刚地弓形虫TgPRF的原核表达、多克隆抗体制备与应用

目的 原核表达弓形虫TgPRF蛋白,制备多克隆抗体并评价其作为内参抗体的可行性。方法 以刚地弓形虫RH株速殖子cDNA为模板,PCR扩增TgPRF编码基因,克隆至pGEX-4T-1载体,转化至大肠埃希氏菌（Escherichia coli）BL21。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析重组蛋白表达情况。利用GST标签亲和层析法纯化重组蛋白。以纯化后蛋白为抗原免疫新西兰大白兔,制备抗TgPRF多克隆抗体。收集弓形虫RH株速殖子,以制备的多克隆抗体为一抗,Western blotting检测抗体特异性及效价。收集ATc调控下不同时间点的弓形虫iKO-Ty-TgAPH虫株速殖子进行Western blotting,以抗Ty和抗TgPRF抗体为一抗,检测TgAPH和TgPRF表达量的变化。结果 SDS-PAGE显示：TgPRF在诱导4 h后表达量趋于饱和,相对分子量为52 ku,且呈可溶性表达。弓形虫RH株速殖子总蛋白进行的Western blotting显示：抗TgPRF多克隆抗体可识别内源性的TgPRF,且该多克隆抗体稀释至1∶10 000时仍可见明显条带;iKO-Ty-TgAPH虫株速殖子总蛋白进行的Western blotting显示：TgAPH的表达量随ATc作用时间的增加呈递减趋势,而TgPRF表达量基本维持恒定。结论 本实验制备的抗TgPRF多克隆抗体特异性和效价良好,可作为衡量弓形虫特定蛋白表达量的内参抗体,也可直接检测内源性TgPRF的表达。     

癌症转移相关基因Syntenin1多克隆抗体的制备与鉴定

目的 获得原核表达GST-Syntenin1融合蛋白,制备高效价的抗Syntenin1多克隆抗体.方法 RT-PCR扩增Syntenin1 cDNA开放阅读框(CDS)序列,亚克隆到编码GST的pGEX-4T-2原核表达载体上,将编码Syntenin1的pGEX-4T-2-Syntenin1重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-Syntenin1融合蛋白表达,对融合蛋白亲和纯化.SDS-PAGE鉴定后,将纯化的融合蛋白辅以弗氏佐剂,免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western blot检测抗体效价及特异性.结果 成功制备GST-Syntenin1融合蛋白及多克隆抗体.Western blot结果表明Syntenin1兔多克隆抗体效价可达到1∶20 000,且与Syntenin1蛋白特异结合.结论 成功制备Syntenin1多克隆抗体,为进一步研究Syntenin1基因的功能奠定了基础.     

GST-hZimp10融合蛋白的重组及抗体制备

目的:构建pGEX-4T-1/hZimp10重组质粒,并在大肠杆菌中表达,纯化出GST-hZimp10融合蛋白,用以制备抗hZimp10抗体。方法:采用PCR技术以pcCDNA3.1-Flag-hZimp10为模板,扩增出hZimp10蛋白N端128个氨基酸对应DNA片段,并将其与谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1进行重组,酶切鉴定后获得重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达,获得GST-hZimp10融合蛋白,纯化后将其作为抗原免疫家兔制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,Western blotting法检测抗体特异性。结果:经BamHⅠ和XhoⅠ 双酶切鉴定,确定PGEX-4T-1/ hZimp10重组质粒中包含384bp的片段,与测序结果一致,表明pGEX-4T-1/hZimp10重组质粒构建成功。SDS-PAGE电泳,融合蛋白成功表达,蛋白相对分子质量大小与预期相符。间接ELISA法检测抗hZimp10抗体效价可达1:100 000以上。Western blotting法,hZimp10在LNCaP细胞中具有很高的特异性。结论:成功获得GST-hZimp10融合蛋白,且制备了抗hZimp10抗体。     

弓形虫棒状体蛋白18的原核表达及鉴定

目的: 原核表达刚地弓形虫RH株棒状体蛋白(rhoptry proteins, ROPs)18,建立检测和定位虫体ROP18蛋白的方法。方法: 运用PCR技术扩增弓形虫RH株速殖子ROP18基因,克隆至pET-28a(+)载体,转化至大肠埃希菌Rosetta中诱导表达,经KCl染色切胶纯化重组ROP18蛋白,并制备其兔多克隆抗体。采用蛋白质印迹技术和间接免疫荧光技术(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测和定位ROP18在弓形虫速殖子体内的表达。结果: 成功表达重组ROP18蛋白,并获得其多克隆抗体。经蛋白质印迹技术检测出虫体ROP18特异性条带,IFA技术检测出ROP18分布于虫体棒状体。结论: 通过制备多克隆抗体,利用蛋白质印迹技术和IFA技术能检测和定位ROP18蛋白在弓形虫体内表达。     

