多发性骨髓瘤耐药分子机制

多发性骨髓瘤的耐药与下列因素有关:靶细胞内药物浓度降低;药物靶细胞的改变;抑制药物诱导的凋亡;尤其是后者,现越来越受到重视。已发现许多基因及其突变、细胞因子、细胞与细胞或与细胞外基质的粘附、骨髓血管生成的增加等许多因素均参与骨髓瘤细胞抵抗药物诱导的凋亡。     

纤维连接蛋白对多发性骨髓瘤化疗敏感性及其临床价值的研究

目的 探讨纤维连接蛋白对多发性骨髓瘤化疗敏感性及其临床价值。方法 采用MTT法测量柔红霉素、羟基喜树碱、金喜素和康莱特注射液对骨髓瘤细胞的细胞毒性；流式细胞仪定量检测凋亡细胞并计算细胞凋亡倍数。结果 纤维连接蛋白能使骨髓瘤耐受化疗药物的细胞毒作用，柔红霉素、羟基喜树碱、金喜素和康莱特注射液的耐药倍数分别为8．3、9．7、5，2和4．4；并能抑制化疗药物诱导的细胞早期凋亡，上述化疗药物的细胞凋亡倍数分别为0．31、0．60、0．57和0.33。结论 纤维连接蛋白能降低多发性骨髓瘤对化疗药物的敏感性，通过抑制化疗药物诱导的细胞凋亡，参与骨髓瘤早期耐药的形武，从而为临床逆转多发性骨髓瘤耐药提供新的思路。     

β-榄香烯对人骨髓瘤细胞RPMI-8226增殖与凋亡的影响

为了研究β-榄香烯对人骨髓瘤细胞系RPMI-8226增殖、凋亡的影响,探讨其作用的分子机制,用MTT法检测β-榄香烯对人骨髓瘤细胞系RPMI-8226增殖的影响;Annexin V/PI双染色流式术检测β-榄香烯对RPMI-8226骨髓瘤细胞凋亡的作用;Western blot法检测β-榄香烯对RPMI-8226骨髓瘤细胞BCL-2、caspase-3、DR-4和NF-κB P65蛋白表达影响。结果表明:β-榄香烯对RPMI-8226骨髓瘤细胞生长具有明显抑制作用,且呈浓度和时间依赖性;10-80μmol/Lβ-榄香烯作用48小时可诱导骨髓瘤细胞凋亡,凋亡率随药物浓度而递增;β-榄香烯以时间依赖方式上调caspase-3、DR-4蛋白表达,并可下调BCL-2、NF-κB P65蛋白表达。结论:β-榄香烯通过诱导细胞凋亡有效抑制骨髓瘤细胞增殖,其诱导细胞凋亡与细胞内、外凋亡通路激活、抗凋亡机制被抑制有关。     

激活Notch信号抑制多发性骨髓瘤细胞凋亡

摘要多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)细胞的增殖及凋亡受骨髓造血微环境的调节。Notch信号是骨髓中细胞与细胞之间通讯的主要信号通路之一，它对多发性骨髓瘤细胞的调节作用目前并不清楚。本研究旨在阐明Notch信号对多发性骨髓瘤细胞凋亡的调节作用。利用RT-PCR分析多发性骨髓瘤细胞Notch信号分子的表达和采用逆转录病毒介导的基因转移方法将Notch-1胞内区(Intracellular domain of Notch，ICN)转入多发性骨髓瘤细胞株，以建立激活)Notch信号的多发性骨髓瘤细胞系；采用台盼蓝拒染和TUNEL方法测定骨髓瘤细胞的死亡。结果表明：RT-PCR检测显示多发性骨髓瘤细胞表达、Notch-1及相关分子。逆转录病毒可以介导外源Notch-ICN在骨髓瘤细胞中表达，激活Notch-1信号可以抑制二甲基鞘氨醇(N，N-dimethylspingosine，DMS)诱导的多发性骨髓瘤细胞的凋亡。结论：：Notch信号对多发性骨髓瘤细胞凋亡有抑制作用，这可能为多发性骨髓瘤的治疗提供新的靶点．     

Velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡研究

为了研究velcade诱导多发性骨髓瘤细胞株U266细胞凋亡效应及机制，采用台盼蓝拒染法检测2、10、50和100nmol／L velcade处理U266细胞活率，用流式细胞术分析Annexin—V、线粒体跨膜电位（△ψm）和氧自由基（ROS），用半定量RT—PCR法检测bcl-2 mRNA的表达。结果表明：velcade抑制U266细胞增殖；诱导U266细胞凋亡，24小时Annexin—V阳性细胞比例增高，△ψm降低；12小时时活性氧明显增高，荧光强度增强；抗凋亡基因bcl-2表达降低。结论：velcade对U266细胞具有增殖抑制和杀伤作用。其可通过内源性细胞凋亡信号通路诱导U266细胞凋亡。     

苦参碱诱导多发性骨髓瘤细胞株RPMI8226凋亡的实验研究

本研究探讨苦参碱对人骨髓瘤细胞株RPMI8226的作用及其机制。用不同浓度苦参碱处理RPMI8226细胞24、48小时,通过形态学观察、Annexin-V分析、DNA琼脂糖电泳、线粒体膜电位检测观察苦参碱对RPMI8226细胞的促凋亡作用。结果表明：RPMI8226细胞经苦参碱处理后,出现典型的细胞凋亡形态,凋亡早期细胞膜外翻,DNA琼脂糖电泳出现典型的梯状结构,线粒体膜电位崩塌。结论：苦参碱能有效地诱导骨髓瘤细胞株RPMI8226细胞凋亡,凋亡率与药物剂量和作用时间呈依赖性。     

塞来昔布对U266细胞株增殖和凋亡的研究

目的观察环氧化酶-2(COX-2)抑制剂塞来昔布对骨髓瘤细胞株U266细胞的增殖抑制和凋亡诱导的影响,并通过比较单用塞来昔布和加用Caspase-3阻断剂Ac-DEVD-FMK后的U266细胞株的凋亡率以及Caspase-3的表达,探讨其诱导U266细胞株凋亡的分子机制。方法骨髓瘤细胞株U266细胞经不同浓度的塞来昔布处理后,应用CCK-8体外药物筛选法测定受试样品塞来昔布对人骨髓瘤细胞U266体外增殖有无抑制作用及作用强弱;Annexin V-FITC染色流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot法测定不同实验组样品中Caspase-3总量的表达。结果塞来昔布浓度>40μmol/L能抑制人骨髓瘤细胞U266体外增值,并呈浓度依赖性,IC50=66.83μmol/L。塞来昔布在40～120μmol/L浓度范围内能诱导人骨髓瘤细胞U266细胞凋亡,呈浓度依赖性。用Ac-DEVD-FMK阻断Caspase-3活性,塞来昔布诱导的U266细胞凋亡明显受抑。结论塞来昔布可诱导骨髓瘤细胞株U266细胞株凋亡,其机制涉及Caspase-3依赖性凋亡调节信号通路。     

多发性骨髓瘤抗凋亡基因的表达及相关性分析

骨髓瘤细胞的永生化，即细胞凋亡受抑是多发性骨髓瘤（MM）发病、进展（复发耐药）的重要因素。MM细胞过度表达Bcl-2家族抗凋亡因子Bcl-2、Bcl—xL和Mcl-1，因此靶向Bcl-2等可大大降低肿瘤细胞的凋亡阈值，增强化疗敏感性。survivin是另一类凋亡抑制蛋白家族（IAP）中的最小成员，与多种肿瘤的耐药以及预后相关。我们在本研究中通过检测上述两类抗凋亡基因在骨髓瘤细胞的表达，探讨两类抗凋亡因素对骨髓瘤发生发展的意义及相互关系，明确其临床应用价值。     

