TaqMan荧光定量RT-PCR技术快速检测EV71方法的建立

目的:建立特异、灵敏、快速的TaqMan荧光定量RT-PCR方法,用于快速检测71型肠道病毒(EV).方法:从Genebank下载EV71型VP1基因序列,在其保守区域设计特异性引物与TaqMan探针,并对荧光定量PCR体系与反应条件进行优化,同时验证方法的特异性、敏感性和重复性.结果:该方法对EV71具有高度特异性,与非71型肠道病毒等均无交叉反应,检测灵敏度达2×10-2 TCID50/mL,反应体系具有很高的稳定性,整个操作过程仅需2.5 h.结论:所建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速,适用于EV71的日常监测和暴发时应急诊断.     

肠道病毒TaqMan荧光定量RT-PCR法快速检测

目的建立一种特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法检测肠道病毒核酸,应用于暴发疫情的实验室应急检测。方法根据GenBank登录的肠道病毒基因序列,应用生物学软件进行序列比对,在肠道病毒基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针;对荧光RT-PCR反应条件进行优化,验证方法的特异性和灵敏度。同时对疑似肠道病毒感染者的临床样本进行检测。结果该方法对肠道病毒的检测有高度的特异性,可检出脊髓灰质炎、柯萨奇和埃可等肠道病毒,与腮腺炎、麻疹、风疹、乙型脑炎等病毒均无交叉反应。检测的灵敏度达0.1病毒效价滴定（TCID50）;可直接从疑似肠道病毒感染者的脑脊液、疱疹液和粪便等标本中检测肠道病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右。结论所建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测肠道病毒特异、敏感的方法,适用于由肠道病毒感染引起的应急疫情的实验室早期诊断。     

TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测登革1、2型病毒

目的 建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT—PCR方法用于检测登革1、2型病毒核酸，并初步应用于登革热的临床标本检测。方法 根据GenBank登录的登革热毒株序列。应用生物学软件进行序列比对，分别在登革病毒1型的NS5基因和2型的C基因的保守区设计特异性引物和TaqMan探针。对荧光定量RT—PCR反应条件进行优化，验证该方法的特异性、灵敏度和稳定性。同时对疑似登革热病例血清标本进行检测。结果 该方法对登革1、2型病毒的检测有高度的特异性，与登革病毒的4个血清型之间以及流行性乙型脑炎病毒、肾综合征出血热病毒等均无交叉反应，检测的灵敏度均达0．1TCID50，可从疑似登革热病例血清标本中直接检测登革病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。结论 本研究建立的TaqMan荧光定量RT—PCR是一种快速检测登革1、2型病毒特异、敏感的方法，适用于临床早期诊断。     

柯萨奇病毒B3的TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的:建立一种检测柯萨奇病毒B3(Coxsackievirus B3)的实时荧光定量RT-PCR方法,为临床CVB3的快速、准确检测提供一种新的方法。方法:针对CVB3基因的VP4区和管家基因β-actin的核苷酸序列分别设计了特异性的引物和TaqMan荧光探针,以重组质粒pMD18-T-CVB3为标准品,进行实时荧光定量RT-PCR检测,并构建CVB3的荧光定量RT-PCR标准曲线。结果:建立的方法在1.0×101～1.0×108copies/μl模板范围内具有良好的线性关系(r2>0.999),扩增效率高于98.0%,至少可检测10 copies/μl的阳性标准品。用CVB3感染HeLa细胞来模拟实际样品,灵敏度可达到1.0×101copies。结论:建立的荧光定量RT-PCR具有较高的敏感性、特异性和重复性,可作为CVB3的快速诊断方法,为CVB3感染的临床治疗提供快速可靠的诊断依据。     

荧光定量RT-PCR快速检测乙型流感病毒核酸

目的建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测乙型流感病毒核酸.方法根据GenBank登录的流感毒株序列,应用生物学软件进行序列比对,在乙型流感病毒核蛋白(NP)基因的保守区设计引物和TaqMan探针进行筛选,对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏度.此外还对疑似乙型流感含漱液标本进行检测.结果该方法对乙型流感病毒的检测有高度的特异性,对甲1型、甲3型、禽流感病毒H5、SARS病毒及其他呼吸道病毒均无交叉反应,检测的灵敏度达0.01 TCID50,可从疑似流感患者含漱液中直接检测流感病毒核酸,从病毒核酸提取至完成检测仅需3 h左右.结论本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR是一种快速检测乙型流感病毒特异、敏感的新方法.     

