铁皮石斛种子接菌共生萌发抑制差减杂交文库的构建及序列分析

 目的 研究铁皮石斛（Dendrobium officinale）种子接菌共生萌发差异基因表达谱特征。方法 采用抑制差减杂交（SSH）技术,分别以接菌及未接菌培养5周的铁皮石斛种子cDNA作为检测子与驱赶子,构建铁皮石斛种子接菌共生萌发抑制性消减cDNA文库。结果 对部分克隆产物测序,经GenBank中BLASTx同源比较后,进行基因功能注释,得到100个具有植物同源性的表达序列标签（EST）,主要涉及细胞与染色体结构、RNA合成、信号转导、能量与代谢、蛋白质合成与降解及细胞防御等。随机挑选5个目标基因,实时荧光定量PCR分析发现这5个基因在共生萌发的种子中均上调表达。结论 铁皮石斛种子接菌共生萌发涉及多种途径相关基因表达调控,本实验为兰科植物种子萌发分子机制研究奠定基础。     

铁皮石斛DoMAPK5基因的克隆及表达特征分析

目的克隆及分析铁皮石斛DoMAPK5基因的表达特征。方法利用cDNA末端快速克隆技术(RACE),首次从铁皮石斛接菌共生萌发种子中分离得到1个新的MAPK基因,对其编码蛋白的理化性质、保守结构域等特征及进行了分析。并应用荧光定量PCR对DoMAPK5基因在石斛不同组织中表达模式分析。结果 DoMAPK5基因(Gen Bank注册号KJ472788),全长为2184bp、编码一条597个氨基酸的肽链,预测分子量为67.39KDa,等电点为9.28,编码的蛋白均不含信号肽,在210-232位具有23个氨基酸的跨膜域,具有MAPK蛋白家族保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的结构域及MAPK位点。序列比对及系统发育树分析结果表明DoMAPK5基因与葡萄MAPK基因均具有很高的相似性(82%),与水稻MAPK10亲缘关系最近。应用荧光定量PCR对DoMAPK5基因在石斛不同组织中表达模式分析显示,该基因在未接菌的植物组织中属组成型表达,在接菌共生萌发的植物组织中显著上调,为未萌发种子的10.49倍。结论 DoMAPK5在植物组织中属于组成型表达,具有受菌根真菌诱导表达的特征。     

铁皮石斛中性/碱性转化酶(DoNI2)基因的克隆和表达分析

目的克隆珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛中性/碱性转化酶(alkaline/neutral invertase,NI)家族基因成员,并对其进行定量表达以及生物信息学分析。方法采用转录组测序和RACE技术相结合克隆NI基因的cDNA序列,利用生物信息学工具对其进行分析,并采用实时荧光定量PCR方法检测NI基因在铁皮石斛根、茎和叶中的表达情况。结果克隆获得1个新的铁皮石斛NI基因,命名为DoNI2(Gen Bank登录号KY794404),全长2 397 bp,开放阅读框(ORF)为1 836 bp,编码611个氨基酸。DoNI2蛋白预测的理论相对分子质量和等电点分别为69 050和6.38,不稳定系数为42.95,疏水性系数为-0.232。DoNI2基因在铁皮石斛根、茎和叶中均有表达,其中在茎中表达量最高,根中最低。不同生长年限茎中DoNI2基因表达量与NI酶活性呈显著正相关。结论克隆了线粒体型的DoNI2基因的全长c DNA序列,为进一步阐明该基因在铁皮石斛蔗糖代谢途径中的重要作用奠定基础。     

铁皮石斛蔗糖合成酶基因的克隆及表达分析

目的:克隆铁皮石斛Dendrobium officinale蔗糖合成酶基因并对其表达分析,为研究铁皮石斛多糖合成与蔗糖合成酶活性关系及调控表达提供理论依据.方法:基于GenBank上已知的蔗搪合成酶基因SS同源序列,应用RT-PCR和RACE等方法,克隆铁皮石斛蔗糖合成酶基因全长,将目的片段转化大肠杆菌表达菌株BL21中,IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析.结果:成功克隆了铁皮石斛蔗糖合成酶基因,该基因cDNA全长2 424 bp,编码807个氨基酸(命名为DOSS1),登录号HQ856835,该基因氨基酸序列与兰科植物Moluara yellow(AF530568)同源性达到95%,与Oncidium goldiana(AF530567)同源性达到90%,与禾本科植物的SS基因同源性在80%以上.并对其进行大肠杆菌原核表达诱导,诱导的工程菌能明显表达出一条相对分子质量约为92×10(3)左右的蛋白质,与理论相对分子质量基本相符.结论:成功克隆了铁皮石斛蔗糖合成酶基因,并诱导出一条与理论蛋白相对分子质量相符的蛋白条带.     

