还原型谷胱甘肽上调β-catenin蛋白表达促进MC3T3-E1细胞成骨分化

目的:探讨还原型谷胱甘肽(GST)对小鼠成骨细胞MC3T3-E1成骨分化的影响,并从Wnt/β-catenin信号通路角度初步探讨其可能的机制。方法:通过碱性磷酸酶(ALP)染色以及细胞外钙化结节来检测成骨细胞MC3T3-E1的分化情况;GST干预MC3T3-E1成骨细胞株7 d、14 d和21 d后,利用Real-time PCR检测成骨相关因子RUNX2、OSX、COLⅠ、OCN基因及Wnt/β-catenin信号通路相关基因β-catenin、LRP5和GSK-3β的表达;通过Western blot检测β-catenin蛋白表达。结果:ALP染色观察到MC3T3-E1细胞外基质存在钙质沉积,且MC3T3-E1 ALP活性阳性。GST能明显提高MC3T3-E1细胞成骨相关基因以及Wnt/β-catenin信号通路相关基因的表达。Western blot结果提示GST可以明显促进β-catenin蛋白的表达。结论:MC3T3-E1细胞本身具有一定的成骨细胞特性,有效浓度的GST能促进小鼠MC3T3-E1细胞成骨分化,Wnt/β-catenin信号转导通路在成骨分化过程中起一定的调节作用。     

盘龙七片通过调节Wnt/β-catenin通路对BMSCs成骨分化的影响

目的 观察盘龙七片对人骨髓间充质干细胞(BMSCs)分化的作用并探讨其机制。方法 BMSCs细胞分为对照组和盘龙七片处理组。MTT检测细胞增殖并确定盘龙七片最佳浓度。RT-PCR和western blot分别检测Runx2、Osterix、COL1A1的mRNA和蛋白表达。检测骨钙素、碱性磷酸酶(ALP)及Wnt/β-catenin通路蛋白的表达水平。结果 盘龙七片促进BMSCs增殖,且随着质量浓度的升高增加更明显(P<0.05)。盘龙七片组细胞中Runx2、Osterix、COL1A1的mRNA和蛋白表达高于对照组(P<0.05),骨钙素水平和ALP活性高于对照组(P<0.05);Wnt3和β-catenin的蛋白表达高于对照组(P<0.05),p-GSK-3β的蛋白表达低于对照组(P<0.05)。结论盘龙七片能够促进BMSCs细胞成骨分化,且其作用可能是通过激活Wnt/β-catenin通路产生的。     

低剂量激光联合阿魏酸对成骨细胞分化成熟及成骨信号通路表达的影响

目的:研究低剂量激光(LLLI)联合阿魏酸对成骨细胞分化成熟及成骨信号通路表达的影响。方法:取新生24小时以内SD大鼠的颅盖骨,分离培养成骨细胞后分为对照组、阿魏酸组、LLLI组、阿魏酸+LLLI组,不同条件连续处理3天后检测成骨细胞分化标志物、增殖分子、信号通路分子的表达量。结果:处理后3天时,阿魏酸组、LLLI组、阿魏酸+LLLI组细胞中Bax、Bid的mRNA表达量均显著低于对照组,Bcl-2、CyclinD1、E2F、Col-I、OC、ALP的mRNA表达量以及Wnt、β-catenin、Runx2、cAMP、PKA的蛋白表达量均显著高于对照组(P<0.05);阿魏酸+LLLI组细胞中Bax、Bid的mRNA表达量均显著低于阿魏酸组和LLLI组,Bcl-2、CyclinD1、E2F、Col-I、OC、ALP的mRNA表达量以及Wnt、β-catenin、Runx2、cAMP、PKA的蛋白表达量均显著高于阿魏酸组和LLLI组(P<0.05),阿魏酸组和LLLI组细胞中Col-I、OC、ALP、Bax、Bid、Bcl-2、CyclinD1、E2F的mRNA表达量以及Wnt、β-catenin、Runx2、cAMP、PKA的蛋白表达量无显著性差异(P>0.05)。结论:低剂量激光联合阿魏酸能够促进成骨细胞分化成熟、激活成骨信号通路。     

