糖原合成酶激酶-3β磷酸化 促进人腹膜间皮细胞转分化的实验研究

目的：探讨糖原合成酶激酶（GSK）-3β磷酸化在人腹膜间皮细胞(HPMC)转分化中的作用。方法：从人腹膜组织中分离和培养人原代腹膜间皮细胞。观察GSK-3β抑制剂氯化锂（LiCl）对HPMC GSK-3β磷酸化的影响,在不同时间点（0,1,3,6,12 h）和不同浓度（0,5,10,20,40 mmol/L）LiCl下Western 印迹检测p-GSK-3β和总GSK-3β表达水平的变化。Western 印迹检测20 mmol/L LiCl作用HPMC不同时间,α-SMA和E-cadherin蛋白的表达。间接免疫荧光染色方法检测α-SMA的表达和分布。结果：LiCl促进HPMC GSK-3β磷酸化在一定范围内呈浓度依赖性和时间依赖性（P＜0.05）,但总GSK-3β水平不变（P＞0.05）。20 mmol/L LiCl干预HPMC 24 h后,α-SMA表达显著增高（P＜0.05）,E-cadherin表达显著下调（P＜0.05）。间接免疫荧光结果显示20 mmol/L LiCl作用24 h后α-SMA表达显著增高（P＜0.05）。结论：GSK-3β磷酸化能诱导HPMC发生上皮-间质细胞转分化,为治疗腹膜纤维化提供了新的思路。     

红景天苷对TNF-α诱导的人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞增殖的抑制作用及其意义

目的：探讨红景天苷对肿瘤坏死因子α（TNF-α）诱导的人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞（HFLS-RA）增殖的抑制作用,阐明其控制类风湿关节炎（RA）的分子机制。方法：体外培养HFLS-RA,采用TNF-α及不同浓度红景天苷处理细胞,分为正常对照组（0.0μg·L^-1TNF-α）、模型对照组（10.0μg·L^-1TNF-α）及12.5、25.0、50.0、100.0μmol·L^-1红景天苷组（10.0μg·L^-1TNF-α＋相应浓度红景天苷）。MTT法检测HFLS-RA的增殖活力,ELISA法检测细胞上清液中β-catenin、基质金属蛋白酶7（MMP-7）和Cyclin-D1表达水平,Western blotting法检测细胞中β-catenin蛋白表达水平。结果：与正常对照组比较,模型对照组HFLS-RA增殖活力明显升高（P<0.05）。与模型对照组比较,12.5和25.0μmol·L^-1红景天苷组HFLS-RA增殖活力虽降低,但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）;50.0和100.0μmol·L^-1红景天苷组HFLS-RA增殖活力降低（P<0.05）。与正常对照组比较,模型对照组细胞上清液中β-catenin、MMP-7和Cyclin-D1表达水平明显升高（P<0.05）。与模型对照组比较,12.5和25.0μmol·L^-1红景天苷组细胞上清液中β-catenin、MMP-7和Cyclin-D1表达水平虽降低,但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）;50和100μmol·L^-1红景天苷组细胞上清液中β-catenin、MMP-7和Cyclin-D1表达水平明显降低（P<0.05）。Western blotting法检测,模型对照组细胞中β-catenin蛋白表达水平明显高于正常对照组（P<0.01）;12.5和25.0μmol·L^-1红景天苷组细胞中β-catenin蛋白表达水平虽低于模型对照组,但组间比较差异无统计学意义（P>0.05）;50.0和100.0μmol·L^-1红景天苷组细胞中β-catenin蛋白表达水平低于模型对照组（P<0.05）。结论：红景天苷可抑制HFLS-RA的增殖,其控制RA的机制可能与Wnt/β-catenin信号通路的调控有关联。     

大黄酸通过Wnt/β-catenin信号通路抑制喉癌细胞的增殖、迁移和侵袭

目的 探讨大黄酸对喉癌Hep-2细胞增殖、侵袭和迁移的作用及其与Wnt/β-catenin信号通路的关系。方法 利用低、中、高浓度（6、12、24μmol/L）大黄酸处理喉癌Hep-2细胞,通过MTT法、划痕实验、Transwell法分别检测细胞的增殖、迁移和侵袭能力,应用实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测β-catenin、Dvl2、GSK-3β和p-GSK-3β在Hep-2细胞中的表达水平。结果 随着大黄酸浓度的增大,喉癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力显著减弱（P <0.05）。大黄酸可降低喉癌细胞Dvl2、p-GSK-3β和β-catenin蛋白的表达水平（P <0.05）,增加GSK-3β蛋白的表达（P <0.05）。使用SKL2001激活Wnt/β-catenin信号通路,能够逆转大黄酸对Hep-2细胞迁移和侵袭的抑制作用（P <0.05）;使用XAV939抑制Wnt/β-catenin信号通路,能够降低Dvl2、p-GSK-3β和β-catenin的蛋白表达水平（P <0.05）,进一步加强大黄酸对Hep-2细胞迁移的抑制作用（P <0.05...     

