人β-防御素-2基因5′-端转录调控序列分析

目的 :对在LPS、TNF α刺激下 ,人 β 防御素 2基因 5′ 端转录调控机制进行初步分析。 方法 :将HBD 2基因 5′ 端上游序列连接入无启动子的pEGFP 1质粒 ,构建了系列 5′端缺失的 pEGFP 1 /HBD 2报告质粒。pEGFP 1 /HBD 2质粒转染细胞后给予LPS、TNF α刺激 ,用RT PCR检测 pEGFP的mRNA浓度。 结果 :显示HBD 2基因上游 2 41段有较强的启动子活性 ;LPS、TNF α刺激后 ,即使上游序列缩短至 2 41位点时 ,报告基因 pEGFP的mRNA表达量仍明显增高。说明HBD 2基因上游 2 41区域含有LPS、TNF α刺激后激活的转录因子作用位点。计算机分析表明 2 3 2 / 2 2 2区域有一同源性极高的NF kB结合元件 ,提示NF kB结合元件可能调控HBD 2的增强表达     

NOX1基因荧光素酶报告基因系统的建立

目的：对炎症细胞因子TNF-α及IFN-γ刺激下,人NOX1基因的表达调控进行初步分析。方法：将NOX1基因5′-端上游序列连接到无启动子的PGL3-BASIC质粒,构建了PGL3-BASIC／NOX1报告质粒。PGL3-BASIC／NOX1质粒转染A549细胞,用TNF-α、IFN-γ刺激12h,双荧光素酶报告基因系统检测基因表达情况。结果：克隆的NOX1片段具有较强的启动子活性,在TNF-α和IFN-γ共同刺激下,转染报告基因的A549细胞萤光素酶活性与对照相比有明显的增高（约4．3倍）。分析显示NOX1基因5′端上游序列片段含有NF-KB结合位点,提示细胞因子刺激的荧光素酶表达增强可能与NF-KB位点激活相关。结论：NOX1基因表达水平明显受到炎症细胞因子的调控,提示该基因可能参与机体免疫防御（特别是上皮细胞免疫防御）,值得进行深入研究。     

诱生型一氧化氮合酶基因启动子的结构及其调控

鼠类NOS2基因5′端1.7kb序列几乎包含了所有的顺式作用元件,其中NFκB结合位点、IRF-RE、CAAT box和GAS等元件对该基因的诱导性转录调控至关重要。人NOS2基因5′端3.7kb范围与鼠类有相似的调控元件,但该区域仅有基础启动子活性,其诱导性调控元件在-3.7kb的上游,其中NFκB结合位点起着关键的作用。     

人LAIR-1/CD305基因启动子的生物信息学分析

目的:研究人LAIR-1/CD305启动子及其5′上游调控序列。方法:通过检索NCBI中的人类基因组数据库,获得LAIR-1的转录本序列及翻译起始位点上游2500bp的序列。利用Promoter2.0等软件预测LAIR-1的启动子序列,然后利用MatInspector等软件对启动子序列的转录因子结合位点和启动子功能模块进行预测。结果:LAIR-1基因的核心启动子区位于翻译起始密码子上游的600～200bp区域内。在转录调控区发现了一些重要的转录因子结合位点,并预测到13种启动子功能模块。结论:LAIR-1基因的表达可能受到多种转录因子和5′端上游调控序列的调控。     

紫草素抑制血管平滑肌细胞及巨噬细胞肿瘤坏死因子-α启动子活性

目的： 探讨紫草素(shikonin)对血管平滑肌细胞(VSMCs)及巨噬细胞(Mφs)体外转染的TNF-α基因启动子活性的调控作用。方法：利用虫荧光素酶(luciferase)报告基因系统，构建含有人类TNF-α基因启动子的质粒DNA，经阳离子脂质体转染体外培养的VSMCs及Mφs，以LPS及Ang Ⅱ刺激并经不同浓度的紫草素处理后，通过检测luciferase的活性来观察启动子活性的变化。结果：TNF-α启动子在VSMCs及Mφs可高效稳定地表达，分别为阳性对照(CMV启动子)的58.3%和55.6%；而经LPS及Ang Ⅱ刺激的VSMCs和Mφs中，TNF-α启动子活性较未受刺激时呈现明显上调(P<0.05)。在VSMCs中0.25-1 μmol/L、Mφs中0.5-2 μmol/L的紫草素对未受诱导的TNF-α启动子表现出一定的抑制作用，更可显著抑制经LPS及Ang Ⅱ刺激后上调表达的TNF-α启动子活性，并且呈现剂量依赖关系(P<0.05)。结论：紫草素对 TNF-α启动子活性的抑制，证明了其对促炎细胞因子在转录水平的潜在抑制作用及对于心血管系统的潜在抗炎性质。     