辛伐他汀对人骨髓基质干细胞向成骨细胞分化过程的影响

目的：观察辛伐他汀（SIM）对体外人骨髓基质干细胞（hBMSCs）向成骨分化的影响,探讨其刺激成骨的作用机制.方法：取健康成人骨髓进行体外成骨诱导培养,实验分为对照组（G1）：不给予药物干预;实验组（G2）：传代后加入SIM1×10-7mol/L.于传代后7,14,21d采用RealtimeRT-PCR检测mRNA水平和BMP-2,Smad1,β-catenin,Frizzled2的表达,并用免疫组织化学检测蛋白水平β-catenin的表达.传代后7d行细胞碱性磷酸酶（ALP）染色和比活性检测;传代后21d行vonKossa染色,检测细胞外基质矿化.结果：SIM作用后7,14,21d3个不同时间点,BMP-2表达均显著高于对照组;Smad1在成骨诱导14,21d时表达高于G1,其余组间差异均不显著;β-catenin免疫组织化学染色2组差异不显著;G2组ALP表达和矿化能力均显著高于G1组.结论：SIM1×10^-7mol/L可促进体外成骨诱导培养的hBMSCs向成骨细胞分化,上调TGF-β/BMPs信号通路部分信号分子表达,但未能显著改变Wnt/β-catenin信号通路部分相关因子的表达.     

葛根素对成骨细胞体外增殖及Wnt/β-catenin信号通路表达的影响

目的:葛根素对成骨细胞体外增殖及Wnt/β-catenin信号通路表达的影响。方法:培养成骨细胞MC3T3-E1并分为对照组及10-6 mol/L PUE组、10~(-7) mol/L PUE组、10~(-8) mol/L PUE组,处理24小时后检测成骨细胞标志基因、凋亡基因、Wnt/β-catenin通路基因的mRNA表达量。结果:10-6 mol/L PUE组、10~(-7) mol/L PUE组、10~(-8) mol/L PUE组细胞ALP、Runx2、OC。Wnt1、Wnt2、Wnt3a、Wnt10b、β-catenin的mRNA表达量均显著高于对照组,caspase-3、caspase-8、caspase-9、caspase-12的mRNA表达量均显著低于对照组(P<0.05);且葛根素剂量越大,细胞中ALP、Runx2、OC、Wnt1、Wnt2、Wnt3a、Wnt10b、β-catenin的mRNA表达量越高,caspase-3、caspase-8、caspase-9、caspase-12的mRNA表达量越低(P<0.05)。结论:葛根素能够有效促进成骨细胞的增殖及Wnt/β-catenin通路的活化。     

脉冲电磁场对大鼠骨髓间充质干细胞增殖、成骨分化和Wnt/β-catenin信号通路的影响

目的 探讨脉冲电磁场（pulsed electromagnetic fields, PEMFs）对大鼠骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs）增殖、成骨分化以及对Wnt/β-catenin信号通路的影响。方法 将培养的第3代大鼠BMSCs分为3组。3个组均以LG-DMEM完全培养基培养1 d,待细胞贴壁后更换新鲜培养基,对照组不做干预处理; PEMFs组进行8 Hz、3.8 mT的PEMFs干预,每天40 min,持续21 d;成骨诱导基(OM)组加入成骨诱导剂,不予磁场干预。采用MTT法测定增殖活性;碱性磷酸酶（ALP）、茜素红S染色进行成骨分化鉴定;利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）技术检测Wnt/β-catenin信号通路及成骨分化相关基因的表达。结果 相较对照组,成骨诱导剂在干预第7、14、21 d可提高BMSCs的增殖活性（P<0.05）;PEMFs促增殖作用不明显。在BMSCs分化方面,PEMFs组及OM组ALP、茜素红S染色阳性强度均高于对照组（P<0.05）。定量RT-PCR结果显示,PEMFs组及OM组Wnt1、Wnt3a、LRP5、β-catenin、BMP-2、Runx2、ALP、OC mRNA的表达相较于对照组在相应时间点均有所上调（P<0.05）。PEMFs组各检测结果较OM组低,但趋势基本一致。结论 PEMFs在8 Hz、3.8 mT条件下可促进BMSCs的成骨分化,这可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。     