铁皮石斛倍半萜合成酶基因的克隆与表达分析

目的克隆铁皮石斛Dendrobium officinale倍半萜合成酶(sesquiterpene synthase,SES)基因,分析其在铁皮石斛不同组织中的表达差异以及在信号分子茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)诱导下的表达模式。方法采用RACE技术克隆铁皮石斛SES(DoSES)cDNA全长,利用相关软件和在线网站对其进行生物信息学分析,并使用实时荧光定量PCR技术分析DoSES的表达模式。结果获得的DoSES cDNA序列(Gen Bank登录号为KX278311)全长1 890 bp,含有1个1 659 bp的完整开放阅读框(ORF),编码552个氨基酸的多肽链,与其他科属植物的同源性达到60%左右。DoSES基因在铁皮石斛茎中表达量最高,从高到低依次是叶、花、原球茎、根;且受到Me JA的诱导。结论克隆了铁皮石斛DoSES基因,为进一步研究调控铁皮石斛萜类代谢奠定了理论基础。     

铁皮石斛促生长内生真菌的筛选与鉴定

石斛生境中存在多种能够促进石斛生长的内生真菌,利用内生真菌与铁皮石斛组培苗共生培养,筛选对铁皮石斛组培苗有促生长活性的内生真菌,研究内生真菌对石斛根的侵染情况,采用形态鉴定和分子鉴定的方法对促生长活性内生真菌进行鉴定。结果表明,8株内生真菌对铁皮石斛苗有促生长作用,均能侵染铁皮石斛根,在铁皮石斛根的根被、外皮层、皮层中以菌丝或菌丝团的形式存在,不侵染内皮层和中柱,区别于有害真菌。8株活性内生真菌中,2株产孢真菌经形态鉴定,属于Pestalotiopsis,Eurotium属,6株不产孢真菌经分子鉴定,分别属于Pyrenochaeta,Coprinellus,Pholiota,Alternaria,Helotiales等5个属。促生长活性内生真菌与石斛组培苗共生培养,可促进石斛组培苗生长,对于缩短石斛生长周期,增加石斛中药材资源具有指导意义。     

赤芝FPS基因酵母单杂交文库构建及其上游转录因子的筛选

目的筛选赤芝三萜合成途径中法尼基焦磷酸合酶(farnesyl diphosphate synthase,FPS)基因的上游调控转录因子。方法首先克隆了FPS基因启动子,并连接至pAbAi质粒构建诱饵载体pAbAi-FPS。将pAbAi-FPS转化Y1H酵母感受态细胞构建诱饵菌。采用SMART技术构建赤芝酵母单杂交cDNA文库,再将纯化的双链cDNA、pGADT7-Rec共转化诱饵菌株,筛选FPS上游的转录调控因子。结果构建了含pAbAi-FPS的诱饵载体并筛选出诱饵菌株,构建了cDNA文库并转化诱饵菌株,筛选出阳性克隆37个,得到作用FPS基因上游的转录调控因子18个,包括转录因子3个、核糖体蛋白5个及其他家族蛋白10个。结论筛选出转录因子GlSNF2、GlMHR和GlZn2Cys6为调控FPS表达的候选基因,为深入研究FPS基因的表达调控机制奠定了研究基础。     

铁皮石斛DoSRK2E基因的克隆与表达分析

目的克隆铁皮石斛蔗糖非酵解1型相关蛋白激酶2(Sn RK2)家族基因,并进行生物信息学和表达分析。方法通过RT-PCR、RACE克隆铁皮石斛Sn RK2(DoSRK2E)基因c DNA全长,利用生物信息学软件预测基因编码蛋白的相对分子质量、等电点、结构域、跨膜结构、信号肽及亚细胞定位等;利用DNASTAR和MEGA进行多序列比对和系统发育关系重建分析;利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测基因组织表达模式。结果获得铁皮石斛DoSRK2E基因(GenBank登录号API65110),cDNA全长1 795 bp,包含1个1 086 bp的完整开放阅读框,编码蛋白相对分子质量40 850,等电点4.80,无信号肽和跨膜域,包含1个蛋白激酶结构域、1个ATP结合位点和1个Ser/Thr蛋白激酶活化位点,预测定位在内质网膜上;DoSRK2E蛋白与植物SnRK2蛋白序列高度一致,系统发育位置位于SnRK2亚家族的分支III,与拟南芥At SnRK2.6的亲缘关系最近;DoSRK2E基因在铁皮石斛根中表达量最高,茎中次之,叶中最低。结论首次从珍稀濒危药用植物铁皮石斛中克隆得到SnRK2家族基因DoSRK2E,对其分子特性与组织表达模式进行了分析研究,为进一步揭示该基因在铁皮石斛逆境胁迫中的作用机制提供基础。     