BRCA2基因启动子的克隆和分析

目的构建BRCA2基因启动子的荧光素酶报告质粒,为BRCA2基因调控研究提供基础。方法采用高保真Taq聚合酶,从正常人外周血中扩增出BRCA2启动子并将其插入质粒中。通过基于PCR的定点突变方法在多态性位点rs3092989(-254A/G)获得含-254G等位基因的序列。亚克隆BRCA2启动子片段至pGL3-basic报告基因载体中,构建含BRCA2启动子的重组报告质粒。转染HeLa细胞,评价启动子活性以及-254A/G多态性位点对活性的影响。结果酶切和直接测序法证实所构建质粒含有pGL3-basic及BRCA2基因启动子序列,扩增的含-254A和-254G的BRCA2启动子序列正确。构建的报告基因具有启动子活性,与pGL3-basic质粒相比较,BRCA2启动子的相对荧光单位增加了413倍。rs3092989(-254A/G)多态位点未明显影响启动子活性。结论 BRCA2转录起始位点上游序列具有较强的启动子活性。成功克隆BRCA2启动子并引入相关突变,可为后续的基因转录调控研究奠定基础。     

三氧化二砷抑制血管平滑肌细胞及巨噬细胞肿瘤坏死因子α启动子活性的实验研究

目的探讨三氧化二砷(As2O3)对血管平滑肌细胞(VSMCs)及巨噬细胞(Mφs)体外转染的TNF-α基因启动子活性的调控作用。方法利用虫荧光素酶(luciferase)基因系统,构建含有人类TNF-α基因启动子的质粒DNA,经阳离子脂质体转染体外培养的VSMCs及Mφs,以LPS及AngⅡ刺激并经不同浓度的As2O3处理后,通过检测luciferase的活性来观察启动子活性的变化。结果TNF-α启动子在VSMCs及Mφs可高效稳定地表达,分别为阳性对照(CMV启动子)的58.3%和55.6%;而经LPS及AngⅡ刺激的VSMCs和Mφs中,TNF-α启动子活性呈现明显上调(P<0.05)。VSMCs中2~8μmol/L、Mφs中0.25~1μmol/L的As2O3对未受诱导的TNF-α启动子有抑制作用,更可显著抑制经LPS及AngⅡ刺激后上调表达的TNF-α启动子活性,并呈剂量依赖关系(P<0.05)。结论As2O3对TNF-α启动子转录活性的抑制,提示其对促炎细胞因子在转录水平有潜在抑制作用。     

人血红素加氧酶基因近端启动子区研究进展

分析血红素加氧酶(heme oxygenase,HO)基因mRNA加帽位点上游1416bp及mRNA5′端未翻译区24bp全长1.44kb片段。通过大片段缺失,发现与诱导剂相关的mRNA加帽位点近端上游121bp,可使基因的瞬时表达提高3～5倍,同时诱导作用发生在SV_(40)增强子元件位于启动子序列上游。另外在1.44kb片段间mRNA加帽位点上游有沉默子或负调控元件及NF-κB-和AP-2结合位点,而在1.44kb之外还有附加的诱导增强子元件。     

人CD226基因SNP和启动子序列分析

目的 研究人CD226（PTA1）启动子及其5‘上游调控序列。方法 应用计算机软件预测启动子序列，并分析人CD226基因5‘上游调控序列以及通过RT－PCR的方法研究开放读框中的单核苷酸多态性。结果 CD226基因在－375bp处和－130bp处可能有两个启动子，含有AP－1，Ets-1,Spl,P300,PU.1,PEA3等转录因子结合序列，在编码胞浆区的序列中存在一个单核苷酸多态性位点。结论 CD226基因表达受到多种转录因子和5‘端上游调控序列的调控。     