人甲状旁腺激素（1-34）在人成骨肉瘤细胞中对基质Gla蛋白及Wnt/β-catenin信号通路的调节作用

目的观察人甲状旁腺激素（PTH）的N端活性片段PTH（1-34）对人成骨肉瘤细胞MG63 基质Gla 蛋白（MGP）表达的影 响,以及PTH通过Wnt/β-catenin 信号通路介导MGP表达调控的作用,探讨PTH（1-34）在防治骨质疏松症作用中可能的分子 机制。方法（1）用不同浓度PTH（1-34）（10-9、10-8、10-7 mol/L）,单独或联合Wnt/β-catenin信号通路抑制剂DKK-1（200 ng/mL）干预 MG63 细胞;（2）检测碱性磷酸酶（ALP）染色及活力测定用于判断细胞分化情况;（3）MGP及Wnt/β-catenin 信号通路各组分 的mRNA及蛋白的表达分别采用实时定量RT-PCR 及Western blotting 方法。结果（1）PTH（1-34）上调MGP基因的表达, MGP mRNA的表达分别是对照组的2.56 倍、4.14 倍、7.81 倍（P<0.05 或P<0.01）,且呈剂量依赖性增高;（2）PTH增强MG63 细胞ALP活力,Dkk-1 抑制ALP活性,Dkk-1 与PTH联用部分阻断PTH上调ALP活力（P<0.05）;（3）PTH上调MGP及Wnt/ β-catenin 信号通路中相关因子LRP5、β-catenin、Runx2 mRNA及蛋白水平,其mRNA分别是对照组的2.65、4.01、3.48 倍（P< 0.05 或<0.01）;DKK-1 对PTH（1-34）促MGP表达没有影响,但大部分阻断了Wnt/β-catenin 信号通路中相关因子的表达。结 论PTH（1-34）能明显上调MGP及Wnt/β-catenin 信号通路中相关因子的表达,Wnt/β-catenin 信号通路和MGP在PTH调节骨 代谢中起重要作用。     

R-spondin1在促进人骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用

目的:研究Wnt信号通路激活剂R-spondin1在人骨髓间充质干细胞(hBMSC)成骨分化中的作用.方法:用0、5、10、20 μg/L R-spondin1处理hBMSC,利用荧光素酶实验检测R-spondin1对hBMSC中Wnt信号通路的作用,Western blot检测R-spondin1对Wnt信号通路下游靶基因β-catenin蛋白表达的影响;在成骨分化培养基中添加20 μg/L R-spondin1诱导hBMSC成骨分化,检测R-spondin1对早期成骨分化指标ALP活性及成骨分化晚期钙沉积、成骨分化标志物OSX、OCN和成骨分化关键转录因子RUNX2表达的影响.结果:R-spondin1增强hBMSC中Wnt信号通路,R-spondin1增强ALP活性和钙沉积,促进OSX、OCN及RUNX2的表达.结论:R-spondin1增强hBMSC中Wnt信号通路的作用,促进hBMSC成骨分化.     

黄芩苷对人牙周膜干细胞生物学特性的影响及作用机制

【摘要】 目的 探讨黄芩苷（baicalin）对人牙周膜干细胞（PDLSCs）生物学特性的影响及其潜在的作用机制。 方法 体外培养人PDLSCs,将对数期的PDLSCs随机分为：control组（DMEM培养液）、baicalin组（1.0 μmol/L baicalin）、baicalin+XAV939组（1.0 μmol/L baicalin和4.0 μmol/L Wnt/β-catenin信号通路特异性抑制剂XAV939）,采用细胞计数法（CCK-8）检测各组细胞增殖情况,黏附实验和Transwell实验分别检测细胞黏附和迁移能力,酶联免疫检测仪检测碱性磷酸酶（ALP）活性,实时荧光定量PCR（RT-PCR）法检测成骨相关基因骨钙蛋白（OCN）,骨桥蛋白（OPN）和成骨细胞转录因子2（RUNX2）的表达,蛋白免疫印迹（Western blot）法分析Wnt/β-catenin信号通路关键分子β-连环蛋白（β-catenin）、c-myc和细胞周期蛋白D1（Cyclin D1）的表达。 结果 与control组相比,baicalin组PDLSCs增殖能力明显升高,黏附和迁移能力均明显提高,ALP活性随时间的延长而升高,OCN、RUNX2和OPN基因的表达量明显升高,β-catenin、c-myc和Cyclin Dl蛋白表达显著上调,差异均具有统计学意义 (P＜0.05)。与baicalin组相比,添加XAV939能够部分逆转baicalin对PDLSCs以上各指标的影响。 结论 黄芩苷能够促进PDLSCs增殖、黏附和迁移能力,且可诱导PDLSCs的成骨分化,其作用机制可能与激活Wnt/β-catenin信号通路有关。     

