前列腺腺癌基因组启动子超甲基化谱研究

目的 初步建立前列腺腺癌基因组超甲基化谱,为前列腺腺癌特异性基因的超甲基化研究提供理论依据.方法 本研究利用激光捕获显微切割技术和甲基化DNA免疫共沉淀芯片技术,初步建立3例前列腺腺癌及其癌旁腺体基因组启动子区甲基化谱,通过组间比较,筛选出一组前列腺腺癌基因组启动子区超甲基化谱.将筛选出的基因上传至Molecule Annotation System进行在线GO分析和Pathway分析.结果 前列腺腺癌和癌旁腺体分别有7459个和7182个启动子区发生超甲基化,超甲基化基因占芯片总基因的33.1％和31.8％,其中65.6％的超甲基化启动子区为高CpG密度启动子区.前列腺腺癌基因组超甲基化基因共273个.生物信息学分析提示启动子区超甲基化的基因涉及多个分子功能、生物过程和信号通路.结论 前列腺腺癌和癌旁腺体之间存在大量启动子超甲基化改变,前列腺腺癌的发生发展可能是一个复杂的表观遗传学过程.     

Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因启动子甲基化在结直肠癌筛查及早期诊断中的临床应用

目的探讨Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因启动子甲基化在结直肠癌（CRC）筛查及早期诊断中的临床应用。方法选择收治的55例CRC患者为观察组，55例健康体检人群为对照组，分别取观察组CRC组织、术前血标本、术前粪便标本以及对照组正常结直肠组织、外周血样本、粪便标本，使用QIAGEN试剂盒提取结直肠组织基因组DNA以及血液、粪便中脱落细胞DNA，甲基化特异性PCR（MSP）法检测以上4种基因启动子甲基化情况；RT-PCR法检测mRNA水平，Western-blot法检测蛋白水平；进而比较两组受检者以上4种基因启动子甲基化阳性及基因表达情况。结果共提取组织、血液、粪便脱落细胞DNA110例，最终验证存在人基因组DNA并完成MSP110例。观察组粪便脱落细胞DNA中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因启动子甲基化阳性率分别为69.1%、63.6%、54.5%和56.4%，4种基因总甲基化阳性率为90.9%；对照组粪便脱落细胞DNA中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因启动子甲基化阳性率分别为0.0%、1.8%、0.0%和1.8%，4种基因总甲基化阳性率为3.6%。粪便脱落细胞DNA中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因启动子甲基化对21例Ⅰ~Ⅱ期CRC的发现率分别为80.9%,71.4%,57.1%和57.1%，联合检测4种基因启动子甲基化对Ⅰ~Ⅱ期CRC的发现率为90.5%。CRC患者粪便脱落细胞DNA中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因启动子甲基化与患者性别、年龄、远处转移、肿瘤部位、TNM分期及淋巴结转移均未见相关（均P＞0.05）。观察组与对照组结直肠组织、血标本、粪便标本中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因启动子甲基化阳性率比较，差异均有统计学意义（均P＜0.01）。两组受检者结直肠组织中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因启动子甲基化后的mRNA及蛋白水平均有所下调，观察组与对照组的电脉图差异明显。结论MSP法检测结直肠组织、血液及粪便脱落细胞DNA中Wnt6、Wnt3A、LEF1和FZD1基因启动子甲基化是CRC早期筛查的有效方法。     