Wnt/β-catenin通路相关蛋白在复发胶质瘤中的表达及其临床意义

目的 探讨低级别和高级别复发脑胶质瘤中Wnt/β-catenin通路中相关蛋白β连接素（β-catenin）、磷酸化糖原合成激酶3β（p-GSK-3β）、结肠腺瘤性息肉病蛋白（APC）和轴抑制蛋白（Axin）的表达及其临床意义.方法 采用免疫组化方法检测10例正常脑组织和30例各级别复发胶质瘤标本中β-catenin、p-GSK-3β、APC及Axin蛋白的表达.结果 β-catenin蛋白在正常脑组织中不表达,在复发胶质瘤组织的阳性表达率为100％ （P ＜0.01）;p-GSK-3β蛋白、APC蛋白、Axin蛋白在正常脑组织中表达率（分别为90％、100％、100％）高于在复发胶质瘤组织的阳性表达率（分别为26.7％、13.3％、10％）（P ＜0.01）;β-catenin在复发低级别胶质瘤和高级别胶质瘤中的阳性表达率均为100％;p-GSK-3β、APC、Axin蛋白在复发低级别胶质瘤阳性表达率（分别为35.7％、28.6％、21.4％）高于在复发高级别胶质瘤中的阳性表达率（分别为18.8％、0％、0％）（P＜0.05）.结论 β-catenin、GSK-3β、APC、Axin蛋白异常表达与复发脑胶质瘤发生密切相关,且磷酸化GSK-3β、APC及Axin蛋白低表达或不表达与胶质瘤恶性程度有关.     

双氢青蒿素通过Wnt/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞的增殖和侵袭

目的 探讨双氢青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响及其可能的分子机制.方法 用不同浓度(10、20、40 μmol/L)的DHA分别作用于人胃癌BGC-823和SGC-7901细胞,采用MTT法、划痕实验、Transwell法和流式细胞术分别检测细胞的增殖能力、迁移能力、侵袭能力和细胞周期与凋亡情况.Western blot检测细胞中DVL2、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin和Cyclin D1等蛋白的表达量.结果 不同浓度的DHA可以抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭,且呈浓度依赖性增长(P＜0.05).DHA作用48 h后,细胞S期比例显著增加,诱导细胞凋亡(P＜0.05).DHA 可以降低胃癌细胞Dvl2、p-GSK-3β、β-catenin和Cyclin D1的蛋白表达水平(P＜0.05),增加GSK-3β蛋白的表达(P＜0.05).同时,SKL2001激活Wnt/β-catenin信号通路,逆转DHA对胃癌细胞迁移和侵袭的抑制作用(P＜0.05);XAV939抑制Wnt/β-catenin信号通路,进一步加强DHA对胃癌细胞迁移和侵袭的抑制作用(P＜0.05).结论 DHA能有效抑制胃癌细胞的增殖、侵袭和迁移,阻滞细胞周期停留在S期,诱导胃癌细胞凋亡,其机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活有关.     