BMPER通过Wnt/β-catenin信号通路减轻高糖高脂对MC3T3-E1细胞成骨分化的抑制

目的：探究骨形态发生蛋白内皮细胞前体来源调节因子（BMPER）在成骨分化中的生物学作用。方法：将MC3T3-E1细胞分为对照（control）组、成骨诱导（OM）组和成骨诱导+高糖高脂（OM+HG/PA）组。采用Western印迹法检测各组细胞Runt相关转录因子2(Runx2)、Ⅰ型胶原α1(Col1α1)、BMPER的表达。将空载体对照质粒及BMPER过表达质粒转染到MC3T3-E1细胞中,将细胞分为p-NC和p-BMPER组。使用Western印迹法检测各组细胞BMPER、Runx2、Col1α1、Wnt1、Wnt3a、active β-catenin表达。碱性磷酸酶（ALP）染色检测BMPER对成骨分化的影响。应用非特异性siRNA及合成的靶向沉默BMPER小干扰RNA(siRNA)转染MC3T3-E1细胞,将细胞分为si-NC组及si-BMPER组,使用Western印迹法检测各组细胞Wnt1、Wnt3a、activeβ-catenin表达。结果：与OM组相比,OM+HG/PA组中Runx2、Col1α1、BMPER蛋白表达显著减少（t=7.572、8.568、10.742,...     

小核仁RNA宿主基因5对骨髓间充质干细胞成骨分化和凋亡的影响

目的 探究小核仁RNA宿主基因5(SNHG5)在调控骨髓间充质干细胞成骨分化和凋亡中的作用。方法 成骨诱导液诱导骨髓间充质干细胞成骨分化,不同质粒转染分组,Western blotting法检测成骨标志物（OCN、OSX、COL1A1）的蛋白相对表达量,茜素红染色和碱性磷酸酶（ALP）检测成骨效果,实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测SNHG5和OCN mRNA相对表达量。将细胞随机分为两组,实验组下调SNHG5表达,对照组不下调,同法进行成骨诱导,检测OCN、OSX及COL1A1的蛋白相对表达量,检测成骨效果,检测OCN、OSX、COL1A1及SNHG5 mRNA相对表达量。采用流式细胞术检测细胞凋亡,并检测Caspase-3活性。结果 成骨诱导后第14天的OCN、OSX及COL1A1蛋白相对表达量高于诱导后第7天和诱导前（P <0.05）,诱导后第7天高于诱导前（P <0.05）。成骨诱导前、诱导后第7天、诱导后第14天的ALP活性和茜素红浓度比较,差异有统计学意义（P <0.05）。成骨诱导前、诱导后第1天、第3天、第5天、第7天、第14天的SNHG5...     