GST-PPARγC1原核表达载体的构建、表达及抗GST-PPARγC1多克隆抗体的制备

目的 在大肠杆菌中表达过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1(PPARγC1)与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白，并制备抗PPARγC1的多克隆抗体。方法 从肝癌细胞系HepG2提取总RNA，用RT-PCR扩增出PPARγC1 cDNA的编码序列，克隆入表达载体pGEX-4T-1中，重组载体在酶切鉴定后，在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-PPARγC1蛋白，SDS-PAGE分析表达产物，通过亲和层吸法纯化表达的GST-PPARγC1融合蛋白，并以此为抗原制备多克隆抗体。Western blotting检测重组抗原的免疫活性。结果 经测序、酶切鉴定证明，PPARγC1基因已正确插入到pGEX-4T-1中，经IPTG诱导后，表达出相对分子量为44000的融合蛋白。Western blotting鉴定所制备的多克隆抗体可以与PPARγC1特异性结合。结论 PPARγC1片段在大肠杆菌中的成功表达及制备得到的多克隆抗体，为检测PPARγC1及其在其他组织中的表达提供了一种检测途径。     

Smarcad1重组蛋白表达及多克隆抗体验证

目的:建立稳定的实验室多克隆抗体制备流程，选择Smarcad1作为目的基因进行重组蛋白表达纯化与多克隆抗体制备，并对其进行特异性验证。方法:以本实验室的pcDNA3.1-Flag-Smarcad1质粒作为模板，构建pET-16b-Smarcad1-F1原核表达质粒。表达Smarcad1-F1蛋白，并纯化。利用蛋白质免疫印迹，蛋白质免疫共沉淀和免疫荧光实验检测抗体特异性。结果:PCR鉴定结果显示，成功构建pET-16b-Smarcad1-F1表达质粒。蛋白表达纯化实验中，考马斯亮蓝染色检测，相较于诱导前，加入IPTG后Smarcad1蛋白成功诱导表达，且纯化出分子量为27 kD的目的蛋白。Western印迹证明，制备的抗体能够特异性识别内源性Smarcad1蛋白。蛋白质免疫共沉淀实验显示，相较于对照组，制备的抗体能够与Smarcad1蛋白结合。免疫荧光实验检测所制备抗体的特异性，结果显示制备的抗体可以特异性识别内源性Smarcad1蛋白。结论:成功构建了Smarcad1原核表达质粒，利用原核蛋白表达纯化出Smarcad1蛋白，利用该蛋白制备的抗体可以特异性识别内源性Smarcad1蛋白，为后续原核表达蛋白及多克隆抗体制备提供思路。     

间日疟原虫MSP1 C重组蛋白的制备及其在血清学诊断中的应用

目的在大肠埃希菌（E，coli）中表达、纯化间日疟原虫裂殖子表面蛋1C端重组蛋白（rGST—PvMSP1C）作为诊断抗原，评价其在间日疟血清学诊断中的应用价值。方法将含有重组质粒pGEX-4T-2／PvMSP1C的工程菌E．coil BL21（DE3）以IPTG进行诱导表达，表达产物以SDS—PAGE与Western—blot免疫印迹进行鉴定；采用GST融合蛋白层析柱进行分离纯化；以纯化重组蛋白包被酶标板，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测间日疟患者血清中的特异性IgG抗体。结果含有重组质粒pGEX-4T-2／PvMSP1C工程菌经IPTG诱导表达的rGST—PvMSP1C重组蛋白大小约63ku，能够被间日疟患者的血清所识别。纯化的重组蛋白SDS—PAGE电泳显示一条预期大小的蛋白条带；以重组蛋白作诊断抗原，67份镜检阳性的间日患者血清标本ELISA均为阳性。55份健康人血清ELISA均为阴性．5份恶性疟患者血清及7份血吸虫患者血清检测结果亦为阴性。结论在大肠埃希菌中表达纯化的间日疟原虫rGST—PvMSP1C蛋白具有免疫反应性，以其作为诊断抗原建立的血清中特异性IgG抗体ELISA检测方法具有良好敏感性和特异性，在间日疟的免疫学诊断中具有一定的推广使用价值。     