皮质酮预处理对脂多糖激活小胶质细胞NLRP3炎症小体的调节作用及鸡豆黄素A的保护作用

目的：研究皮质酮（CORT）预处理对脂多糖（LPS）激活小胶质细胞的NLRP3炎症小体是否有调节作用,鸡豆黄素A（BiochaninA）是否抑制其作用。方法：将常规培养的BV2细胞分为5组： Control组、CORT（50 ng/ml）组、LPS（10μg/ml）组、LPS（10μg/ml）+CORT（50 ng/ml）组、LPS（10μg/ml）+CORT（50 ng/ml）+ BiochaninA（5μM）组。除对照组外,各组先将入CORT（50 ng/ml）孵育2h,然后各组加入相应浓度的LPS（10μg/ml）和BiochaninA（5μM）共同孵育36h。采用MTT法检测细胞活力;采用DCFH-DA探针法检测ROS;采用Western-blot法检测各组细胞中5-HTT、ASC、Caspase-1、NLRP3、IL-6、GR、IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达水平。结果：与CORT（50 ng/ml）组和LPS（10μg/ml）组比较,CORT（50 ng/ml）+LPS（10μg/ml）组细胞活力增加,ROS的表达量也更高;与CORT（50 ng/ml）+LPS（10μg/ml）组比较,CORT（50 ng/ml）+ LPS（10μg/ml）+ BiochaninA（5μM）组细胞的活力降低,ROS的表达量也较低。Western-blot检测显示与CORT（50 ng/ml）组和LPS（10μg/ml）组比较,CORT（50 ng/ml）+LPS（10μg/ml）组细胞的5-HTT、ASC、Caspase-1、NLRP3、IL-6、GR、IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表达水平均增加;与CORT（50 ng/ml）+LPS（10μg/ml）组比较,CORT（50 ng/ml）+ LPS（10μg/ml）+ BiochaninA（5μM）组上述蛋白表达量低。结论：CORT预处理对LPS激活小胶质细胞NLRP3炎症小体的表达有上调作用,而BioA可以NLRP3炎症小体相关蛋白的表达。     

盐霉素对人膀胱癌5637细胞的生长抑制作用

目的：探讨盐霉素对人膀胱癌5637细胞生长、凋亡和侵袭力的影响，阐明其可能的作用机制。方法：取体外培养的对数生长期人膀胱癌5637细胞，分为空白对照组和不
同剂量（15、30和60 μmol?L-1）盐霉素组。MTT比色法检测各组人膀胱癌5637细胞的生长抑制率，流式细胞术检测各组人膀胱癌5637细胞的细胞凋亡率，Matrigel侵袭实验检测各组人膀胱癌5637细胞的侵袭能力，Western蛋白印迹实验检测各组人膀胱癌5637细胞中Wnt/β-catenin途径β-catenin蛋白表达水平。结果：与空白对照组比较，各剂量盐霉素组膀胱癌5637细胞的生长抑制率明显升高（P<0.05），细胞凋亡率明显升高（P<0.05），细胞穿膜数目减少（P<0.05），β-catenin蛋白表达水平减少（P<0.05）。与低剂量(15 μmol?L-1)盐霉素组比较，高剂量(60 μmol?L-1)盐霉组人膀胱癌5637细胞生长抑制率升高（P<0.05），细胞凋亡率升高（P<0.05），细胞穿膜数目减少（P<0.05），β-catenin蛋白表达量减少（P<0.05）。结论：盐霉素对人膀胱癌5637细胞的生长有较明显抑制作用，促进细胞凋亡，
降低细胞侵袭力，并且这种抑制作用可能是通过抑制Wnt/β-catenin信号传导途径来实现的。     

Ck2α、β-catenin和survivin在卵巢癌组织中表达 的检测及其临床应用价值

目的：研究酪蛋白激酶2α (Ck2α)、β-catenin和survivin在卵巢癌组织中的表达情况,分析三者在卵巢癌中表达的相关性,探讨其临床应用价值。方法： 采用免疫组织化学法检测8例卵巢单纯性囊肿组织、8例卵巢良性肿瘤组织和29例卵巢癌组织中Ck2α、β-catenin和survivin的表达情况,分析3种蛋白在卵巢癌中表达的相关性及与患者临床病理特征的关系。结果： 与卵巢单纯性囊肿和良性卵巢肿瘤组织比较,卵巢癌组织中Ck2α、β-catenin和survivin蛋白表达水平明显升高(P<0.05);卵巢癌组织中Ck2α与β-catenin和survivin表达水平呈正相关关系（r=0.438和r=0.479,P<0.05）; 在不同分化程度卵巢癌组织中,与低-中分化组比较,高分化组Ck2α、β-catenin和survivin蛋白阳性表达率明显降低(P<0.05);不同FIGO分期中,与Ⅰ期组比较,Ⅱ期组和Ⅲ期组Ck2α、β-catenin和survivin蛋白阳性表达率升高,3组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论：Ck2α、β-catenin和survivin在卵巢癌组织中的蛋白表达水平增加,且三者呈正相关,可能与卵巢癌的发生发展有关;Ck2α、β-catenin和survivin三者联合检测具有重要的临床应用价值。
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大鼠神经干细胞中PI3-K/AKT信号转导通路的研究