胃癌形成过程中端粒酶反转录酶基因表达及启动子甲基化状态分析

目的探索端粒酶反转录酶(hTERT)基因表达情况及启动子区甲基化状态在胃癌形成过程中的变化情况。方法提取正常胃黏膜、胃癌前病变和胃癌3组组织样本的基因组DNA。用聚合酶链反应(PCR)特异性扩增其hTERT基因,用琼脂糖凝胶电泳检测3组组织样本中hTERT基因表达的阳性率;用亚硫酸氢盐修饰上述各组标本DNA,然后检测修饰后的hTERT序列:启动子区CpG位点,未发生甲基化的胞嘧啶(C)变为尿嘧啶(U);在启动子区不含CpG位点的位置,进行引物设计,然后利用PCR进行扩增。扩增产物序列与原序列比对,观察启动子区甲基化情况。结果 hTERT基因在胃癌组表达的阳性率最高,在癌前病变组表达的阳性率明显降低,而在正常胃黏膜组中不表达,3组组织样本hTERT表达阳性率比较差异均有统计学意义(P<0.05)。hTERT启动子区甲基化程度在胃癌组中最高,在胃癌前病变组中明显降低,而在正常胃黏膜中甲基化程度最低,3组组织样本hTERT启动子区甲基化程度比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 hTERT启动子区甲基化程度在正常胃黏膜、胃癌前病变和胃癌中依次升高,故hTERT启动子区甲基化程度的变化可作为胃癌形成过程中肿瘤早期诊断的潜在分子生物学标志。     

基于生物信息学分析哮喘患者鼻黏膜上皮细胞DNA及α肌动蛋白2甲基化差异性表达

目的: 研究哮喘患者鼻黏膜上皮细胞中全基因组甲基化水平及α肌动蛋白2(actin alpha 2, ACTA2)基因启动子区域甲基化水平改变。方法: 利用甲基化850K芯片法检测6例哮喘患者与5例健康者鼻黏膜上皮细胞中全基因组甲基化水平,进行生物功能分析后选择ACTA2为目的基因,以重亚硫酸盐测序法检测12例哮喘患者及12例健康者ACTA2启动子区域甲基化水平。结果： 850K芯片测序结果显示,哮喘患者所有常染色体均存在不同程度的甲基化修饰,大部分发生在基因体及基因间区,10%~20%发生在启动子区,且高甲基化和低甲基化改变可存在于同一染色体上;重亚硫酸盐法测序示与健康对照组相比,哮喘组ACTA2基因启动子区出现明显高甲基化改变(P=0.001)。结论： 哮喘患者鼻黏膜上皮细胞各染色体均出现广泛甲基化修饰,ACTA2基因启动子区域出现高甲基化改变。     

多氯联苯暴露对着床期子宫内膜组织特定基因甲基化的影响

目的:探讨多氯联苯(PCB118)慢性暴露对小鼠着床期子宫内膜特定基因启动子区甲基化水平及基因表达的影响。方法:将40只3周大CD-1小鼠随机分为4组:空白对照组,1μg/kg PCB118剂量组,10μg/kg PCB118剂量组,100μg/kg PCB118剂量组。各组灌胃1个月后,行促排卵合笼,于妊娠第4.5天断椎处死小鼠,留取子宫内膜组织。采用甲基化DNA免疫共沉淀-实时定量PCR(MeDIP-qPCR)检测特定基因启动子区甲基化水平;实时定量RT-PCR检测特定基因mRNA表达水平。结果:MeDIP-qPCR显示,相对于空白对照组,剂量组中PCDH17、ITGB8、FREM2及FGF4这4个基因启动子呈现高甲基化,与我们前期DNA甲基化芯片结果一致,有显著统计学差异(P<0.05)。Real-time PCR显示,PCDH17、ITGB8、FREM2及FGF4基因的mRNA水平在各剂量组均显著降低(P<0.05),与其启动子区DNA甲基化水平呈现负相关。结论:慢性PCB118暴露诱导着床期特定基因启动子区发生高甲基化,进而引起这些基因表达沉默,这可能是PCB118生殖毒性产生的分子机制之一。     

肿瘤抑制基因异常甲基化与胃癌的研究进展

表遗传学是研究在DNA序列没有改变的情况下,所发生的可遗传性基因表达的改变,其中DNA甲基化是研究最多、最深入的一种表遗传学表达机制。CpG岛是人类基因组中富含CpG二核苷酸的DNA序列,主要位于基因启动子区,大小约为100～1 000 bp,与约60%的编码基因相关。DNA中CpG岛甲基化可导致抑癌基因的表观遗传学转录失活,直接参与肿瘤的发生机制。我们简要综述了DNA甲基化在胃癌中的研究进展。     