转录因子GATA2在TNF-α介导的炎症反应中调节Tie2基因的表达

目的：探讨在炎症刺激因子肿瘤坏死因子-α（TNF-α）介导的炎症反应中转录因子GATA家族成员是否参与了Tie2基因的转录调控。方法: 采用实时定量PCR测定TNF-α作用前后人主动脉内皮细胞（HAECs）和肺动脉内皮细胞（HPAECs）中GATA家族成员GATA2、GATA3 mRNA的表达,利用荧光素酶活性检测研究GATA转录因子能否激活Tie2基因启动子,并采用电泳迁移变动分析（EMSAs）和超级迁移率变动试验（supershift）研究GATA转录因子是否通过与Tie2基因启动子结合,从而激活Tie2基因的表达。结果: TNF-α可诱导人血管内皮细胞HAECs和HPAECs中转录因子GATA2的表达,高表达的GATA2可与Tie2基因启动子上的（T/A）GATA(A/G)序列结合,激活Tie2基因启动子,从而上调Tie2基因的表达。结论: GATA转录因子家族成员GATA2在TNF-α介导的炎症反应中调节了Tie2基因的表达。     

重型肝炎相关的人纤维介素基因启动子的克隆及功能分析

目的明确在病毒蛋白HBc和HBx作用下,hfgl2基因5′端非编码区对转录激活起重要作用的转录调控序列。方法运用基因重组的方法,构建一系列5′端缺失而保留共同3′端的hfgl2基因启动子虫荧光素酶报告质粒,将其分别与病毒蛋白HBc和HBx真核表达质粒共转染CHO细胞和HepG2细胞,检测各组细胞的相对荧光素酶活性。结果酶切鉴定以及DNA测序等证实一系列hfgl2基因启动子虫荧光素酶报告基因质粒构建成功,系列启动子缺失试验证实:在hfgl2基因启动子-817位至-467位(相对于转录起始点)之间存在着激活该基因的调控序列。结论在HBV病毒蛋白HBc及HBx作用下,hfgt2基因的启动子区存在一个与其转录表达有关的调控序列,探讨了重型肝炎相关的hfgl2基因高度表达的分子机制,为下一步研究相关的顺式作用元件及反式作用因子奠定了基础。     

鼻咽癌细胞中ezrin基因启动子上游序列转录调控特性的研究

目的:研究鼻咽癌细胞中ezrin基因启动子上游序列的转录调控特性。方法:构建一系列携带ezrin基因-1541/-706序列的报告基因表达载体,ezrin基因-1541/-706序列以正向和反向分别连接至不含启动子的报告基因上游、ezrin启动子上游、SV40启动子上游、ezrin启动子或SV40启动子控制的报告基因下游,将质粒转染CNE2细胞,检测荧光素酶活性。结果:CNE2细胞中,当-1541/-706序列正向位于报告基因上游时表现出启动子活性,其转录激活作用约为ezrin启动子的50%;反向连接时无启动子活性。而且,当-1541/-706序列正向位于ezrin启动子或SV40启动子上游时,显著提高荧光素酶表达;当反向位于启动子下游、正向或反向位于启动子控制的报告基因下游时,转录增强作用消失。结论:CNE2细胞中ezrin基因启动子上游序列具有转录激活和转录增强作用,这种作用具有DNA序列位置和方向依赖性。     

人BAFF-R基因启动子活性的初步研究

目的以B淋巴细胞刺激因子受体BAFF-R基因5'上游区序列为研究对象,初步鉴定、分析该基因的启动子所在区域。方法克隆BAFF-R基因5'侧翼区1823 bp序列,构建8个含有不同长度启动子序列的荧光素酶报告基因表达质粒pGL3-B1～B8,将这8个序列缺失重组质粒与psv-β-gal质粒共转染细胞,检测荧光素酶的相对活性,确定启动子所在区域。结果8个重组质粒中pGL3-B2、pGL3-B3、pGL3-B5、pGL3-B6启动子的活性较低;pGL3-B7启动子的活性最强,pGL3-B8启动子活性最低。结论BAFF-R基因5'端-288～-430、-712～-868和-1420～-1562三个区段可能存在转录沉默子元件,-617～-712和-1277～-1420区段存在转录增强子元件,BAFF-R基因的核心启动子可能位于-1420～+261区域。     