目的 应用PI3-K特异性阻滞剂LY294002孵育大鼠神经干细胞（NSCs）,探讨PI3-K/AKT信号转导通路在NSCs中的作用。方法 体外分离、培养E15～16 胎鼠NSCs,应用不同浓度（0~40 μmol/L）的LY294002孵育NSCs后进行细胞存活(WST-8检测)、增殖(BrdU免疫组织化学鉴定)、分化(β Tubulin-Ⅲ免疫组织化学鉴定)和AKT磷酸化蛋白水平(Western Blotting)的检测。结果 LY294002对NSCs的存活、增殖和分化的影响呈剂量依赖性。在LY294002较高浓度（25、30、35、40 μmol/L）时,NSCs的存活率明显下降（P<0.05）;LY294002为30、35、40 μmol/L时,BrdU阳性细胞数明显少于正常对照组（LY294002 0 μmol/L）（P<0.05）;LY294002为35、40 μmol/L时,β Tubulin-Ⅲ的阳性细胞数明显少于正常对照组（P<0.05）。LY294002 阻断AKT表达的作用呈剂量依赖性。结论 PI3-K/AKT信号转导通路对大鼠NSCs的存活、增殖、分化起重要作用。     

粉防己碱对心肌成纤维细胞增殖、活化的影响

目的： 探讨粉防己碱（tetrandrine,Tet）对大鼠心肌成纤维细胞增殖、活化的影响。方法： 采用细胞计数试剂盒（cell counting kit-8C,CCK-8）的方法检测不同浓度Tet对心肌成纤维细胞增殖的抑制作用;采用蛋白质印迹（Western blot）法检测Tet对由转化生长因子β(transforming growth factor-β,TGF-β）诱导的心肌成纤维细胞 β-链蛋白（β-catenin）、波形蛋白（vimentin,Vm）、纤连蛋白（fibronectin,Fn）及平滑肌α 肌动蛋白（smooth muscle α-actin,SMA）的表达上调的影响作用;采用实时荧光定量PCR的方法检测Tet作用下,TGF-β诱导的心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原（collagen-1,Col-1）和Ⅲ型胶原（collagen-3,Col 3）的表达上调的变化。结果：CCK-8检测结果显示,分别用0.5、1、2、4、8 μmol/L的Tet处理心肌成纤维细胞,其增殖活力分别下降至对照组的94.4%、84.9%、74.9%、63.8%、50.3%,差异有统计学意义（所有P值<0.05;1、2、4、8 μmol/L处理组P值<0.001）。Western blot检测结果显示：5 μg/L 的TGF-β显著上调β-catenin、Vm、Fn及SMA的表达（P值分别为0.001、0.008、0.010、0.001）,而用0.5 μmol/L的Tet预处理心肌成纤维细胞后,可以阻断由TGF-β诱导的β-catenin、Fn、SMA的表达上调（P值分别为0.009、0.005、0.019）,但不改变Vm的表达变化（P>0.05）。荧光定量PCR检测结果表明：用0.5 μmol/L的Tet预处理心肌成纤维细胞,可以减弱由TGF β诱导的Ⅰ型及Ⅲ型胶原的表达上调,差异有统计学意义（P<0.001）。结论：Tet可以显著抑制心肌成纤维细胞的增殖,并阻断由TGF-β诱导的心肌成纤维细胞活化,据此推断,Tet可能具有抗心肌纤维化的作用,进而阻断心肌重塑。     

伊马替尼抑制脂多糖诱导的巨噬细胞炎症表型

【目的】探讨伊马替尼（Ima）在体外对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7巨噬细胞炎症表型的影响。【方法】RAW264.7细胞在LPS（0.1μg/mL）或/和Ima（1μmol/L,5μmol/L）处理后,通过Q-PCR方法检测细胞因子IL-1β、IL-10、CCL2、iNOS、TNF-α和Arg1的mRNA表达变化;采用Western Blot检测iNOS蛋白表达变化以及NF-κB和MAPK信号通路活化情况;利用ELISA法检测细胞上清IL-1β、CCL2、IL-10和TNFα的蛋白表达情况。【结果】与对照组相比较,LPS刺激8h后,RAW264.7细胞内的炎症指标IL-1β、CCL2、iNOS和TNF-α的mRNA水平显著升高（P<0.001）以及抗炎指标IL-10的mRNA水平也明显升高（P<0.001）;LPS刺激24h后,细胞上清中IL-1β、IL-10、CCL2和TNF-α的蛋白水平显著上升（P<0.001）,细胞内iNOS蛋白表达以及p65,p38,ERK和AKT的磷酸化水平显著增加。和LPS组相比,Ima提前处理后,IL-1β、CCL2、iNOS和TNF-α的mRNA及蛋白水平显著下降（P<0.01,P<0.001）而IL-10的mRNA及蛋白水平显著升高（P<0.001）,这种抑制作用具有剂量依赖性。Ima的预处理抑制了LPS诱导的p65,p38,ERK和AKT磷酸化。单独用Ima处理RAW264.7细胞后,细胞的功能状态未见明显的改变。【结论】伊马替尼可抑制LPS诱导的巨噬细胞炎症表型,这种作用与抑制NF-κB和MAPK信号通路的过度激活有关。     