LncRNA MALAT1通过miR-34c/SATB2轴对脂肪间充质干细胞成骨分化的促进作用

目的：探讨长非编码RNA肺癌转移相关转录本1（LncRNA MALAT1）通过微小RNA（miR）-34c/特异AT序列结合蛋白2（SATB2）轴对脂肪来源的间充质干细胞（ADSCs）成骨分化的影响,并阐明其作用机制。方法：人ADSCs转染Lenti-NC、Lenti-MALAT1、sh-NC、sh-MALAT1、miR-NC和miR-34c,RT-PCR法检测ADSCs中LncRNA MALAT1、miR-34c和SATB2 mRNA表达水平;miRcode和TargetScan 7.1网站预测并通过荧光素酶报告基因实验验证miR-34c与LncRNA MALAT1、miR-34c与SATB2之间的靶向结合作用;Western blotting法检测ADSCs中成骨标志物Runt相关转录因子2（Runx2）、骨桥蛋白（OPN）和骨钙蛋白（OCN）表达水平;碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红S（ARS）染色检测ADSCs中ALP和ARS水平及钙盐沉积。结果：与第0天比较,ADSCs成骨诱导第3、7、14和21天后,细胞中LncRNA MALAT1、SATB2、Runx2、OPN和OCN蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,miR-34c表达水平明显降低（P<0.05）。与Lenti-NC组和sh-NC组比较,Lenti-MALAT1组ADSCs中LncRNA MALAT1表达水平,Runx2、OPN和OCN蛋白表达水平,ALP和ARS水平明显升高（P<0.01）,sh-MALAT1组上述指标明显降低（P<0.01）。与miR-NC+Lenti-NC组比较,miR-34c+Lenti-NC组ADSCs中Runx2、OPN和OCN蛋白表达水平明显降低（P<0.01）,ALP和ARS水平明显降低（P<0.01）,miR-34c+Lenti-MALAT1组ADSCs中上述各项指标比较差异无统计学意义（P>0.05）。与Lenti-NC+miR-NC组比较,Lenti-SATB2+miR-NC组ADSCs中Runx2、OPN和OCN蛋白表达水平及ALP和ARS水平明显升高（P<0.01）,Lenti-SATB2+miR-34c组上述各项指标差异无统计学意义（P>0.05）。结论：LncRNA MALAT1通过miRNA-34c/SATB2轴促进ADSCs的成骨分化。     

RNA干扰Axin2对大鼠骨髓基质干细胞的成骨分化表达的影响

目的 通过对大鼠Axin2基因的RNA干扰(RNAi),探讨Axin2对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)向成骨细胞分化过程的影响.方法 取6周龄雌性SD大鼠双侧股、胫骨骨髓细胞,采用全骨髓培养法进行原代和传代培养.细胞传2代后实验组进行Axin2 mRNA干扰质粒转染,对照组进行阴性干扰质粒转染.转染48 h后换用成骨诱导分化培养基.诱导分化28 d后用 von Kossa方法进行细胞外基质矿化染色.采用适时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)技术检测诱导分化后第7、14天β-catenin、骨钙素(OCN)、frizzled-2、Lef-1、Wnt5a mRNA的表达水平.结果 对照组大鼠BMSCs经体外诱导后分化为具备矿化细胞外基质能力的成熟成骨细胞,而实验组BMSCs成骨分化不全;RQ-PCR检测显示,诱导分化后第7天实验组β-catenin、frizzled-2 mRNA表达水平显著低于对照组,而OCN、Lef-1、Wnt5a mRNA表达水平显著高于对照组;诱导分化后第14天实验组frizzled-2、Lef-1和Wnt5a mRNA表达水平均显著高于对照组(P<0.05).结论 对大鼠BMSCs Axin2进行RNAi后,BMSCs向成骨细胞分化晚期细胞外基质矿化能力减弱.     

褪黑素对内蒙古绒山羊毛囊干细胞增殖和迁移的影响及机制探讨

目的:探讨褪黑素对内蒙古绒山羊毛囊干细胞增殖和迁移的影响及机制.方法:将培养后的内蒙古绒山羊毛囊干细胞分为空白对照组、褪黑素干预A组、褪黑素干预B组、褪黑素干预C组、IWR-1组、褪黑素+IWR-1组,利用CCK8实验检测各组细胞增殖活性,Transwell细胞迁移实验检测各组细胞的迁移数目.经Western Blot法检测各组LEF-1、β-catenin蛋白相对表达量.结果:伴随褪黑素浓度的增加,毛囊干细胞的活力值、迁移细胞数目有显著升高趋势.IWR-1组的细胞活力值、迁移细胞数目均显著低于褪黑素干预组(P<0.05);褪黑素+IWR-1组的细胞活力值、迁移细胞数目均显著高于IWR-1组(P<0.05).Western-blot检测结果显示,褪黑素干预组的β-catenin蛋白、LEF-1蛋白的相对表达量明显高于空白对照组(P<0.05);IWR-1组的β-catenin蛋白、LEF-1蛋白的相对表达量显著低于褪黑素干预组(P<0.05);褪黑素+IWR-1组的β-catenin蛋白、LEF-1蛋白的相对表达量显著高于IWR-1组(P<0.05).结论:褪黑素可能通过激活典型的Wnt/β-catenin通路促进毛囊干细胞的增殖与迁移.     

