Ti6Al4V活性及耐磨涂层对成骨细胞生物学行为影响

目的：研究生物活性及耐磨涂层处理Ti6AL4V基体,对成骨细胞的增殖、形态及碱性磷酸酶（ALP）表达等生物学行为的影响。方法：采用SD新生鼠颅骨分离成骨细胞,与制备的2种涂层材料共同体外培养。细胞培养3d进行MTT比色检测：扫描电镜（SEM）观察成骨细胞形态学变化;采用5d生长细胞做碱性磷酸酶（ALP）功能活性检测。Ti6Al4V设立为对照组。结果：成骨细胞在新涂层材料表面的细胞增殖百分率及碱性磷酸酶光密度值与对照组间统计学分析无显著性差异（P〉0．05）;但3d细胞增殖率及5dALP活性测试结果均优于对照组。SEM观察细胞在活性涂层表面形态丰满,似立方形,具有良好的功能形态;细胞在活性、耐磨涂层表面同样伸展良好,细胞伪足丰富,并连接紧密,有利于细胞黏附。结论：2种新方法涂层材料具有良好的细胞生物活性。     

电解蚀刻法处理的钛及钛合金表面的对比研究

目的 通过成骨细胞的体外培养,初步探讨钛及钛合金微-纳米三维形貌对成骨细胞生物学行为的影响。方法采用电解蚀刻法在纯钛及钛合金表面构建出不同尺寸的微-纳米三维形貌,并观察其三维结构表面对成骨细胞黏附、增殖、细胞形态、碱性磷酸酶（ALP）活性的影响。结果在成骨细胞的黏附和增殖方面,纯钛组和钛合金组表面均高于纯钛机械抛光组。纯钛组表面细胞胞体饱满,伸出大量伪足,并可见大量功能颗粒。ALP活性显著高于钛合金和纯钛机械抛光组表面。结论通过电解蚀刻法在纯钛和钛合金表面可形成不同直径和深度的碗形巢样及纳米结构;两个表面即30~50 μm和5~8 μm的表面和光滑表面相比,都明显促进了细胞的附着;30~50 μm的纯钛表面更有利于促进细胞的增殖和分化。     

羟基磷灰石涂层处理的多孔镍钛合金溶血性及细胞黏附性评价

目的通过研究经羟基磷灰石(HA)涂层处理后多孔镍钛(NiTi)合金的溶血率及成骨细胞在其表面的附着、增殖及分化情况,评价其体外生物相容性。方法测定经HA涂层处理的圆盘状多孔NiTi合金(NiTi-HA组;直径10mm,厚2mm)的生物相容性,未经涂层处理的多孔NiTi合金(NiTi组)及致密纯钛(Ti组)试样设为对照组。采用分光光度法分析其溶血性能;将成骨细胞接种于试样表面,用扫描电镜(SEM)观察成骨细胞黏附形态,MTS法及碱性磷酸酶(ALP)试剂检测细胞附着、增殖情况及ALP活性,对数据进行重复测量方差分析。结果 NiTi-HA组、NiTi组及Ti组试样的溶血率分别为(0.30±0.11)%、(0.51±0.07)%及(0.27±0.06)%,均低于国家标准(YY/T0127.1)规定的5%。SEM观察显示,NiTi-HA组及NiTi组试样细胞黏附形态良好。NiTi-HA组试样表面细胞附着及增殖数量均高于NiTi组试样(P值分别为0.000与0.001)。NiTi-HA组及NiTi组试样表面细胞ALP活性无差异(P=1),但均高于Ti组试样(P值分别为0.001与0.0004)。结论 NiTi-HA组、NiTi组及Ti组试样均无溶血作用;NiTi-HA组较NiTi组更有利于成骨细胞附着和增殖,且ALP活性均高于纯钛。     