急性髓性白血病病人外周血中RIZ1的表达变化与启动子区甲基化相关性的研究

目的:研究急性髓性白血病病人外周血中肿瘤抑制基因RIZ1的表达状况和该基因启动子区甲基化状态及两者之间的关系.方法:以37例初发急性髓性白血病病人和15例正常人外周血标本为研究对象.RT-PCR检测RIZ1 mRNA水平,甲基化特异性PCR(MSP)检测RIZ1基因启动子区甲基化状态.结果:急性髓性白血病病人标本与正常人标本比较,RIZ1基因的表达下降,差异具有统计学意义(P<0.05).急性髓性白血病标本中RIZ1基因启动子区甲基化率为29.7%(11/37).存在甲基化的急性髓性白血病病人外周血标本中,RIZ1基因表达缺失或降低.结论:RIZ1基因表达下降与急性髓性白血病的发生有关, 其部分机制在于基因启动子区甲基化.     

粪便中MGMT，p16INK4A及ECAD基因启动子甲基化检测在结直肠癌诊断中的价值

目的：探讨粪便中p16INK4A、ECAD及MGMT基因启动子甲基化在结直肠癌诊断中的应用价值。方法选择我院老年病科2014年2月至2015年11月收治的65岁以上老年健康者50例(对照组)、结直肠镜检查证实良性结直肠疾病者41例(良性肠病组)和结直肠癌患者46例(肠癌组)为研究对象。采用表观遗传学方法应用甲基化特异PCR对上述患者粪便中p16INK4A、MGMT和ECAD基因启动子DNA甲基化进行检测,判断上述标本中各基因启动子的甲基化水平。根据p16INK4A、MGMT和ECAD基因启动子DNA甲基化水平,评价其作为诊断结直肠癌的敏感性和特异性。结果对照组、良性肠病组和肠癌组p16INK4A基因启动子DNA甲基化率分别为14.0%、24.4%和71.7%;MGM基因甲基化率分别为16.0%、14.6%和54.3%;ECAD基因甲基化率分别为12.0%、19.5%和65.2%。上述基因启动子甲基化率在肠癌组明显高于对照组和良性肠病组,差异均有统计学意义(P<0.05);p16INK4A、MGMT和ECAD诊断肠癌的敏感性分别为0.72、0.54和0.65,特异性分别为0.76、0.75和0.80。结论 p16INK4A、MGMT和ECAD基因启动子甲基化发生率在肠癌患者粪便中显著增高,可作为肠癌诊断的分子标志物。     

乳腺癌雌激素受体α基因启动子甲基化与其蛋白表达的关系

目的：检测乳腺癌雌激素受体α（estrogen receptor α,ERα）基因启动子区CpG岛甲基化状态,探讨乳腺癌ERα启动子甲基化与其蛋白表达及临床病理的关系。方法：采用免疫组化EnVisionTM二步法检测20例正常乳腺组织、44例乳腺癌组织ERα基因的表达,同时运用甲基化特异性PCR（Methylation-Specific PCR,MSP）及测序法分别检测ERα基因启动子A区和B区CpG岛的甲基化状态。结果：32例ERα阳性乳腺癌组织中,ERα启动子A区、B区甲基化率分别为28.2%和18.8%。12例ERα阴性乳腺癌组织中,ERα启动子A区、B区甲基化率分别为66.7%和58.3%。ERα阳性乳腺癌组、ERα阴性乳腺癌组、乳腺癌组的ERα启动子A、B区甲基化率均较正常组显著增高（P〈0.05）;ERα阴性乳腺癌组的ERα启动子A、B区甲基化率较ERα阳性乳腺癌组均显著增高（P〈0.05）。乳腺癌组织ERα表达与启动子区甲基化之间呈显著负相关。结论：乳腺癌组织ERα基因表达沉默与其启动子A区、B区CpG岛甲基化相关,后者有可能成为乳腺癌预后不良的分子检测指标。     