重组人血管内皮抑素体外抗多发性骨髓瘤的初步研究

本研究旨在探索重组人血管内皮抑素（recombinant human endostatin,rhES）体外对多发性骨髓瘤（MM）细胞生长的抑制作用及其机制。采用台盼蓝拒染法、MTT法检测rhES对MM细胞的增殖抑制作用,用透射电子显微镜及Annexin V—PI双标记流式细胞术检测rhES对MM细胞的凋亡诱导作用。结果表明：rhES在体外浓度为50、100和200μg／ml时,与多发性骨髓瘤细胞株CZ-1细胞作用72小时,抑制率分别为10．5％、17．9％和23．5％,其抑制CZ-1细胞增殖作用呈浓度及时间依赖性;rhES体外浓度为0—400μg／ml时对正常人骨髓单个核细胞的生长活性无明显抑制作用;而体外浓度为50—200μg／ml时rhES对多发性骨髓瘤原代细胞生长活性有抑制的作用,并且其抑制作用呈浓度及时间依赖性。rhES在体外浓度为100μg/ml时,与CZ-1细胞作用72小时,在透射电子显微镜检测可见典型的细胞凋亡的表现,流式细胞术检测其凋亡率为21．37％。结论：rhEs在体外有抑制多发性骨髓瘤细胞生长的作用,其作用机制是诱导细胞凋亡。rhES可能是用于治疗多发性骨髓瘤的潜在药物。     

Notch信号通路和多发性骨髓瘤

Notch信号通路是介导细胞和细胞之间直接接触的主要信号通路之一,调控了多细胞机体的细胞凋亡、增殖和分化,是造血微环境调节造血细胞增殖与分化的重要信号通路,与多种血液系统恶性肿瘤的发病有关。多发性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）是以浆细胞克隆性增殖为特征的B系肿瘤。由于骨髓瘤细胞的增殖比例低及多药耐药的形成,因此其对常规剂量的化疗药耐药,使得MM的临床治疗仍十分困难。近年来的研究发现,多发性骨髓瘤病人肿瘤细胞和骨髓瘤细胞株都大量表达Notch的配体Jagged-2,而正常的浆细胞或是其它恶性疾病来源的病人肿瘤细胞低量表达Jagged-2。Jagged-2可诱导基质细胞分泌白介素6（IL-6）、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、胰岛素样生长因子－1（Insulin—like growth factor 1,IGF－1）。Notch信号通路激活后可通过与NF－κB,C—myc的相互作用,调节细胞的增殖,促进骨髓瘤细胞的生长,从而抑制骨髓瘤细胞的凋亡,它与骨髓瘤的发生和耐药有关。抑制Notch信号通路能诱导骨髓瘤细胞的凋亡,增强化疗药的细胞毒作用。研究表明,单独使用Notch信号通路的特异性化学抑制剂γ－分泌酶抑制剂（γ－secrctase inhibitors,GSI）可通过特异性阻滞Notch信号通路从而诱导骨髓瘤细胞的凋亡,并且与传统化疗药物联合应用可以增强骨髓瘤细胞对化疗药的敏感性。本文就Notch信号通路的组成、Notch信号通路的作用机制及Notch信号通路与多发性骨髓瘤的关系进行综述．     