导电高分子聚吡咯纯钛表面改性对成骨细胞生长、增殖和功能分化的影响

目的 研究电场刺激下纯钛（Ti）表面聚吡咯（Ppy）涂层对成骨细胞的生长、增殖和功能分化的影响。方法 成骨细胞接种于材料表面，施加100mV阳极电刺激。采用免疫荧光染色、碱性磷酸酶（APL）活性和骨钙素（OC）合成检测法观察成骨细胞在Ppy涂层表面的生长和功能表达。结果 成骨细胞在Ti以及Ti表面聚吡咯涂层的基底上均能良好生长，培养至第7天、14天、21天、28天时，阳极电刺激组（Ti Ppy＋电刺激，Ti 电刺激）的ALP活性以及OC分泌量均明显高于无电刺激组(Ti Ppy,Ti）（P＜0.05）；并且在第7天、14天、21天时，Ti Ppy 电刺激组的ALP活性以及OC分泌量又明显高于Ti＋电刺激组（P＜0.01）。结论 聚吡咯涂层具有良好的生物相容性，并且在阳极电刺激作用下对成骨细胞的增殖和分化有明显的促进作用。     

种植体表面TiO2/HA梯度涂层的生物相容性研究

目的：通过观察大鼠成骨细胞（osteoblast,OB）在微弧氧化（micro-arc oxidation,MAO）和水热处理形成的TiO2/HA梯度涂层表面的粘附和增殖等情况,评价微弧氧化陶瓷膜表面的生物相容性及微弧氧化-水热处理工艺应用于钛植入材料表面处理的可行性。方法：将纯钛试件共60枚分为微弧氧化处理组（M组）、微弧氧化-水热处理组（M-H组）和纯钛对照组。采用扫描电镜（scanning electron microscopy,SEM）观察表面形貌并用X线衍射（X-ray diffraction,XRD）对其进行成分分析。然后对不同时间点OB细胞在各组材料表面的附着、生长、增殖情况以及碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性进行检测,并对实验结果进行统计分析。结果：微弧氧化处理后试件表面呈现多孔状,主要为锐钛矿型TiO2,也包含金红石型TiO2。经过后续水热处理,从扫描电镜照片可以看到试件表面析出一层白色柱形结晶体,同时XRD谱线出现了羟基磷灰石的衍射峰。试件与OB细胞共培养后可见细胞在材料周围生长良好,培养5d后,改性两组的材料表面细胞增殖比纯钛组及空白对照组明显增多。培养7d后,M组和M-H组细胞ALP活性大幅提高,各组间比较均有统计学差异。结论：MAO及水热处理后的TiO2/HA梯度涂层表面能有效提高OB细胞的早期粘附、增殖及ALP活性。     

HU-308缓释涂层对大鼠成骨细胞生物学特性的影响

目的：探讨HU-308缓释涂层对大鼠成骨细胞（ROBs）生物学特性的影响。方法：利用层层自组装技术在经碱热处理后的钛片表面制备含不同浓度HU-308的肝素／壳聚糖缓释涂层。以碱热处理的钛片为对照组（C组）,肝素／壳聚糖涂层组（P组）及含不同浓度HU-308的肝素／壳聚糖涂层组（T组：T1、T2、T3、T4组）为实验组,在不同时间点,检测ROBs在涂层表面的黏附、增殖以及ALP活性。结果：T4组涂层（HU-308浸渍浓度为0．025 mg／L）表面ROBs的黏附、增殖以及ALP活性均强于P组及C组。结论：低浓度HU-308缓释涂层可提高ROBs在其表面的黏附、增殖和ALP活性。     