肝癌病人癌组织与血浆p16及APC基因甲基化检测及意义

目的检测肝细胞性肝癌(HCC)病人癌组织及血浆中多肿瘤抑制因子p16和结肠腺瘤样息肉基因(APC)的基因启动子区异常甲基化状态,并探讨其临床意义。方法应用实时荧光PCR技术,检测86例HCC病人癌组织、癌旁正常组织及血浆标本中p16、APC基因启动子区异常甲基化状态,以24例正常肝组织作为对照。结果 24例正常肝组织未检出p16和APC基因的异常甲基化。癌组织p16基因甲基化率明显高于癌旁正常组织和对应的血浆标本(χ2=67.48、6.72,P<0.05)。癌组织中APC基因甲基化率明显高于癌旁正常组织和对应的血浆标本(χ2=18.03、29.16,P<0.05)。肝癌组织及对应血浆标本p16、APC基因甲基化的一致率分别为65.4%、43.3%。HBsAg阳性组肝癌组织及其对应血浆标本p16基因甲基化率显著高于HBsAg阴性组,差异有统计学意义(χ2=5.60、5.67,P<0.05)。结论 p16、APC基因启动子区异常甲基化导致的基因沉默可能与HCC的发生和发展密切相关。     

乳腺癌中-βcatenin、cyclinD1、c-myc表达及意义

目的探讨-βcatenin、cyclinD1、c-myc在乳腺癌中的表达及意义。方法应用免疫组化法检测119例乳腺癌,72例乳腺增生症和40例正常乳腺组织中-βcatenin、cyclinD1、c-myc的表达,并分析其与乳腺癌临床病理特征的关系。结果 40例正常乳腺组织中-βcatenin在细胞膜中强表达,cyclinD1及c-myc阴性表达。乳腺癌-βcatenin异常表达率78.15%(93/119)明显高于乳腺增生症44.44%(32/72),组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。乳腺癌cyc linD1阳性表达率57.98%(69/119)高于乳腺增生症33.33%(24/72),组间比较差异有统计学意义(P=0.001<0.01)。乳腺癌c-myc阳性表达率56.30%(67/119)高于乳腺增生症27.78%(20/72),组间比较差异有统计学意义(P<0.01)。-βcatenin异常表达、cyclinD1的过表达与淋巴结转移相关,c-myc的过表达与肿瘤大小和淋巴结转移相关。-βcatenin的异常表达与cyclinD1的表达相关,而与c-myc的表达无关。结论β-catenin异常表达是乳腺癌发生发展过程中的重要因子,这个过程可能是通过激活cyclinD1实现的。-βcatenin异常表达和cyclinD1、c-myc过表达可作为评估乳腺癌转移预后的指标。     

单基因变异与中国北方汉族2型糖尿病遗传易感性研究

目的在东亚和西非人群中分别进行的全基因组关联研究筛查出KCNQ1基因的rs2237892,AP3S1基因的rs3756555,MAN2A1基因的rs2015698为2型糖尿病易感位点,ALDH7A1基因rs2306617则与肥胖存在关联,而这些位点的作用尚未在中国北方汉族人群中进行探讨,本研究的目的是在中国北方汉族2型糖尿病患者中对这些可能的易感位点进行复制研究。方法应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对KCNQ1基因的rs2237892,AP3S1基因的rs3756555,MAN2A1基因的rs2015698,ALDH7A1基因的rs2306617在无血缘关系的537名2型糖尿病患者和510名对照者中进行基因分型。结果 rs2237892和rs3756555位点的C等位基因显著增加2型糖尿病遗传易感性(P=0.002,P=0.003)。该显著性关联在调整年龄、性别和体质量指数(body mass index,BMI)后仍然存在(OR=1.51,95%CI:1.17～1.95,P=0.002;OR=1.48,95%CI:1.14～1.92,P=0.003)。未能发现rs2015698和rs2306617与2型糖尿病存在关联。通过对对照人群研究发现,调整年龄、性别和BMI后,rs2237892位点CC基因型空腹血糖显著高于其他2基因型(P=0.020);与其他两基因型相比,rs3756555位点CC基因型BMI略有降低(P=0.050)。结论 KCNQ1基因和AP3S1基因遗传变异与中国北方汉族2型糖尿病遗传易感性相关。     