CaMK Ⅱα基因启动子的克隆和神经细胞特异性Cre表达载体的构建

目的克隆和鉴定CaMKⅡα基因启动子序列，构建神经细胞特异性Cre重组酶的真核表达载体。方法采用高保真PCR方法分步扩增CaMKⅡα基因5′端8．1kb的调控区DNA片段，该片段包括了CaMKⅡα基因5′端调控区的所有序列。经克隆和部分序列测定后，依次与pCre—IRES—EGFP质粒框架连接，构建载体。结果克隆的CaMKⅡα基因5′端侧翼区酶切图谱与公布的C57BL/6J小鼠相应序列的酶切位点相一致，其中文献报道的富含顺式调控元件的序列与公布的小鼠序列完全相同。CaMKⅡα基因启动子正确地连接于Cre基因的5′端，构建了目标载体。结论这一载体的构建为建立前脑神经细胞特异性表达Cre重组酶的转基因小鼠奠定了基础，有助于神经系统相关疾病的研究。     

NF-κB结合元件缺失对NOX1启动子转录活性的影响

目的:构建含NADPH氧化酶1(NOX1)近端启动子区的pGL3萤光素酶报告基因载体及缺失NF-κB结合元件的相应载体,分别测定其相应活性,探讨NF-κB结合元件缺失对NOX1启动子区转录活性的影响。方法:采用PCR法克隆NOX1启动子区序列(1 415 bp),将目的片段与pGL3萤光素酶载体分别双酶切、纯化后进行连接(pGL3-NOX1-1415),测序鉴定;应用Alibaba 2.1软件分析NOX1近端启动子区,获取NF-κB结合元件;重叠PCR法将含该元件的启动子区域(88 bp)缺失,并构建相应载体(pGL3-NOX1-1327)。将两载体分别与pRL-TK内参质粒瞬时转染进入A549细胞,采用TNF-α(10μg/L)刺激细胞24 h,萤光酶标仪检测A549细胞的萤光素酶活性。结果:测序鉴定结果提示pGL3-NOX1-1415及NF-κB结合元件缺失的pGL3-NOX1-1327载体构建成功;细胞实验显示,TNF-α刺激后,转染pGL3-NOX1-1415的A549细胞萤光素酶活性明显强于对照组(P0.05),而转染NF-κB结合元件缺失的pGL3-NOX1-1327的细胞萤光素酶活性明显低于转染pGL3-NOX1-1415组(P0.05)。结论:TNF-α诱导A549细胞NOX1基因活化与NF-κB密切相关,NF-κB参与了TNF-α诱导的NOX1基因启动子的转录调控。     

Ⅰ型胶原基因转录调控的研究进展

调控Ⅰ型胶原(COL1)基因转录的顺式作用元件位于启动子和第一个内含子中。顺式作用元件及其结合的转录因子有生物种类特异性。一些转录因子以不同的亲和力与其部分潜在结合位点结合,它们间的相互作用稳定了DNA的环状结构,并引发转录。转化生长因子-β(TGF-β)、胰岛素样生长因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等细胞因子在转录水平参与COL1基因的调控,在COL1基因启动子上有它们的反应元件。     

顺式调控元件NF-κB在尼古丁诱导ICAM-1表达中的作用

目的: 研究5' 上游序列在尼古丁诱导细胞间粘附分子-1(ICAM-1)基因转录调控中的作用。 方法: 首先采用分子克隆技术构建实验所需的DNA片段,然后采用真核细胞转染技术将重组DNA片段与内参照质粒一起转染体外培养的内皮细胞并检测尼古丁刺激的转染细胞荧光素酶的相对活性。 结果: 成功构建了6种含有不同长度ICAM-1基因启动子序列以及启动子中NF-κB 和 Sp-1 位点突变序列的荧光素酶报告基因质粒。与对照组相比尼古丁可促进含有启动子序列-579 bp(pGL3E-579/+36)(P＜0.05), -230 bp (pGL3E-230/+36) (P＜0.05) 以及启动子 Sp-1 位点突变体(pGL3E-Sp-1-MU) (P＜0.05)的荧光素酶基因表达,而下游NF-κB位点的删切重组体(pGL3E-134/+36)和含有NF-κB位点突变体(pGL3E- NF-κB -MU)的重组荧光素酶报告基因质粒在尼古丁诱导下与对照组相比荧光素酶表达量无明显差异。结论: ICAM-1基因启动子顺式作用元件下游NF-κB位点在尼古丁诱导ICAM-1基因表达机制中可能起重要作用。     