荧光定量RT-PCR快速检测人副流感2型病毒的研究

[目的]建立人副流感2型病毒的实时荧光定量RT-PCR快速检测方法。[方法]根据GeneBank数据库中已有的人副流感2型毒株的HN基因核苷酸序列,用DNASTAR生物软件进行同源性分析比较,选出高度保守且特异的核苷酸区域,用Primer5软件设计人副流感2型病毒的引物和TaqMan核苷酸探针。建立PCR反应体系,并优化反应条件。[结果]建立了人副流感2型病毒的实时荧光定量PCR快速检测方法,并有较高的特异性。[结论]本研究建立实时荧光定量PCR检测方法可以快速的检测人副流感2型病毒,可以用于临床的早期诊断。     

双重荧光定量RT-PCR快速检测A、B型流感病毒的研究

目的：建立双重荧光定量RT—PCR技术同时快速检测A、B型流感病毒，并应用于临床样本的检测。方法：在A型流感病毒M基因和B型流感病毒NP基因的保守区序列分别设计特异性引物和Taqman探针，建立优化单一和双重荧光RT—PCR反应体系，评价所建双重RT—PCR反应体系的特异性、敏感性和稳定性，并应用于疑似流感含漱液标本检测。结果：该方法对A、B型流感病毒检测具有高度特异性，检出限分别为0．1TCID50和0．01TCID50，可从疑似流感患者含漱液中直接检测到流感病毒核酸。构建的体系定量标准曲线相关系数分别为0．998和0．999，具有较好的稳定性。结论：本研究建立的双重荧光定量RT—PCR可以同时准确分型A、B型流感病毒，灵敏度高，稳定性好，是一种快速检测流感病毒的新方法。     

TaqMan荧光定量PCR技术快速检测霍乱弧菌方法的建立

目的：建立特异、灵敏、快速的TaqMan荧光定量PCR方法用于快速检测霍乱弧菌。方法：根据GenBank上的霍乱毒素（cholera toxin，CT）基因序列，在其保守区域设计特异性引物与TaqMan探针，并对荧光定量PCR体系与反应条件进行优化，同时验证方法的特异性、敏感性和重复性。结果：本方法对霍乱弧菌的检测具有高度特异性，与副溶血性弧菌、沙门菌、志贺菌、变形杆菌、大肠埃希菌、蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等均无交叉反应；检测灵敏度达10cfu／ml；反应体系具有很高的稳定性；整个操作过程仅需2h。结论：本研究建立的TaqMan荧光定量PCR方法特异、灵敏、快速．适用于霍乱弧菌的日常监测和爆发疫情的应急诊断。     

TaqMan荧光定量PCR检测1型登革热病毒及临床应用

目的建立登革热1型病毒（DV1）TaqMan荧光定量PCR快速检测方法及应用于临床诊断。方法根据DV15′端非编码区基因保守序列,设计一套特异性引物和TaqMan探针。用4个血清型DV标准毒株为对照,收集40份DV1临床血清为检测标本。通过对DV1标准毒株RT-PCR后,采用体外转录方式获得RNA模板作为阳性对照,检测所建立TaqMan荧光定量PCR方法的特异性。取DV-IgM/IgG用ELISA检测患者血清,将TaqMan荧光定量PCR和DV-IgM/Ig GELISA进行敏感性比较。结果所建立方法的最低检测限约为每反应10个基因拷贝。发病后不同时间采集的登革热患者血清标本检测结果为：发病1～3d的患者RT-PCR阳性检出率最高（81.25%）;4～6dELISA-IgM检出率最高（85.00%）;7d后ELISA-IgG检出率最高（75.00%）。结论在登革热的早期诊断中建立的RT-PCR具有较高的敏感性、特异性和重复性,可作为DV1的快速诊断方法。     

TaqMan探针检测转基因大豆含量方法的建立及应用

目的建立TaqMan探针法检测转基因大豆含量的实时定量PCR方法并应用于市售转基因食品含量的检测。方法以0、0．1％、0．5％、2．0％、5．0％的转基因大豆RoundUp Ready^TM为标准品（Fluka公司），以特异TaqMan探针序列：5’（FAM）-cccactatcettcgcaagaccct-3’（TAMRA），引物序列F：5’-tgatgtgatatctccactgacg-3’，R：5’-tgtatcccttgagceatgttgt-3’，用实时荧光定量PCR方法扩增转基因大豆外源基因CP4EPSPS基因，在实验室建立定量转基因大豆检测的标准曲线，并对市场抽检的豆奶粉、素鸡、热狗肠、黄豆等12种豆类食品及制品进行含量分析。结果在实验室建立了TaqMan探针实时荧光定量PCR检测转基因大豆含量的方法，得到0值对转基因食品百分含量对数值的标准曲线方程式为Y=-2．8194X＋27．1855，相关系数值R^2为0．9994。12种市售大豆及制品中五香茶干、豆奶粉、素鸡、热狗肠、薄白叶检测出转基因成分含量分别为2．46％、6．26％、13．95％、0．48％、0．66％，其余7份样品为阴性。结论建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR法能够快速地进行转基因大豆含量的检测，并可应用于市售转基因食品的检测。     