糖尿病大鼠下颌骨成骨细胞体外特性的研究

目的：研究体外培养糖尿病大鼠下颌骨成骨细胞生长分化的特性。方法：20只6周龄雌性SD大鼠随机平均分为2组，实验组腹腔注射四氧嘧啶（200mg／kg），对照组注射生理盐水。模型建立成功10d后，取下颌骨行成骨细胞培养。MTT法、PNPP法、考马斯亮蓝法、放射免疫法及钙结节茜素红染色检测细胞的增殖能力、蛋白校正ALP含量、骨钙素水平及矿化能力。结果：实验组2d、4d、6d MTT相对比值高于对照组（P〈0．05），3d、7d、14d、21d ALP含量低于对照组（P〈0．01），28d总骨钙素水平以及钙结节的数量及面积均低于对照组（P〈0．01）。结论：急性糖尿病早期促进体外培养大鼠下颌骨成骨细胞的增殖，抑制其基质成熟和矿化，可建成具有内在缺陷的成骨细胞模型。     

成骨生长肽对纯钛表面成骨细胞样细胞增殖和分化的影响

目的探讨成骨生长肽（osteogenic growth peptide,OGP）涂层对纯钛表面新生大鼠颅盖骨成骨细胞样细胞增殖和分化的影响。方法实验分为纯钛组（Cp-Ti组）、碱-热水陈化处理组（AW-Ti组）和碱热处理-OGP涂层组（OGP-Ti组）,将体外培养的新生大鼠颅盖骨成骨细胞样细胞接种于3组钛片表面,进行细胞培养,第1、3、5、7天通过四甲基偶氮唑盐光密度值检测法测定细胞在材料表面的增值情况,培养第7、11、15天通过检测碱性磷酸酶活性测定细胞在材料表面的分化成熟情况。结果培养第1、3、5、7天,AW-Ti组和OGP-Ti组的细胞光密度值均高于Cp-Ti组（P〈0.05）;培养第1、5、7天,OGP-Ti组细胞光密度值均高于AW-Ti组（P〈0.05）。培养7、11、15 d后,AW-Ti组和OGP-Ti组的ALP活性均高于Cp-Ti组（P〈0.05）;培养7 d时,AW-Ti组和OGP-Ti组ALP活性差异无统计学意义（P〉0.05）;培养11、15 d时,OGP-Ti组的ALP活性均高于AW-Ti组（P〈0.05）。结论钛表面OGP涂层具有良好的生物相容性,能够提高其表面生物学活性。     

Clodronate modifying hydroxyapatite promotes restoration of mandibular defect

目的 研究氯磷酸二钠修饰羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)在体内外促进骨形成对骨缺损修复效果的影响.方法 制备氯磷酸二钠-HA复合材料,以HA为对照；分离培养成骨细胞,接种于氯磷酸二钠-HA和HA支架,四唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法检测细胞增殖活性,测定碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,实时荧光定量PCR检测成骨细胞骨保护蛋白(osteoprotegerin,OPG)、核因子-κβ受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa beta ligand,RANKL)mRNA表达的变化；进而将氯磷酸二钠-HA和HA植入兔下颌骨缺损区域,改良Masson染色及生物力学检测观察氯磷酸二钠对HA修复颌骨缺损的影响.结果 MTT和ALP活性检测表明成骨细胞在氯磷酸二钠-HA和HA支架上生长的增殖活性差异无统计学意义(P＞0.05).实时荧光定量PCR结果表明,两组细胞RANKL mRNA表达无明显变化,而氯磷酸二钠-HA组OPG mRNA显著上调(P＜0.05).改良Masson染色表明,与HA相比,氯磷酸二钠-HA更有利于材料周围新骨形成.生物力学检测结果表明氯磷酸二钠-HA组的压缩强度、拉伸强度、剪切强度均大于HA组(P＜0.05).结论 复合在HA表面的氯磷酸二钠可能通过上调成骨细胞OPG表达,促进新骨形成,提高骨缺损修复的生物力学性能.     