重组人 HER3 胞外域Ⅰ区 183-227aa 的原核表达及大鼠多克隆抗体的制备与鉴定

目的 原核表达、纯化由人表皮生长因子受体3（HER3）183-227aa肽段（HER3Ⅰ）和麻疹病毒蛋白288-302aa肽段（MVF）融合构建的重组肽（MVF-HER3Ⅰ），并制备其多克隆抗体。方法 将MVF与HER3Ⅰ融合构建重组肽MVF-HER3Ⅰ，用化学合成法合成重组肽基因，并将其与pET21b质粒和含有硫氧还蛋白（Trx）基因的pET32a质粒连接构建重组肽表达质粒，重组质粒用双酶切法鉴定。将重组质粒导入到大肠杆菌BL21（DE3）并进行表达参数优化及诱导表达。融合蛋白依次经镍离子亲和层析、肠激酶酶切和再次镍离子亲和层析制备重组肽。表达和纯化过程中的样品纯度和相对分子质量用SDS-PAGE分析。以纯化的重组肽为抗原免疫大鼠制备多克隆抗体。用ELISA法测定抗重组肽多克隆抗体效价，免疫印迹和免疫沉淀法分析抗重组肽多克隆抗体对重组肽和非变性状态HER3的识别，激光共聚焦法分析抗重组肽多克隆抗体与MCF7 细胞的结合，磺酰罗丹明B染色法测定在有无神经调节素刺激下抗重组肽多克隆抗体对高表达HER3的MCF7细胞的增殖抑制作用。结果 成功构建了重组肽的两种表达质粒，重组肽基因不能单独表达，但和Trx融合后可在37 ℃、0.2 mmol/L IPTG条件下呈可溶高表达。融合蛋白经亲和层析、酶切和再次亲和层析后得到重组肽。重组肽可刺激大鼠产生效价达1:512 000的抗重组肽多克隆抗体。该抗体不仅可特异性识别重组肽,还可特异性沉淀非变性HER3和结合于MCF7细胞的细胞膜。不管有无神经调节素刺激，该抗体均呈浓度依赖性地抑制HER3高表达的MCF7细胞的增殖（P<0.01）。结论 成功进行了重组肽 MVF-HER3Ⅰ的原核表达和纯化，制备并鉴定了抗MVF-HER3Ⅰ多克隆抗体，为在体内外深入研究该抗体对HER3信号通路的影响打下基础。     

蛋白激酶SGK2α在大肠杆菌中的表达纯化及抗体制备

目的 该研究通过SGKα基因的克隆、原核蛋白表达以及纯化,制备抗SGK2α抗体,为进一步研究SGK2α蛋白的生物学功能奠定基础.方法 利用原核表达载体PGEX-4T-3构建重组质粒,并在大肠杆菌中通过IPTG诱导表达;亲和层析法纯化重组蛋白:以纯化的重组蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔制备抗SGK2α多克隆抗体,ELISA方法检测抗体效价,免疫印迹法检测抗体的特异性.结果 构建了PGEX-4T-3-SGK2α原核表达质粒,经原核表达和亲和层析获得GST-SGK2α融合蛋白,蛋白纯度在90%以上;利用GST-SGK2α融合蛋白制备多克隆抗体,抗体效价阳性且具有较强的特异性.结论 利用原核表达的GST-SGK2α融合蛋白成功地制备了抗SGK2α多克隆抗体,可用于免疫组织化学和免疫印迹检测以及功能研究.     

Clusterin蛋白在大肠杆菌中的表达及其多抗制备

目的：在大肠杆菌中表达Clusterin蛋白,并制备其兔抗Clusterin蛋白的多克隆抗体。方法：从MCF-7细胞提取mRNA,逆转录为eDNA,以此为模板PCR扩增Clusterin编码基因;将Clusterin编码区eDNA插入的pRSET-A原核表达载体,构建pRSET-A-elusterin;将重组质粒转化BL21（DE3）感受态细菌,以IPTG诱导6×His-C1usterin融合蛋白的表达,经亲和纯化柱与凝胶柱进行层析纯化。经SDS-PAGE和Western-blot鉴定后,将纯化的融合蛋白与弗氏佐剂混合制备成油包水悬液,常规免疫新西兰大白兔制备多抗,Western-blot检测该抗体识别内源性clusterin的特异性。结果：成功构建了Clusterin蛋白的原核表达载体pRSETA-clusterin;经表达并纯化的Clusterin蛋白纯度达到98％以上,免疫新西兰大白兔后制备得到了特异性的抗Clusterin的多抗。结论：成功地表达并纯化了Clusterin蛋白,并制备了特异性抗Clusterin多抗。     

GST-PPARγC1原核表达载体的构建、表达及抗GST-PPARγC1多克隆抗体的制备

目的 在大肠杆菌中表达过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1(PPARγC1)与谷胱甘肽-S转移酶(GST)的融合蛋白,并制备抗PPAR γC1的多克隆抗体.方法 从肝癌细胞系Hep G2提取总RNA,用RT-PCR扩增出PPAR γ C1 cDNA的编码序列,克隆人表达载体pGEX-T-1中,重组载体在酶切鉴定后,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST-PPARγC1蛋白,SDS-PAGE分析表达产物.通过亲和层吸法纯化表达的GST-肿ARγC1融合蛋白,并以此为抗原制备多克隆抗体.Westernblotting检测重组抗原的免疫活性.结果 经测序、酶切鉴定证明,PPARγC1基因已正确插入到pGEX-T-1中,经IPTG诱导后,表达出相对分子量为000的融合蛋白.Western blotting鉴定所制备的多克隆抗体可以与PPARγC1特异性结合.结论 PPARγC1片段在大肠杆菌中的成功表达及制备得到的多克隆抗体,为检测PPARγC1及其在其他组织中的表达提供了一种检测途径.     