用抑制性差减杂交构建As2O3诱导的NB4 细胞凋亡相关基因文库

目的: 构建三氧化二砷(As_2O_3)诱导的急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞凋亡相关基因文库.方法:用含4 μmol·L~(-1)As_2O_3和正常培养基培养NB4细胞24 h,抽提总RNA,经逆转录酶合成双链cDNA,分别以砷诱导凋亡组和对照组作为tester和driver,进行双向抑制性差减杂交(supptess-ion sublxactive hybridization,SSH),筛选As_2O_3诱导的NB4细胞凋亡相关基因,将差异表达基因进行PCR扩增并与pGEM-Teasy克隆载体连接,转化DH5 α大肠杆菌,经蓝白斑筛选获得白色阳性克隆,PCR扩增出未知基因片段.结果:成功构建了分别代表在NB4细胞中表达上调和下调的基因文库.结论: 经双向抑制性差减杂交获得了NB4细胞差异表达基因文库,为克隆NB4细胞凋亡相关基因奠定了基础.     

铁皮石斛的SCAR标记研究

目的:建立快速准确的铁皮石斛DNA分子鉴定方法。方法:采用RAPD方法对11种石斛进行多态性分析,获得铁皮石斛特异的RAPD分子标记片段;经克隆、测序,重新设计一对特异性引物转化成稳定的SCAR标记。结果:获得了1条稳定扩增的铁皮石斛特异的片段DS-302,序列测定结果表明,全长302 bp,通过BLAST搜索、同源性比较,结果表明该段序列与已知数据库中的所有序列无显著同源性。根据该序列设计1对特异引物,对11种石斛进行扩增,可在铁皮石斛中扩增获得约300 bp的片段,而石斛属其他种未出现该条带。结论:DS-302成功转化为SCAR分子标记,可对铁皮石斛进行快速有效的鉴定。     

三种内生真菌对铁皮石斛、金线莲生长影响的研究

目的研究开唇兰小菇、石斛小菇、兰小菇等3种小菇属内生真菌对兰科濒危药用植物铁皮石斛、金线莲生长的促进作用.方法采用植物无菌原球茎及试管苗与真菌进行双重培养,观测原球茎增殖及苗的生长情况.结果接种3种内生真菌后,铁皮石斛苗的生长量高于对照3～5倍,石斛小菇、兰小菇对铁皮石斛原球茎增殖也有明显促进作用(P＜0.05);接种3种真菌的金线莲苗,侧芽及侧根数均显著高于对照.结论3种小菇属内生真菌能够促进铁皮石斛幼苗生长,促进金线莲侧芽及侧根的萌发,对铁皮石斛、金线莲的成功栽培具有实际应用价值.     

稀土微肥对铁皮石斛试管苗壮苗的影响

目的研究稀土微肥对铁皮石斛试管苗壮苗的影响。方法通过正交试验,以石斛小苗为外植体,培养在附加了3种不同稀土元素组合的1/2MS 20%的香蕉提取物的培养基上进行培养。结果3种稀土元素中的镧(La)对试管苗增质量、叶绿素b、总叶绿素和石斛多糖的量都有显著的影响;3种稀土元素都对试管苗的叶片数、根数、分蘖数以及叶绿素a的量影响不显著。结论为铁皮石斛试管苗的壮苗以及品质的提高提供了科学的依据。     