新型钛合金阳极氧化后对成骨细胞增殖、分化的影响

目的研究新型医用钛合金Ti-24Nb-4Zr-7.9Sn(TNZS)经过阳极氧化(AD)技术处理后对成骨细胞增殖和分化的影响。方法将人成骨样MG63细胞接种于Ti6Al4V、TNZS、AD-TNZS表面,采用MTT法检测成骨细胞的增殖情况,考马斯亮蓝G250染色法检测细胞总蛋白质含量,对硝基苯磷酸盐法检测碱性磷酸酶(ALP)活性。结果人成骨样MG63细胞在Ti6Al4V、TNZS以及AD-TNZS表面均能良好生长,细胞增殖率、细胞总蛋白含量未见明显差异(P>0.05);但培养至4、7d时,AD-TNZS组细胞ALP活性明显高于其他组(P<0.05)。结论阳极氧化处理的TNZS钛合金可促进成骨细胞的分化。     

氯磷酸二钠修饰羟基磷灰石对颌骨缺损修复的影响

目的研究氯磷酸二钠修饰羟基磷灰石(hydroxyapatite,HA)在体内外促进骨形成对骨缺损修复效果的影响。方法制备氯磷酸二钠-HA复合材料,以HA为对照;分离培养成骨细胞,接种于氯磷酸二钠-HA和HA支架,四唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法检测细胞增殖活性,测定碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,实时荧光定量PCR检测成骨细胞骨保护蛋白(osteoprotegerin,OPG)、核因子-κβ受体活化因子配体(receptor activator of nuclear factor kappa beta ligand,RANKL)mRNA表达的变化;进而将氯磷酸二钠-HA和HA植入兔下颌骨缺损区域,改良Masson染色及生物力学检测观察氯磷酸二钠对HA修复颌骨缺损的影响。结果 MTT和ALP活性检测表明成骨细胞在氯磷酸二钠-HA和HA支架上生长的增殖活性差异无统计学意义(P>0.05)。实时荧光定量PCR结果表明,两组细胞RANKL mRNA表达无明显变化,而氯磷酸二钠-HA组OPGmRNA显著上调(P<0.05)。改良Masson染色表明,与HA相比,氯磷酸二钠-HA更有利于材料周围新骨形成。生物力学检测结果表明氯磷酸二钠-HA组的压缩强度、拉伸强度、剪切强度均大于HA组(P<0.05)。结论复合在HA表面的氯磷酸二钠可能通过上调成骨细胞OPG表达,促进新骨形成,提高骨缺损修复的生物力学性能。     

壳聚糖及其复合物对小鼠成骨细胞增殖及分化的影响

目的：用含壳聚糖(chitosan,CS)、Ⅰ型胶原蛋白和重组人骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2)的培养液体外培养成骨细胞MC3T3-E1,评价3种因素对成骨细胞增殖及分化的影响。方法：实验分为4组,实验组A：CSα-MEM培养基;实验组B：CS+Ⅰ型胶原蛋白溶液的α-MEM培养基;实验组C：CS +Ⅰ型胶原蛋白溶液+rhBMP-2溶液的α-MEM培养基。对照组为含1%FBS的α-MEM培养基。采用MTT法检测加入处理因素后1、3、5、7 d的吸光度(OD)值,并绘制细胞生长曲线,观察成骨细胞的增殖情况。采用碱性磷酸酶活性测定、碱性磷酸酶染色和茜素红钙结节染色观察成骨细胞的分化作用：检测加入处理因素后1、3、5、7 d的碱性磷酸酶活性,并在细胞培养的第7天进行碱性磷酸酶染色,第14天进行茜素红钙结节染色。采用SPSS13.0软件包对所得数据进行单因素方差分析,2组之间比较采用Post Hoc检验。结果：MTT检测结果显示,实验组C的OD值高于其他组,实验组C与其他组间的两两比较具有显著差异(P<0.05)。碱性磷酸酶活性测定结果显示,实验组C的活性高于其他组,实验组C与实验组A、对照组间两两比较具有显著差异(P<0.05),与实验组B两两比较无显著差异(P>0.05)。茜素红染色和碱性磷酸酶染色结果显示,实验组C可见更多的钙盐沉积,且蓝染颗粒多于其他组。结论：壳聚糖、Ⅰ型胶原蛋白和rhBMP-2共同作用,更能促进成骨细胞的增殖与分化。     