幽门螺杆菌儿童分离株中性粒细胞激活蛋白克隆及表达序列

目的：从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1基因组扩增中性粒细胞激活蛋白（NAP）基因,克隆入T载体,并亚克隆入表达载体pGEX-4T-1,进行测序及基因比对分析,为幽门螺杆菌疫苗研制奠定基础.方法：根据GenBank中幽门螺杆菌NAP序列,设计一对特异性引物扩增幽门螺杆菌临床儿童分离株NAP全长基因,与T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,提取质粒进行酶切、测序鉴定,经EcoR Ⅰ、Not Ⅰ双酶切后与做相应酶切的pGEX-4T-1连接,转化大肠杆菌BL21,提取质粒进行双酶切鉴定,IPTG诱导重组蛋白表达,并对基因进行测序及比对分析.结果：以幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1为模板,成功扩增了NAP基因,基因大小为435 bp,重组pGEX-4T-1-NAP双酶切鉴定可见目的片段,测序结果显示NAP在正确读框中,序列比对分析显示其与幽门螺杆菌J99株氨基酸一致性达99.2％,IPTG诱导后,pGEX4T-1-NAP/BL21在相应分子量（42.8 kD）可见融合蛋白的表达.幽门螺杆菌儿童分离株GZCH1 NAP序列已登录GenBank（登录号：GU301881）.结论：从幽门螺杆菌临床儿童分离株GZCH1中成功克隆了NAP基因,并获得重组蛋白的表达,为NAP幽门螺杆菌疫苗研制奠定了良好的基础.     

弓形虫ROP2基因的体外扩增及真核表达重组质粒的构建

目的 构建弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）基因真核表达重组质粒，方法 根据ROP2基因已知序列，设计合成一对引物，上，下游引物分别引入EcoRI,SalI酶切位点，用PCR方法从弓形虫RH株基因组DNA中扩增编码ROP2的基因片段，插入pGEX-4T-1质粒，构建原核表达重组质粒pGEX-4T-1-ROP2，而后经EcoRI,NotI双酶切除ROP2基因片段，再亚克隆到载体pcDNA3中构建真核表达重组质粒pcDNA3-ROP2。结果 ROP2基因体外扩增产物大小约1043bp，重组质粒经酶切及PCR鉴定表明获得正确重组子，克隆基因测序结果与已知序列基本吻合。结论 在国内首次克隆了弓形虫ROP2基因并构建了真核表达质粒pcDNA3-ROP2。为下一步弓形虫DNA疫苗研究打下了基础。     

弓形虫GRA7基因在大肠埃希菌中的表达

目的　在大肠埃希菌中表达致密颗粒蛋白(GRA7)。方法　将弓形虫GRA7基因克隆入原核表达载体p GEX- 4 T- 1,构建重组质粒p GEX- 4 T- 1/GRA7并转化大肠埃希菌BL2 1。IPTG体外诱导重组质粒菌的表达,对表达的GRA7融合蛋白进行SDS- PAGE和Western- blotting分析。结果　成功构建了p GEX- 4 T- 1/GRA7重组质粒,该重组质粒在大肠埃希菌中表达了目的蛋白,该蛋白能与抗GST抗体结合。结论　GRA7基因在大肠埃希菌中以GST融合蛋白的形式得到表达。     

A型流感病毒核蛋白原核表达载体的构建与表达

目的:构建A型流感病毒核蛋白(NP)的原核表达质粒,分析其在大肠杆菌中的表达状况.方法:采用逆转录聚合酶链式反应技术从A型流感病毒基因组中扩增出编码核蛋白的基因片段,克隆至pGEM-T Easy载体,PCR筛选阳性克隆并测序.经酶切后将目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-1,转化大肠杆菌BL2(CDE3),PCR和酶切鉴定转化菌落.将阳性菌落经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹分析目的蛋白的表达.结果:RT-PCR扩增出NP基因序列,将其亚克隆至表达载体pGEX-4T-1构建成重组表达质粒,并在BL2(CDE3)中表达了NP融合蛋白.结论:成功构建A型流感病毒NP的重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达了NP融合蛋白.