多发性骨髓瘤间充质干细胞对树突状细胞功能的影响

目的探讨多发性骨髓瘤（MM）患者骨髓来源的间充质干细胞（MSC）对树突状细胞（DC）分化、成熟和细胞因子分泌及其对DC辅助T细胞杀伤骨髓瘤细胞作用的影响。方法将从MM患者骨髓来源的MSC、正常供者外周血来源的DC及骨髓瘤细胞系U266细胞进行混合培养。流式细胞术测定DC的免疫表型,ELISA法测定上清液IL-12的含量,AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞术测定骨髓瘤细胞凋亡比例。结果MSC能抑制rhTNF-α诱导的不成熟和成熟DC的CD1a、CD11c、CD80、CD86和HLA-DR表达（P〈0.01）,并显著减少成熟DC分泌IL-12（P〈0.01）。MSC可以下调成熟DC的CD83表达,使其趋于不成熟状态（P〈0.01）。与未加入MSC组相比,MSC混合培养组凋亡骨髓瘤细胞明显减少（P〈0.01）;比较MM患者与正常供者骨髓来源的MSC对DC辅助T细胞诱导骨髓瘤细胞凋亡的影响,前者U266细胞凋亡比例比后者明显减少（P〈0.01）。结论MM患者骨髓来源的MSC可以抑制DC的分化、成熟和分泌细胞因子;无论是MM患者或正常供者骨髓来源MSC均可以抑制DC辅助T细胞对骨髓瘤细胞的凋亡诱导作用,且MM患者来源的MSC的作用更强。     

反应停诱导骨髓瘤细胞株(KM3)凋亡的初步研究

目的：观察反应停对KM3骨髓瘤细胞株的增殖抑制和诱导凋亡作用。方法：不同浓度的反应停作用于KM3细胞，光镜下计数细胞和胎盼蓝拒染法观察细胞增殖的细胞活力，细胞形态、细胞凋亡的荧光染色后的荧光显微镜检查、Annexin V-FITC和PI双染后流氏细胞仪分析判定凋亡和早期的凋亡细胞。结果：反应停在一定的剂量和一定的作用时间下可以抑制KM3细胞增殖，诱导KM3细胞凋亡，这一作用呈剂量和时间依赖性。结论：反应停诱导KM3细胞凋亡，抑制KM3细胞增殖可能是其直接抗骨髓瘤作用之一。     

异硫氰酸苯已酯抑制骨髓瘤细胞Notch信号表达的研究

为了研究异硫氰酸苯已酯(phenylhexyl isothiocyanate,PHI)在体外对骨髓瘤细胞RPMI8226增殖抑制的分子机制,用不同浓度PHI与RPMI8226细胞共同孵育,用MTT比色法检测PHI处理后细胞增殖抑制;用DAPI染色观察PHI处理后细胞凋亡;Western blot检测PHI处理后瘤细胞Notch1、Jagged2、BCL-2和p-Akt蛋白表达变化。结果显示,PHI在一定浓度范围内能抑制瘤细胞增殖,诱导瘤细胞凋亡,其抑制效应具有时间和浓度依赖性。PHI可以下调瘤细胞中Notch1和Jagged2蛋白的表达并呈时间和浓度依赖性,同时降低BCL-2和p-Akt的表达。结论:PHI在体外能够抑制骨髓瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡;细胞凋亡的发生与PHI抑制Notch信号及其下游靶基因p-Akt和BCL-2的表达有关,PHI可能成为新一代的Notch信号抑制剂,是一种潜在的骨髓瘤治疗药物。     

8-氯腺苷酸诱导多发性骨髓瘤细胞凋亡的实验研究

本研究探究8-氯腺苷酸对多发性骨髓瘤细胞的可能作用。以多发性骨髓瘤细胞株RPMl8226细胞为体外模型,在观察8-氯腺苷酸对细胞生长、活力及形态学影响的基础上,应用流式细胞术检测细胞DNA含量分布和细胞表面Annexin—V的含量,以DNA凝胶电泳技术评判细胞凋亡与否,并应用Westernblot检测药物处理前后细胞内细胞周期调控蛋白cylinE和CDK2的变化。结果表明：低浓度8-氯腺苷酸（1—30μmol／L）能够明显地抑制RPMl8226细胞的生长,显著降低其细胞活力,且呈时间和浓度依赖性。进一步细胞形态学观察、流式细胞术及DNA凝胶电泳分析显示,这些浓度的8-氯腺苷酸诱导RPMl8226细胞凋亡。Western blot检测表明,8-氯腺苷酸可通过影响细胞周期调控蛋白cylin E和CDK2的表达而干扰细胞增殖。结论：8-氯腺苷酸能够有效地抑制多发性骨髓瘤细胞生长并诱导其凋亡。     