富血小板血浆诱导骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性的研究

目的：体外观察不同浓度富血小板血浆（PRP）对自体骨髓基质细胞碱性磷酸酶活性,对PRP诱导骨髓基质细胞向成骨细胞分化的生物学效应进行评价.方法：抽取狗静脉血及骨髓,采用改进Appel方法制备不同浓度的PRP;采用传代培养筛选法,获得足够数量稳定的骨髓基质细胞（BMSC）,酶动力学法检测碱性磷酸酶活性.结果：（1）原代培养的骨髓基质细胞24h开始贴壁,12d后细胞融汇成单层,细胞多呈成纤维梭形细胞形态,经诱导液传代培养后,细胞形态渐变为方形、多角形.（2）酶动力学法测定各实验组细胞第三、六、九、十二天检测碱性磷酸酶活性,经过配对t检验,各组第六、九、十二天的ALP活性水平均较第三天明显升高,低浓度PRP组较高浓度组碱性磷酸酶活性升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）.结论：一定浓度的PRP能促进骨髓基质细胞碱性磷酸酶的活性,PRP能有效的促使BMSC向前期成骨细胞分化.     

牛血浆纤维黏连蛋白对大鼠成骨细胞增殖、分化及凋亡的影响

目的:研究外源性纤维黏连蛋白(fibronectin,FN)对大鼠成骨细胞增殖、分化及凋亡的影响,探讨应用FN治疗骨缺损性疾病的可行性。方法:酶消化法分离成骨细胞,通过细胞对染料Alamar蓝摄取检测细胞增殖,ELISA方法检测碱性磷酸酶活性,流式细胞术检测FN对成骨细胞细胞周期及凋亡的影响,Western印迹法检测FN作用后成骨细胞Bcl-2及Bax基因的蛋白表达变化。采用SPSS12.0软件包对实验数据进行单因素方差分析。结果:FN浓度为40μg/mL以上时,能促进大鼠成骨细胞的增殖,与对照组相比有显著性差异(P<0.05);FN能增加成骨细胞ALP活性,各组与对照组相比均有显著性差异(P<0.05),并有明显的剂量依赖性;不同浓度的FN作用成骨细胞后,可使处于DNA合成期(S期)的细胞百分率增加;增殖指数(proliferation index,PI)增加,细胞凋亡百分率减少,与对照组相比有显著性差异(P<0.05);FN作用后的细胞,Bcl-2基因的蛋白表达量增加,Bax基因的蛋白表达量减少,有剂量依赖性。结论:外源性FN能促进大鼠成骨细胞增殖、分化,使大鼠成骨细胞的DNA合成期(S期)的细胞百分比增加,同时抑制大鼠成骨细胞的凋亡,使大鼠成骨细胞胞质内Bcl-2基因的蛋白表达量增加,同时减少Bax基因的蛋白表达量。     

矿化胶原膜浸提液对MG-63人骨肉瘤细胞分化相关基因表达的影响

目的 研究新型矿化胶原膜对MG-63人骨肉瘤细胞(简称：MG-63细胞)成骨分化相关基因表达的影响。方法 将 MG-63细胞与新型矿化胶原膜浸提液(实验组)共培养,以市售的胶原膜(Bio-gide)浸提液作为同类产品对照组,以不加材料的细胞培养液为空白对照组,采用荧光实时定量 PCR法检测碱性磷酸酶(ALP)、I型胶原(COL I)、骨保护素(OPG)和骨钙素(OC)mRNA表达水平;采用SPSS 17.0 软件对数据进行统计学分析。结果 在ALP与OPG mRNA相对表达量检测中,3组成骨细胞的表达量差异无统计学意义(P>0.05);在COL I与 OC基因相对表达量检测中,14天时Bio-gide组和矿化胶原膜组表达均明显上调,与空白对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05),而Bio-gide组和矿化胶原膜组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 矿化胶原膜和Bio-gide膜的浸提液均可上调MG-63细胞COL I和OC的基因表达,在一定程度上促进了成骨细胞的分化。     

