.64, 0.64, 0.53 and 0.61 log₁₀, respectively. Pathological changes of lungs were less, and the lesions were limited to a certain extent in 40 µg and 60 µg rAg85AB+CP and M. phlei F.U.36 groups. These results showed that rAg85AB+CP had immunotherapeutic effect on TB, significantly increasing the cellular immune response, and inhibiting the growth of M. tuberculosis.     

基于结核分枝杆菌多表位抗原的诊断试剂研制及临床评价

目的:基于结核分枝杆菌多表位抗原研制的新型结核免疫诊断试剂进行临床评价,评价其灵敏度和特异性,探讨其应用价值。方法:采用建立的间接ELISA方法,分别检测结核病和肺部其他疾病及健康人群血清样品。结果:508份肺结核患者样品中,检出阳性433份,灵敏度85.23%(433/508),健康人523份中,检出阳性49份,特异性90.63%(49/523)。结论:研制的新型的结核抗体免疫诊断试剂灵敏度高,特异性强,可用于结核感染的大规模筛查试验。     

ESAT-6/CFP-10融合蛋白的抗原性分析及其对诊断结核临床应用价值

目的 分析ESAT-6/CFP-10融合蛋白作为结核抗原的特性,并探讨以其作为抗原的酶联免疫斑点实验(ELISPOT)在结核诊断中的应用价值.方法 以ESAT-6/CFP- 10融合蛋白为刺激抗原的EIISPOT法(ESAT-6/CFP-10-ELISPOT)检测经结核特异性抗原刺激后分泌γ干扰素的效应T淋巴细胞数量方法,测定65例单纯结核病患者,16例HIV/结核双重感染患者,20例HIV感染患者,32例非结核呼吸道疾病患者,30名健康体检者外周血单个核细胞中结核菌抗原特异的T淋巴细胞的频率.结果 ESAT-6/CFP- 10-ELISPOT与结核菌素皮肤试验(TST)在所有81例结核患者中的比较,ESAT-6/CFP- 10-ELISPOT阳性率98.8％,TST阳性率为56.8％;ESAT-6/CFP-10-ELISPOT在涂阳结核组、涂阴结核组、HIV/结核双重感染组阳性率分别为100.0％、97.1％、100.0％,其敏感性远高于痰涂片检查,且各组结果差异无统计学意义;20例HIV感染组有1例阳性,非结核呼吸道疾病患者组与健康对照组均为阴性,提示ESAT-6/CFP- 10-ELISPOT方法的特异度为98.8％.结论 ESAT-6/CFP-10融合蛋白可以很好的刺激效应T淋巴细胞分泌γ干扰素,适合作为结核诊断中的特异性抗原,因而可以用于ELISPOT的检测,ESAT-6/CFP- 10-ELISPOT对结核诊断有应用价值.     

结核分枝杆菌rPstS1-HspX融合蛋白的制备及其血清学诊断价值

目的表达、纯化结核分枝杆菌rPstS1-HspX（rPH）融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的价值。方法异丙基．陆D一硫代吡喃半乳糖苷（帆）诱导rPH融合蛋白表达,并用镍离子螯合亲和层析柱纯化融合蛋白。Western印迹分析纯化后融合蛋白的免疫反应性。最后用ELISA法检测194份血清抗体样本,其中来源于肺结核患者94份,非结核肺部疾病患者52份,健康对照者48份。结果rPH融合蛋白在大肠埃希菌中主要以可溶性非包涵体形式表达,相对分子质量为51000。经亲和层析后得到了浓度为0．62ng／mL,纯度达92％的融合蛋白。Western印迹实验证实纯化后融合蛋白能与结核病阳性血清发生特异性免疫应答。重组蛋白rPH血清检测的灵敏度为77．6％（73／94）,特异性为92．0％（92／100）。结论成功表达和纯化了rPH融合蛋白,其用于结核病血清学诊断具有较好的灵敏度和较高的特异性,是ELISA的可靠抗原。     