龙血竭总黄酮对心肌缺血再灌注损伤大鼠Wnt/β-catenin 蛋白表达的影响及其临床意义

目的 探讨龙血竭总黄酮(SDF)对心肌缺血再灌注损伤(MIRI)大鼠Wnt/β-catenin蛋白表达的影响及其临床意义。方法 将50只雄性SD大鼠随机分为5组，每组10只，分别为假手术(sham)组、心肌缺血再灌注模型(MIRI)组、模型+Wnt/β-catenin抑制剂(IWR-1)组、模型+龙血竭总黄酮灌胃(SDF)组、模型+Wnt/β-catenin抑制剂+龙血竭总黄酮灌胃(IWR-1+SDF)组，采用冠状动脉前降支结扎法构建MIRI大鼠模型。TTC染色评价造模情况和SDF对模型的作用效果；蛋白质印迹法(Western blot)检测Wnt2、β-catenin表达水平；ELISA法检测血清血管内皮生长因子(VEGF)水平。结果 TTC染色结果显示动物造模成功；SDF组Wnt2相对表达量为(1.74±0.18),显著高于sham组的(1.05±0.24)和MIRI组的(0.99±0.12),差异有统计学意义(P<0.05或0.01)。SDF组β-catenin相对表达量为(0.65±0.08),显著低于sham组的(1.10±0.07),差异有统计学意义(P<0.0...     

Wnt/β-catenin信号通路在体外调控诱导性多能干细胞向神经干细胞分化中的作用及机制研究

[目的]探讨Wnt/β-catenin信号通路在体外调控诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell,iPS)向神经干细胞分化中的作用及机制。[方法]体外培养小鼠iPS,采用N2B27培养基联合维甲酸(retinoic acid,RA)诱导法,诱导其向神经干细胞分化;免疫荧光法检测iPS来源神经干细胞中的巢蛋白(Nestin)、β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulinⅢ)的表达情况;将细胞分为正常组、Wnt3a组、Dickkopf相关蛋白-1(Dickkopf-1,DKK-1)组和IWR-1组,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,Real-time qPCR)、Western blot分别检测iPS神经分化过程中Nestin、β-tubulinⅢ及β-catenin的表达情况;采用悬浮培养法检测Wnt/β-catenin信号通路对iPS来源神经干细胞增殖能力的影响。[结果]iPS来源神经干细胞表达神经干细胞的表面特异性标志物Nestin,以及早期神经元特异性标志物β-tubulinⅢ;iPS向神经干细胞分化过程中,Nestin、β-tubulinⅢ的表达均升高(P0.05,P0.05),β-catenin表达降低(P0.05);采用Wnt3a处理后,iPS来源神经干细胞增殖能力较弱;采用DKK-1和IWR-1处理后,iPS来源神经干细胞增殖能力较强,且Nestin表达提高(P0.01),β-catenin表达降低(P0.05)。[结论]Wnt/β-catenin信号通路在iPS向神经干细胞诱导分化过程中受到抑制;采用DKK-1和IWR-1下调Wnt/β-catenin信号通路,可促进iPS向神经干细胞分化,提高iPS来源神经干细胞的增殖能力,提示Wnt/β-catenin信号通路在iPS向神经干细胞分化过程中具有负调控的作用。     

补肾强督方对骨髓间充质干细胞成骨过程Wnt通路中因子表达的影响

目的:研究补肾强督方含药血清对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨过程Wnt/β-catenin通路中因子表达的影响。方法:BMSCs细胞分为空白对照组、西药对照组、补肾强督方低中高剂量组,分别进行成骨诱导分化,茜素红染色法检测各组成骨程度,实时荧光定量PCR检测GSK3β、wnt5a和SOST基因mRNA表达,Western blot检测Wnt/β-catenin通路关键因子GSK3β、wnt5a和SOST蛋白表达。结果:空白组BMSCs成骨分化培养后可见明显矿化结节形成,补肾强督方干预组未见明显矿化结节。与空白对照组比较,补肾强督方含药血清组BMSCs中SOST、GSK3β蛋白表达显著升高,Wnt5a蛋白的表达显著降低(P<0.05)。与空白对照组比较,补肾强督方含药血清组BMSCs中SOST、GSK3βmRNA的表达显著升高,Wnt5a mRNA的表达显著降低(P<0.05)。结论:补肾强督方含药血清具有抑制强直性脊柱炎骨化的作用,其机制可能与抑制BMSCs成骨过程中的Wnt/β-catenin信号通路相关。     