参七复脉片质量控制标准的研究及确定

目的研究并制定参七复脉片的质量控制标准。方法采用薄层鉴别法定性鉴别处方中的麦冬和太白三七;采用高效液相色谱法测定处方中凤尾三七的主要成分红景天苷的含量。结果定性鉴别分离度好,专属性强;红景天苷在0.518～3.626μg范围内呈良好的线性关系,相关系数r2=0.999 8,加样回收率为97.67%(RSD为0.87%)。结论所建立之方法准确可靠、灵敏度高、专属性强,可用于参七复脉片的质量控制。     

氯化钴预处理对缺氧预适应小鼠海马组织HIF-1α表达的影响

目的检测氯化钴预处理后小鼠海马组织缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)在急性重复氧过程中的变化及其可能的机制。方法用数字表法将Balb/C小鼠随机分为氯化钴实验组和生理盐水对照组,2组动物分别在实验前3 h注射氯化钴和生理盐水,进行0次(H0)、1次(H1)、4次(H4)缺氧暴露,随即分别取海马组织,用Western blot及EMSA法检测HIF-1α蛋白质含量及HIF-1 DNA结合活性。结果生理盐水预处理后,小鼠的缺氧耐受时间逐次显著递增;氯化钴预处理后缺氧耐受时间恒定增高。氯化钴预处理H0、H1、H4组海马组织的HIF-1α蛋白质含量差异未见统计学意义,但HIF-1 DNA结合活性在H1组升高、H4组降低。生理盐水预处理组海马组织的蛋白质含量及HIF-1 DNA结合活性在H0、H1、H4组均依次增加。结论氯化钴预处理能显著增强小鼠对缺氧的耐受能力、激活海马组织中的HIF-1,但其分子机制可能与急性重复缺氧暴露增强缺氧耐受力的机制不同。     

低氧诱导VEGF基因表达载体治疗家兔肢体缺血性疾病的实验研究

目的探讨低氧诱导血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因表达载体对家兔肢体缺血性模型的基因治疗效果。方法通过切除髂外动脉远端和股动脉分支制作家兔左后肢缺血模型,术后立即将含VEGF基因的低氧诱导表达载体6HRE-pcDNA-VEGF165多点注射至患侧肌肉内,并于不同时间点进行后肢胫动脉血压测量和动脉血管造影。结果与对照组相比,应用低氧诱导VEGF基因表达载体的基因治疗组胫动脉血压恢复快;动脉血管造影显示基因治疗组动脉充盈早于对照组,新生血管多于对照组,早于对照组建立侧支循环。结论低氧诱导VEGF基因表达载体可促进家兔肢体缺血模型新生血管的形成,改善缺血肢体的血液循环。     

中国人群pitx3基因多态性与晚发散发性帕金森病的相关研究

目的分析pitx3基因多态性与晚发散发性帕金森病的遗传关联。方法使用连接酶检测反应(LDR)法,分析509例晚发散发性帕金森病(Parkinson's disease,PD)患者和494例正常对照者中pitx3基因单核苷酸多态性(SNPs)位点rs2281983、rs4919621和rs3758549。随机选取10%样品直接测序进行验证。结果 pitx3基因SNP位点rs2281983、rs4919621和rs3758549的基因频率在晚发散发性帕金森病患者和正常对照组间差异无统计学意义。3个SNP位点与晚发散发性PD无关联。结论中国人群中,pitx3不是晚发散发性帕金森病的易感因素。     

印迹基因PHLDA2在孕妇子痫前期胎盘中的差异表达和甲基化状态

了解印迹基因PHLDA2在孕妇子痫前期胎盘中表达水平及甲基化状态变化,我们收集2017年6月—2018年12月于复旦大学附属妇产科医院分娩产妇的临床资料和胎盘组织,分为早发型子痫前期4例,晚发型子痫前期16例,正常对照组30例.采用Real-time PCR和焦磷酸甲基化测序检测和比较三组胎盘组织中印迹基因PHLDA2...     