溶藻弧菌TaqMan实时PCR快速检测体系的建立

目的:建立溶藻弧菌TaqMan实时PCR快速检测体系。方法:根据溶藻弧菌胶原酶基因colH的保守序列设计一对引物和一条TaqMan探针,优化反应体系中的引物浓度和探针浓度,评价此反应体系的特异度,并确定其检测下限。结果:优化的反应体系中,引物浓度为200 nmol/L,探针浓度为200 nmol/L,检测下限为1.0×102拷贝/μl,较普通PCR提高了100倍。特异度为100%。结论:本研究所建立的检测体系能够灵敏和特异地检测溶藻弧菌,可以作为溶藻弧菌的快速检测方法。     

鼠巴贝斯虫TaqMan探针荧光定量PCR方法的建立及应用

目的建立一种用于检测鼠巴贝斯虫的TaqMan探针荧光定量PCR方法。方法针对鼠巴贝斯虫18sRNA基因序列,设计特异性引物和探针,建立鼠巴贝斯虫的TaqMan探针荧光定量PCR反应体系,并对该方法的灵敏度和特异性进行验证。结果本方法对鼠巴贝斯虫的检测灵敏度较高,最低检出限为1.34×10-7ng/μl;具有较高的特异性,与钩端螺旋体、莱姆病螺旋体、巴尔通体、Q热、土拉菌等病原均无交叉反应,反应体系稳定。结论本研究建立的TaqMan探针荧光定量PCR方法特异、灵敏,可用于鼠巴贝斯虫的实验室快速检测及现场监测使用。     

TaqMan实时荧光定量PCR检测肠道细菌Akkermansia Muciniphila

目的 建立Akkermansia muciniphila(A.muciniphila)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法,实现粪便中A.muciniphila的定量检测。方法 根据GenBank公布的A.muciniphila 16S rRNA基因高保守序列,设计合成特异引物和TaqMan探针,构建重组质粒作为标准品,通过反应体系和反应条件的优化,绘制标准曲线,同时将建立的方法用于10份成年人粪便标本的检测。结果 TaqMan实时荧光定量PCR检测A.muciniphila,仅需1.5h,该方法线性好,相关系数R²=0.9991,扩增效率E=94.7%;重复性好,组内和组间变异系数均小于3%;灵敏度可达到5×10³拷贝/μl;特异性良好。10份成年人粪便标本共检出9份为阳性,阳性粪便标本中A.muciniphila平均含量为2.70×108cells/g粪便。结论 本研究建立的TaqMan实时荧光定量PCR能够快速、灵敏、特异地定量检测粪便标本中A.muciniphila。     

狂犬病毒TaqMan PCR检测方法的建立

目的建立检测狂犬病毒（RV）核蛋白（N）基因片段的TaqMan PCR检测方法。方法针对RVN基因保守区域设计特异性引物与探针；优化检测体系中引物与探针的浓度；以体外转录的RV完整的N基因RNA作为定量分析模型；考核检测体系灵敏性、特异性、稳定性；初步用于RV的检测。结果引物和探针具有良好的特异性，使用浓度分别为0．6μmol／L和0．2μmol／L，可检测到2700个RNA拷贝数，较传统RT-PCR检测方法敏感性提高了10倍；同一样品Ct值重复检测5次，变异系数均〈5％，表明检测体系具有较好的稳定性；通过所建立的检测体系，绘制了以模板拷贝数为分析指标的RV定量检测标准曲线，对实验室内保存毒株的检测结果显示TaqMan PCR检测比普通PCR检测更快捷、敏感。结论所建立的RV TaqMan PCR可以用于RV的实验室检测，并且比普通PCR检测方法更灵敏、特异。     

TaqMan荧光定量PCR检测和鉴别不同血清群脑膜炎奈瑟菌方法的建立及应用

目的 建立TaqMan荧光定量PCR检测方法,用于脑膜炎奈瑟菌不同血清群菌株的检测和鉴别.方法 设计合成7对引物和TaqMan探针,脑膜炎奈瑟菌种属特异性的基因为ctrA;不同血清群的脑膜炎奈瑟菌特异性基因分别为A群(sacB)、B群(siaD)、C群(siaD)、X群(xcbB)、Y群(synF)、W135群(synG).检测和确定不同探针和引物用于脑膜炎奈瑟菌荧光定量PCR检测的特异性、敏感性,并同时将荧光定量PCR和乳胶凝集方法应用于121份疑似脑膜炎奈瑟菌感染患者的脑脊液标本的检测.结果 ctrA、sacB、siaD(B群)、siaD(C群)、xcbB、synF、synG等7对引物和探针能准确检测和鉴定79株不同血清群的脑膜炎奈瑟菌菌株,检测灵敏性比相应的普通PCR高101～103倍,每对引物和探针反应体系中,能检测的最低全基因组DNA拷贝数分别为8、8、80、8、8、80、8;检测121份疑似脑膜炎奈瑟菌感染患者的脑脊液标本,TaqMan荧光定量PCR检测11份阳性,乳胶凝集方法检测6份阳性.结论 TaqMan荧光定量PCR方法能特异地检测和鉴定不同血清群脑膜炎奈瑟菌,具有较高的灵敏性和快速检测的特点,能提高临床疑似脑膜炎奈瑟菌感染病例的阳性检出率.     