转化生长因子-?茁1促进骨形态发生蛋白9诱导间充质干细胞成骨分化

目的：探讨转化生长因子?茁1（transforming growth factor-?茁1,TGF-?茁1）在骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）成骨分化过程中的作用。方法：应用鼠MSC C3H10T1/2,以重组腺病毒法将BMP9导入,施加TGF-?茁1处理,建立BMP9联合TGF-β1诱导MSC成骨分化模型。改良SEAP化学发光法检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）活性;茜素红S染色进行钙盐沉积检测;实时荧光定量PCR检测成骨相关基因Ⅰa2型胶原（collagenⅠa2,COLⅠa2）、骨桥素（osteopotin,OPN）、骨钙素（osteocalcin,OCN）的mRNA转录表达水平,免疫细胞化学法检测细胞内OPN、OCN表达变化。荧光素酶报告基因法检测信号通路的Smad水平。结果：TGF-?茁1与BMP9联合处理较BMP9单独处理能更早更多地提高ALP活性和引起钙盐沉积（F处理=18 782.10,P=0.000）,持续处理达17 d后不再显示明显差异,TGF-?茁1单独处理与对照组间无明显差异（F=1.03,P=0.318）。TGF-?茁1与BMP9联合处理较BMP9单独处理可使COLⅠa2、OPN、OCN mRNA转录水平明显增高（COLⅠa2的F处理=250.30,P=0.000;OPN 的F处理=795.64,P=0.000;OCN的F处理=206.55,P=0.000）,COLⅠa2增高发生较早和显著（F=250.30,P=0.000）;细胞内OPN、OCN蛋白阳性表达显著增强。TGF-β1联合BMP9处理能刺激信号通路相应的Smad荧光素报告活性（?字2=32.84,P=0.000）。结论：在BMP9诱导MSC成骨分化中,联合应用TGF-?茁1具有促进成骨作用,BMP9与TGF-?茁1在成骨分化中可能存在互补效应。     

2型糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞中Dickkopf-1蛋白的表达水平及其与成骨活性的关系

目的：检测2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)生长活性及成骨分化能力,以及Dickkopf-1(DKK-1)蛋白在BMSCs诱导成骨过程中的表达水平,探讨T2DM对 BMSCs成骨活性的影响及其与DKK-1表达的关系。方法：提取并分离T2DM造模大鼠BMSCs,进行体外培养与成骨诱 导,并将其分为T2DM组和正常对照组;采用细胞计数试剂盒检测BMSCs增殖活性;采用膜联蛋白V(annexin V)-异硫 氰酸荧光素(fl uorescein isothiocyanate,FITC)/ 碘化吡啶(propidium iodide,PI)双染法检测细胞凋亡率;采用碱性磷酸酶 (alkaline phosphatase,ALP)染色及ALP活性检测试剂盒检测BMSCs中ALP表达水平;采用茜素红染色与矿化结节定量法 分析BMSCs成骨分化程度;采用实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR)法检测大鼠BMSCs中核心结合 因子a1(core binding factor alphal 1,Runx2)和DKK-1的表达。结果：T2DM组大鼠BMSCs增殖活性比正常对照组弱,细 胞凋亡增加(均P<0.01);BMSCs成骨诱导过程中,T2DM组大鼠ALP表达量比正常对照组显著降低,且钙结节形成减 少,Runx2表达下调(均P<0.01);T2DM组BMSCs中DKK-1蛋白和mRNA表达上调,高于正常对照组(均P<0.01);DKK-1 蛋白和mRNA表达与Runx2的表达升高有关(均P<0.01)。结论：T2DM造模大鼠BMSCs的生长活性及成骨分化潜能受 损,这可能与BMSCs中DKK-1表达升高有关。