香烟烟雾及银杏叶对哮喘大鼠气道TGF-β_1表达的影响

目的探讨香烟烟雾(cigarette smoke,CS)及银杏叶对哮喘大鼠气道组织转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA和蛋白表达的影响。方法30只Wistar大鼠随机分为5组:1)哮喘烟熏组(A组);2)哮喘组(B组);3)哮喘烟熏+银杏叶治疗组(C组);4)哮喘+银杏叶治疗组(D组);5)对照组(E组)。用蛋白印迹法(Western blot)及反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测各组气道组织中TGF-β1蛋白和mRNA表达的变化。结果香烟烟雾可显著增加哮喘大鼠气道组织TGF-β1mRNA和蛋白的表达,银杏叶则可显著抑制其表达。结论香烟烟雾使哮喘大鼠气道组织TGF-β1的表达上调,提示银杏叶可能通过降低TGF-β1的表达发挥抑制哮喘的作用。     

肠球菌GyrA基因突变和多重耐药泵与氟喹诺酮耐药性关系研究

目的探究肠球菌GyrA基因突变和多重耐药泵与氟喹诺酮类药物耐药性的关系。方法全部试验菌株使用VITEK 2-Compact仪器和GPI卡进行鉴定。通过PCR和单链构象多态性(SSCP)法检测对左氧氟沙星(Levo)与环丙沙星(Cip)耐药的30株粪肠球菌和10株屎肠球菌GyrA基因有无碱基发生突变,并通过基因测序确定其突变类型。检测了30株粪肠球菌在M-H琼脂中加入终浓度为20μg/mL利血平后Cip MIC值的改变。结果 PCR-SSCP分析结果表明40株对Levo和Cip同时耐药肠球菌均扩增出GyrA基因,其中有24株粪肠球菌和4株屎肠球菌的单链泳动带与粪肠球菌ATCC 29212和敏感菌株的单链泳动带相比较出现异常。其中粪肠球菌在第87位上有密码子改变:GAA变为GGA;屎肠球菌在第83位有密码子改变:AGT变为TAT,这些突变均可引起氨基酸的改变。在M-H琼脂中加入利血平可以提高部分粪肠球菌对环丙沙星的敏感性。结论用PCR-SSCP法检测40株肠球菌的GyrA基因并通过测序分析,显示有70%(28株)肠球菌碱基发生了突变,说明GyrA基因喹诺酮类药物耐药决定区(QRDR)突变是肠球菌对氟喹诺酮类药物耐药的重要原因,此外还有药物泵出等耐药机制的存在。     

TPRC3通道对MPP~+所致MN9D细胞损伤的保护作用

目的探讨经典瞬间受体电位通道蛋白(transient receptor potential-canonical channel,TRPC)家族在1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-Methyl-4-phenylpy ridinium ion,MPP+)导致的MN9D细胞毒性损伤中的作用。方法用不同浓度(62.5、125、250、500、1000μmol/L)的MPP+处理MN9D细胞24h,500μmol/L MPP+处理MN9D细胞不同时间(3、6、12、24、36h),建立细胞损伤模型。用RT-PCR的方法检测MN9D细胞中内源性TRPC的表达情况;500μmol/L MPP+作用于MN9D细胞,以Western blot法检测MN9D细胞内源性TRPC表达的变化;构建GFP与TRPC3-GFP腺病毒载体,转染到MN9D细胞中,以四甲基偶氮唑盐比色法(methods the tetrazolium,MTT)的方法检测过表达的TRPC3对MPP+引起的MN9D细胞损伤的保护作用。结果500μmol/LMPP+处理MN9D细胞6h就可以显著降低细胞内TRPC3蛋白水平的表达,但对TRPC6的表达无影响。过表达TRPC3能够保护MN9D细胞免受MPP+的毒性损伤。结论MPP+特异性地降低MN9D细胞TRPC3蛋白水平,过表达TRPC3可以抑制MPP+引起的MN9D细胞损伤。这种现象提示TRPC3通道可能参与了帕金森病发病的分子机制。