铁皮石斛原球茎液体悬浮培养的研究

目的研究铁皮石斛Dendrobiumcandidum原球茎液体悬浮培养的可行性以及接种量和培养液体积对原球茎生长的影响。方法利用完全随机实验设计和正交试验设计研究不同基本培养基、接种量和培养液体积对原球茎生长的影响。结果无论鲜重还是干重,铁皮石斛原球茎在液体培养基上均极显著好于固体培养基(P<0.001)。不同基本培养基对铁皮石斛原球茎生长影响的研究表明,培养天数为30d时,对于鲜重67-V极显著好于B5(P<0.01),B5极显著好于1/2MS(P<0.01),1/2MS显著好于MS(P<0.05);对于干重67-V与B5没有显著性差异(P>0.05),B5极显著好于1/2MS(P<0.01),1/2MS极显著好于MS(P<0.01)。接种量和培养液体积对原球茎生长影响的研究表明,接种量影响最大,体积其次,互作最小,若不考虑互作,对于鲜重和干重,最佳处理为接种量6.194g/瓶 培养液体积150mL/瓶或100mL/瓶;对于干重,若考虑互作,接种量为6.194g/瓶时,应选培养液体积150mL/瓶或100mL/瓶,接种量为3.102g/瓶时,应选培养液体积150mL/瓶或100mL/瓶,接种量为1.693g/瓶时,应选150mL/瓶或50mL/瓶。结论液体悬浮培养对铁皮石斛原球茎的生长有利,获得了最佳基本培养基、接种量和培养液体积的最佳搭配方案,表明通过液体悬浮培养生产铁皮石斛原球茎具有较好的开发应用前景。     

铁皮石斛原球茎与原药材免疫调节作用的比较研究

目的:比较研究铁皮石斛组织培养原球茎与原药材对免疫功能的作用及急性毒性反应。方法;用白细胞计数法、免疫器官重量法、碳粒廓清法、淋巴细胞转化试验来研究药物对环磷酰胺造成小鼠免疫功能低下的对抗作用;以最大耐受量的方法研究药物的急性毒性。结果:铁皮石斛组织培养原球茎有升高环磷酰胺模型小鼠外周血白细胞数,增加模型鼠胸腺或脾脏指数,增强巨噬细胞的吞噬功能,促进模型鼠体内淋巴细胞转化的作用。口服给予药物量54.56 g生药/kg,小鼠仍能耐受。这些作用与原药材相似。结论:铁皮石斛组织培养原球茎与原药材均具有提高免疫功能作用,两者作用强度相似,最大耐受量相当于人临床用药量的227倍。     

铁皮石斛试管培养物多糖含量测定

目的:比较铁皮石斛试管培养物与原药材的多糖含量.方法:用比色法测定石斛多糖的含量.结果:铁皮石斛原药材含多糖量最高,其次是原球茎和试管苗.结论:铁皮石斛原球茎多糖含量比试管苗多糖含量高.     

真菌诱导子处理的铁皮石斛原球茎HPLC-MS指纹图谱分析

 目的比较真菌诱导子处理的铁皮石斛原球茎与对照原球茎、铁皮石斛在化学成分上的差别。方法用高效液相色谱-质谱联用技术,比较诱导子处理的铁皮石斛原球茎、对照原球茎和人工栽培的铁皮石斛的氨性氯仿提取物中各成分的色谱峰面积积分值和相对积分面积。结果诱导子处理的铁皮石斛原球茎和对照原球茎中共有26个相同的化学成分,相对积分面积和分别为98.47%和97.54%,其中有19个成分在诱导子处理原球茎中的色谱峰面积积分值高于对照原球茎,它们中分别有5个和6个特有的成分,其中生物碱类成分分别为3个和1个。诱导子处理的原球茎和铁皮石斛中共有25个相同的化学成分,相对积分面积和分别为95.72%和96.44%,其中有17个成分在人工栽培的铁皮石斛中的色谱峰面积积分值高于诱导子处理的原球茎,有8个成分在诱导子处理的原球茎中的色谱峰面积积分值高于铁皮石斛,这其中有7个是生物碱类的成分。结论真菌诱导子处理后,没有改变原球茎的化学背景,但能提高原球茎中化学成分的含量。人工栽培的铁皮石斛的质量明显优于诱导子处理的原球茎。原球茎中的生物碱类成分对诱导作用较敏感。诱导子处理能促进原球茎中生物碱类成分的产生或特异性积累。     

霍山三种石斛茎中抗氧化酶等活性物质的测定

 目的：测定霍山石斛茎中抗氧化酶等活性物质，探讨其合理的采收标准。方法：采用751GW紫外-可见分光光度计测定霍山三种石斛茎中SOD,CAT,POD酶活性;可溶性蛋白质含量及MDA的含量。结果：霍山石斛三年茎SOD,CAT,POD酶活性及可溶性蛋白质含量最高，抗氧化能力强；而铁皮石斛、铜皮石斛二年茎抗氧化能力最强，三年茎已衰老。结论：霍山石斛可采用“存三去四”的采收标准；而铁皮石斛、铜皮石斛则采用“存二去三”的采收标准。