NSD3促进组蛋白H3K36双甲基化抑制巨噬细胞中TNF-α的产生

目的主要研究巨噬细胞中核受体结合SET结构域蛋白3(NSD3)对脂多糖(LPS)触发的肿瘤坏死因子α(TNF-α)的调控作用,并探讨其调控机制。方法以小鼠腹腔巨噬细胞和RAW264. 7细胞作为细胞模型。100 ng/m L LPS刺激小鼠腹腔巨噬细胞,采用实时定量PCR检测NSD3 mRNA水平,Western blot法检测NSD3蛋白水平;在RAW264. 7细胞中过表达NSD3或采用RNA干扰技术敲低腹腔巨噬细胞中NSD3的表达,ELISA检测NSD3对LPS触发的TNF-α分泌的影响; Western blot法检测敲低NSD3对LPS触发的核因子κB p65(NF-κBp65)信号通路的影响;荧光素酶法检测NSD3对NF-κBp65介导的TNF-α基因转录活性的影响;染色质免疫沉淀实验检测TNF-α基因启动子区组蛋白H3的36位赖氨酸(H3K36)甲基化的募集。结果 LPS抑制巨噬细胞中NSD3的表达;过表达NSD3抑制LPS触发的TNF-α的产生,敲低NSD3则促进LPS触发的TNF-α的产生,但对NF-κB活化无影响; NSD3抑制NF-κBp65介导的TNF-α基因的转录活化,促进TNF-α基因启动子区的H3K36二甲基化。结论 NSD3促进TNF-α基因启动子区H3K36的双甲基化,抑制TNF-α的表达。     

靶向TNF-α RNA干扰重组体的构建及序列分析

目的:利用RNA干扰技术,筛选出可以高效、特异性抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)表达的小发夹状RNA(shRNA)片段,设计并构建质粒重组体,进行序列分析,为探索TNF-α相关疾病的基因治疗提供新途径.方法:原代培养小鼠腹腔巨噬细胞,15%DMEM培养液调细胞浓度为2×107cells/L接种于6孔板,3 mL/well;细胞用脂多糖(LPS)激活,ELISA法测不同时间培养上清中TNF-α的浓度;将针对TNF-α基因的5段shRNA干扰片段的表达框经PCR扩增、纯化后,与转染试剂混合转染入巨噬细胞,细胞用LPS激活24 h后ELISA法测培养上清中TNF-α的浓度、RT-PCR法测细胞TNF-α mRNA的表达;将最有效抑制TNF-α表达的干扰片段克隆入质粒载体,转化DH5α感受态菌株,提取质粒,进行测序分析.结果:LPS刺激巨噬细胞24 h后,细胞分泌TNF-α达高峰;转染了干扰序列1的细胞培养上清中TNF-α浓度较对照组下降最明显(P<0.05),达59.46%,TNF-αmRNA的表达较对照组被抑制了61.20%;将干扰序列1DNA序列克隆到载体上,经测序鉴定确实为所需序列.结论:成功筛选出靶向TNF-α基因的shRNA干扰片段并构建质粒,可进一步利用克隆所得到的shRNA干扰TNF-α mRNA的表达,为TNF-α相关疾病的基因治疗提供新途径.     

HBVnt453-250负性调节元件作用方式与嗜肝性的研究

目的 HBVnt453-250序列为乙型肝炎病毒正链的一个新的负性调节元件,探讨其作用方式是否具有方向位点依赖性、启动子选择性以及肝细胞特异性.方法 构建含有负性调节元件的质粒pHBV453-250方向和位点置换体(pHBV250-453、plucHBV453-250和plucHBV250-453),分别以荧光素酶(luciferase)及增强型绿色荧光蛋白(EGFP)作为报告基因,转染HepG2细胞后,通过双荧光素酶体系、荧光定量PCR和Western blot分析,检测HBVnt453-250序列对目的基因转录及表达的影响;构建启动子置换的质粒pCMV453-250(luc),转染HepG2细胞后,双荧光素酶检测系统检测荧光素酶表达;将pHBV453-250和pHBV250-453分别转染人宫颈癌细胞(HeLa)和人肺癌细胞(A549),双荧光素酶检测系统检测荧光素酶表达.结果 HBVnt453-250序列以正向或反向插入荧光素酶或EGFP基因的5'端或3'端时,均能表现对目的基因转录和表达的下调作用;在CMV启动子引导下,HBVnt453-250序列明显降低了荧光素酶的活性,为对照的36.56%;正反向的HBVnt453-250序列均能在两种非肝源性细胞系中抑制荧光素酶活性.结论 HBVnt453-250序列的负性调节作用无方向及位点特异性,无启动子选择性及肝细胞特异性.