热休克蛋白90抑制剂治疗多发性骨髓瘤的研究进展

多发性骨髓瘤是一种浆细胞异常增生的恶性肿瘤,占血液系统恶性肿瘤的第二位.在过去的15年,多发性骨髓瘤的治疗有了明显的进展,以硼替佐米为代表的蛋白酶体抑制剂和以沙利度胺及其衍生物雷利度胺为代表的免疫调节药物等多种靶向药物的临床应用为多发性骨髓瘤患者的治疗提供了新的治疗方法.尽管如此,多发性骨髓瘤目前仍然不可治愈,因此需探索新的治疗方法以改善多发性骨髓瘤患者的生存和预后.研究表明·热休克蛋白90在骨髓瘤细胞中高表达,已成为多发性骨髓瘤治疗的一个新靶点,热休克蛋白90抑制剂可诱导骨髓瘤细胞凋亡,并能增加其他靶向治疗药物的敏感性.     

多西他赛对人骨髓瘤细胞RPMI8226增殖与凋亡的影响

本研究旨在观察多西他赛对人骨髓瘤细胞系RPM18226增殖和凋亡的影响,探讨其作用的分子机制。采用MTT法检测骨髓瘤细胞增殖抑制率,光学显微镜及电子显微镜观察多西他赛对骨髓瘤细胞形态的影响,Annex-in-VFITC／PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率,PI染色流式细胞术检测骨髓瘤细胞周期分布情况,半定量RT-PCR检测多西他赛对B观-2、caspase-8及caspase-3mRNA表达影响,Westernblot法检测多西他赛作用前后骨髓瘤细胞BCL-2蛋白表达变化。结果显示：0．25-8．0μg／ml终浓度的多西他赛均可抑制RPM18226细胞增殖,抑制率呈时间（r=0．927）和浓度（r=0．726）依赖性;多西他赛处理组光学显微镜下可见细胞数量明显减少,排列紊乱,高倍镜可见凋亡细胞,偶见坏死细胞;电子显微镜下可见细胞典型凋亡改变以及少数坏死细胞;多西他赛可明显诱导骨髓瘤细胞凋亡（P〈0．01）,主要将细胞阻滞于G2／M期（P〈0．01）,作用48h时BCL-2mRNA与BCL-2蛋白表达量减少（P〈0．05）,caspase-8、caspase-3mRNA表达量增加（P〈0．05）。结论：多西他赛通过诱导细胞凋亡可抑制骨髓瘤细胞增殖,其诱导细胞凋亡可能与细胞周期阻滞,激活细胞内、外源性凋亡通路有关。     

NF-κB信号调节与多发性骨髓瘤治疗新药作用机制的关系

NF-kB是一种多功能的核转录因子。在多发性骨髓瘤（MM）中，它的持续活化可以增强黏附分子表达，促进其介导的白细胞介素-6的分泌，促使骨髓瘤细胞增殖，并通过减弱死亡受体介导的信号途径，保持线粒体稳定性等途径抑制骨髓瘤细胞凋亡，导致疾病发生。而以NFWB为靶向的药物可以直接抑制其活性，抑制增殖，诱导凋亡，从而为MM的治疗提供了新前景。本文就NF-kB在MM发病中的作用以及以其为靶向治疗的研究作一综述。     