结核分枝杆菌ESAT-6 His融合蛋白的原核表达及纯化

摘要:目的 构建含有His标签结核分枝杆菌esat-6基因的原核表达质粒,并在体外进行原核表达和纯化。方法 提取结核分枝杆菌基因组DNA,对其采用聚合酶链反应技术扩增esat-6基因,并构建至表达载体pET28a上。将测序正确的载体转化大肠杆菌BL21,然后对His-ESAT6融合蛋白通过IPTG诱导进行表达,最后对重组蛋白使用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹进行分析。结果 PCR扩增出结核分枝杆菌esat-6基因,成功构建至表达载体pET28a-ESAT-6上,并在体外优化表达,产生高水平的目的蛋白表达产物。结论 成功构建并表达了含有His标签的ESAT-6融合蛋白,为临床中预防和治疗结核病提供了有效的参考。     

结核分枝杆菌rESAT-6-CFP-10融合蛋白的制备及其血清学诊断价值

目的 表达、纯化结核分枝杆菌rESAT-6-CFP-10(rEC)融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的应用价值.方法 用镍离子螯合亲和层析柱纯化融合蛋白,用ELISA法检测血清样本中的抗结核抗体,以37例PPD阴性患者正常血清A492+2s为正常限值,评价rEC诊断的特异性及灵敏度.结果 rEC融合蛋白在大肠埃希菌中以可溶性非包涵体形式表达,表达浓度为0.19 mg/mL.rFC检测抗结核抗体在PPD阳性健康人群中的特异性为100%(30/30),在痰涂片或细菌培养阳性和两法均阴性的结核病患者中灵敏度分别为75.56%(34/45)和67.3]%(35/52).结论 结核分枝杆菌rEC融合蛋白以可溶性形式高效表达,具有较强的免疫反应性和较高的血清学诊断价值.     

重组结核杆菌分泌融合蛋白活性鉴定及应用

目的研究融合表达结核分枝杆菌分泌蛋白CFP10-ESAT-6或ESAT-6-CFP10免疫学特性.方法将一个柔性的氨基酸接头插入原核表达载体pET32c（＋）中,构建pET32c（＋）-linker.PCR法扩增CFP10、ESAT-6基因.将CFP10克隆入改建的载体pET32c（＋）的linker前,ESAT-6克隆入linker后,构建CFP10-ESAT-6融合基因;或将ESAT-6克隆入改建载体pET32c（＋）的linker前,CFP10克隆入linker后,构建ESAT-6-CFP10融合基因,分别转化大肠埃希菌XL1-blue,抽提质粒,酶切鉴定;在大肠埃希菌BL21中表达,通过Western blot分析其抗原性.结果 2个目的基因分别被按顺序成功克隆入载体pET32c（＋）的linker前或后.重组质粒pET32c（＋）-CFP10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10靶基因的测序结果与预计序列完全一致.融合蛋白在BL21菌中高效表达.Western blot分析表明,融合蛋白与活性肺结核患者血清能发生特异性免疫反应.结论成功地构建了多抗原基因DNA质粒;pET32c（＋）-CFP10-ESAT-6或pET32c（＋）-ESAT-6-CFP10质粒在BL21菌中能高效表达rCFP10-ESAT-6或rESAT-6-CFP10融合蛋白,该蛋白兼具CFP10和ESAT-6两种蛋白的抗原性.     

Cutinase-like protein-6 of Mycobacterium tuberculosis is recognised in tuberculosis patients and protects mice against pulmonary infection as a single and fusion protein vaccine

Infection with Mycobacterium tuberculosis continues to be a leading cause of death in many regions of the world, and control of this disease is hampered by the lack of a safe and effective vaccine. Secreted proteins of M. tuberculosis are an important group of antigens for subunit vaccines which target this infection. We have tested three secreted members of the cutinase-like protein (CULP) family of M. tuberculosis for their potential as protein vaccine antigens. Culp6 elicited a strong T lymphocyte response in M. tuberculosis infected mice, and importantly, in tuberculosis (TB) patients tested. Culp1, Culp2 and Culp6 when delivered as protein vaccines to mice, induced potent IFN-γ responses which in turn translated into a significant level of protection against aerosol M. tuberculosis infection. A Culp1–6 fusion protein provided an increased level of protection against infection compared to Culp1 or Culp6 alone. The data presented here may indicate that the cell wall-associated, putatively essential protein Culp6, shown here for the first time to be recognised in TB patients, is an attractive candidate for inclusion in future subunit vaccines.