Taq Man探针检测转基因大豆含量方法的建立及应用

目的 建立TaqMan探针法检测转基因大豆含量的实时定量PCR方法 并应用于市售转基因食品含量的检测.方法 以0,0.1%、0.5%、2.0%、5.0%的转基因大豆RoundUp Ready<'TM>为标准品(Fluka公司),以特异TaqMan探针序列:5'(FAM)-cccactatccttcgcaagaccct-3'(TAMRA),引物序列F:5'-tgatgtgatatctceactgacg-3',R:5'-tgtatcecttgagceatgttgt-3',用实时荧光定量PCR方法 扩增转基因大豆外源基因CP4EPSPS基因,在实验室建立定量转基因大豆检测的标准曲线,并对市场抽检的豆奶粉、素鸡、热狗肠、黄豆等12种豆类食品及制品进行含量分析.结果 在实验室建立了TaqMan探针实时荧光定量PCR检测转基因大豆含量的方法 ,得到Ct值对转基因食品百分含量对数值的标准曲线方程式为Y=-2.8194X 27.1855,相关系数值R<'2>为0.9994.12种市售大豆及制品中五香荼干、豆奶粉、素鸡、热狗肠、薄白叶检测出转基因成分含量分别为2.46%、6.26%、13.95%、0.48%、0.66%,其余7份样品为阴性.结论 建立的TaqMan探针实时荧光定量PCR法能够快速地进行转基因大豆含量的检测,并可应用于市售转基因食品的检测.     

致病性钩端螺旋体TaqMan Real-time PCR检测技术的建立及其应用

目的 建立致病性钩端螺旋体(钩体)TaqMan Real-time PCR检测技术.方法 以钩体16S rRNA基因的部分片段rrs基因作为靶基因,设计引物、TaqMan探针,PCR产物克隆到pMD 19-T载体,制作标准曲线,建立定量分析质控标准.利用中国15群15型致病性钩体参考菌株、16群21型非致病性钩体参考菌株、50株不同血清群致病性分离株及伯氏疏螺旋体、嗜肺军团菌、肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌等27株其他常见致病菌检验引物、探针的灵敏性、特异性.将Real-timePCR、普通PCR同时应用于倍比稀释致病性钩体染色体DNA及25份现场鼠肾标本的检测.结果 建立、优化致病性钩体Real-time PCR技术,致病性钩体扩增荧光信号阳性,非致病性钩体及其他非钩体菌均无扩增.对于倍比稀释的质粒标准品,Real-time PCR和普通PCR的最低检测下限分别是10 copy/μl和104copy/μl.对于倍比稀释的钩体染色体DNA,两者的最低检测下限分别为:100 f/μl 和1 ng/μl.25份现场鼠肾标本检测显示,两种方法的检测结果一致.结论 以rrs为靶基因建立的Real-time PCR技术,具有较高的灵敏度和特异度,可用于致病性钩体的病原学检测.     

应用多重TaqMan MGB探针实时聚合酶链反应检测A型和B型流感病毒的研究

目的 应用多重real-time PCR方法检测A型和B型流感病毒,探讨其在快速诊断流感病毒感染中的优越性.方法 根据A型和B型流感病毒M基因的相对保守序列,设计两套特异性引物和TaqMan MGB探针,进行多重real-time PCR检测A型和B型流感病毒.将该方法与病毒分离、免疫层析、传统RT-PCR进行比较,并对多重real-time PCR的特异性进行评估.并应用multiplex real-time PCR方法和常规的病毒分离方法对广东省流感样病例334份咽拭标本进行检测,比较其灵敏性和特异性.结果 多重real-time PCR反应可以检测到A、B型流感病毒的最低病毒量分别为10-1和10-3TCID50/反应.该方法在对流感病毒株以及其他呼吸道病毒株样品的检测中,未发现假阳性和假阴性现象,特异性为100%.该方法对334份临床标本进行检测,结果与经典检测方法(病毒分离鉴定结合血清学检测)的符合率达100%,且灵敏度明显高于病毒分离.结论 该研究建立的多重TaqMan MGB real-time PCR是一种快速、灵敏性和特异性高的流感病毒检测方法,对于流感的早期诊断及指导临床有重要意义.