γδT细胞调控多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡和自噬的作用

目的:探讨γδT细胞对多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡及自噬的影响。方法:采用Ficoll分离法获取健康成年人外周血单个核细胞(PBMNC),体外刺激诱导获取γδT细胞,流式细胞术检测γδT细胞纯度。收集γδT细胞与骨髓瘤细胞RPMI-8226或U-266按照不同效靶比于transwell小室中分别共培养。采用CCK-8法检测细胞增殖,通过流式细胞术和Western blot方法检测细胞周期分布和细胞凋亡情况,通过Western blot方法检测自噬相关蛋白表达情况。结果:PBMNC在体外刺激诱导下,可获得大量扩增的γδT细胞。γδT细胞具有抑制骨髓瘤细胞增殖的作用,同时诱导细胞周期阻滞并促进细胞的凋亡,且作用具有效靶比依赖性。此外,γδT细胞可增强骨髓瘤细胞的自噬能力,抑制骨髓瘤细胞PI3K、P-AKT和P-mTOR的表达,上调AMPK和Beclin-1的表达水平。结论:γδT细胞在体外具有抑制骨髓瘤细胞RPMI-8226或U-266的增殖,促进其凋亡和增强自噬的作用。其作用机制可能是通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,和/或激活AMPK/Beclin-1信号通路。     

As2O3对KM3细胞端粒酶及其逆转录酶作用的研究

为了探讨三氧化二砷(As2O3)对多发性骨髓瘤(MM)细胞株KM3的作用及其可能机制，用台盼蓝拒染法检测细胞生长抑制率，用光镜、透射电镜观察形态变化，用DNA电泳观察As2O3诱导KM3细胞凋亡，用流式细胞仪检测细胞周期的变化，用TRAP-PCR-EUSA法检测As2O3作用KM3细胞后的端粒酶活性变化，并用半定量RT-PCR法检测端粒酶逆转录酶(hTERTmRNA)的表达水平。结果表明：As2O3抑制KM3细胞的生长，具有诱导细胞凋亡的作用；As2O3阻滞细胞于G2期；As2O3可抑制KM3细胞的端粒酶活性和hTERTmRNA的表达，且hTERTmRNA下降趋势与端粒酶活性相一致。结论：端粒酶及其逆转录酶活性的下调可能在As2O3诱导KM3细胞凋亡的过程中起了重要作用。     

2-甲氧基雌二醇对骨髓瘤细胞系增殖与凋亡的影响

为了探讨2-甲氧基雌二醇对骨髓瘤细胞系增殖及凋亡的影响,并观察其与地塞米松、反应停、三氧化二砷、唑仑膦酸钠等药物联合时的协同作用,采用台盼蓝染色法检测细胞活力,应用BrdU掺入法检测浆细胞标记指数(PCLI),DNA片段原位末端标记(TUNEL法)检测凋亡细胞.药物协同作用判断标准按金氏公式计算Q值.结果表明,7株骨髓瘤细胞系NCI-H929、HS-sultan、KM3、SK0-007、CZ-1、U266、LP-1经1、4、8、12、16 μmol/L 2-甲氧基雌二醇分别作用12、24、36和48小时后细胞活力明显受抑制,呈现时间剂量依赖性,经统计学分析,差异显著(P＜0.05).各细胞系对2-甲氧基雌二醇敏感性不同,其IC50介于(20.8±0.27)μmol/L与(34.1±0.57)μmol/L之间.1、4、8、12、16 μmol/L 2-甲氧基雌二醇分别作用12、24、36和48小时可诱导骨髓瘤细胞系凋亡,凋亡率介于9%-33%之间,呈现时间和剂量依赖性,经统计学分析,差异显著(P＜0.05).经12 μmol/L 2-甲氧基雌二醇作用24小时后浆细胞标记指数(PCLI)由作用前平均(30.14±4.28)%下降到作用后的(14.71±6.27)%,差异显著(P＜0.05).2-甲氧基雌二醇与药物联合作用后计算Q值介于1.13-1.43之间,具有协同作用.结论2-甲氧基雌二醇可抑制骨髓瘤细胞生长,并可诱导骨髓瘤细胞凋亡,与地塞米松、反应停、三氧化二砷、唑仑膦酸钠联合使用具有协同作用.