同源盒蛋白(Msx1)过度表达抑制成骨细胞碱性磷酸酶表达的实验研究

目的:观察同源盒蛋白(Msx1)过度表达在成骨细胞MC3T3-E1分化培养过程中对碱性磷酸酶的调节作用,以探讨Msx1蛋白对细胞成骨分化过程的调控机制。方法:将成骨细胞MC3T3-E1分为5组:未转染病毒组作为对照组1(A组);空白腺病毒载体组作为对照组2(B组);未分化组作为空白对照组(C组);分化前1 d转染携带同源盒基因Msx1的腺病毒载体组(D组);分化后1 d转染Msx1腺病毒载体组(E组)。在成骨分化培养基中培养4 d后,检测成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养过程中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的活性。结果:A、B两组成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养基培养4 d后,ALP活性呈强阳性;C组中未分化成骨细胞MC3T3-E1无ALP活性,D、E两组的成骨细胞MC3T3-E1在成骨分化培养4 d后的ALP活性明显较A、B组减低,而且D、E两组间ALP活性无区别。结论:过度表达同源盒蛋白(Msx1)能抑制成骨细胞MC3T3-E1的ALP表达,在其成骨分化的过程中起一定的抑制作用。     

高度浓缩生长因子对MC3T3-E1成骨细胞生物学性能的影响

目的：观察高度浓缩生长因子（concentrated growth factor,CGF）对成骨细胞生物学性能的影响。方法：将MC3T3-E1细胞在CGF环境下进行培养,并设立空白对照组。扫描电镜观察成骨细胞在CGF表面的附着;培养1、4、7 d后,检测细胞增殖情况以及碱性磷酸酶（ALP）活性;茜素红染色观察矿化结节和成骨相关基因Runx2的表达。CGF浸出液培养细胞24 h后,以鬼笔环肽染色观察细胞骨架的形态变化。采用 SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果：CCK-8比色显示,培养1、4、7 d,在相同时间点,实验组与对照组相比,CGF细胞增殖活性显著增强（P< 0.05）。ALP活性检测显示,培养1 d后,实验组与对照组无显著差异（P>0.05）;培养4、7 d后,实验组与对照组相比,ALP活性具有显著差异（P<0.05)。茜素红染色显示,CGF组钙化结节数量增多且面积较大。鬼笔环肽染色和DAPI染色可见,CGF组中细胞数量增多,细胞铺展面增大,肌动蛋白形态更为清晰。CGF可促进Runx2 mRNA表达（P<0.05）。结论：CGF可促进MC3T3-E1细胞的增殖、分化以及Runx2的表达。     

新型骨替代材料-介孔生物玻璃生物相容性的实验研究

目的：通过与成骨细胞的体外复合培养，探讨新型复合生物材料-介孔生物玻璃（mesoporous bioactive glass，MBG）的生物相容性，验证其作为人工骨替代材料的可行性。方法：采用酶消化法获得SD大鼠成骨细胞．分为实验组和对照组，实验组细胞和MBG复合培养，对照组细胞单独培养。比较2组成骨细胞增殖活力和碱性磷酸酶活性，并借助扫描电镜观察MBG和成骨细胞复合情况。结果：MBG和成骨细胞复合培养后，细胞增殖活力和碱性磷酸酶活性均强于对照组；扫描电镜观察：成骨细胞接种于MBG上1d时可见到细胞附着，4d时细胞呈多角形向四周伸展，并有基质分泌。结论：MBG具有良好的生物相容性．为一种前景良好的新型骨替代材料。