基于Wnt/β-catenin通路探究骨痹通方对软骨基质的保护作用及其机制

背景　骨痹通方对骨关节炎（OA）具有较好的临床治疗效果,对OA模型大鼠软骨具有良好的保护作用,但其具体作用机制尚不明确。目的　基于Wnt/β-catenin通路探究骨痹通方对软骨基质的保护作用及其机制。方法　本研究于2020年6-9月完成。采用3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTS）法检测SW1353软骨肉瘤细胞活力。通过白介素1β（IL-1β）介导的SW1353软骨肉瘤细胞建立OA细胞模型,设置A组、B组、C组、D组、E组,其中A组为空白对照,B组为阳性对照（加入10 μg/L的IL-1β）,C组、D组、E组加入10 μg/L的IL-1β后分别加入低剂量（625 mg/L）、中剂量（1 250 mg/L）、高剂量（2 500 mg/L）骨痹通方溶液。采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测基质金属蛋白酶1（MMP-1）、基质金属蛋白酶3（MMP-3）、基质金属蛋白酶13（MMP-13）mRNA表达情况,采用Western-blotting检测MMP-1、MMP-3、MMP-13、β-catenin蛋白表达情况,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测MMP-1、MMP-3、MMP-13分泌情况。结果　浓度为3 000 mg/L的骨痹通方溶液对SW1353软骨肉瘤细胞活力有一定抑制作用（P<0.05）。B组、C组、D组、E组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA相对表达量高于A组,但C组细胞MMP-1、MMP-3 mRNA相对表达量低于B组,D组、E组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA相对表达量低于B组、C组,E组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA相对表达量低于D组（P<0.05）。B组、C组、D组、E组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白相对表达量高于A组,但C组细胞MMP-1、MMP-3蛋白相对表达量及D组、E组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白相对表达量低于B组,D组细胞MMP-1、MMP-13及E组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白相对表达量低于C组,E组细胞MMP-1、MMP-3、MMP-13蛋白相对表达量低于D组（P<0.05）。B组、C组、D组、E组细胞上清液MMP-1、MMP-3、MMP-13含量高于A组,但C组、D组、E组细胞上清液MMP-1、MMP-3、MMP-13含量低于B组,D组、E组细胞上清液MMP-1、MMP-3、MMP-13含量低于C组,E组细胞上清液MMP-1、MMP-3、MMP-13含量低于D组（P<0.05）。分别在B组基础上加入5 μmol/L Wnt/β-catenin通路激活剂WAY-262611溶液（F组）、10 μmol/L地塞米松溶液（G组）。B组、C组、D组、E组、F组、G组细胞MMP-13、β-catenin蛋白相对表达量高于A组,F组细胞MMP-13、β-catenin蛋白相对表达量高于B组、C组、D组、E组、G组,但D组、E组、G组细胞MMP-13蛋白相对表达量及E组、G组细胞β-catenin蛋白相对表达量低于B组、C组,G组细胞MMP-13蛋白相对表达量及E组、G组细胞β-catenin蛋白相对表达量低于D组,G组细胞MMP-13、β-catenin蛋白相对表达量低于E组（P<0.05）。结论　骨痹通方对软骨基质具有一定保护作用且存在一定剂量依赖效应,抑制基质金属蛋白酶（MMPs）的过度表达及Wnt/β-catenin通路异常激活可能是其发挥软骨基质保护作用的重要机制。     

盐酸右美托咪定对H2O2诱导的肺泡巨噬细胞氧化应激的影响

目的: 观察α2肾上腺素受体激动剂盐酸右美托咪定是否能够对抗过氧化氢(H₂O₂)诱导的肺泡巨噬细胞氧化损伤。方法: 选择合适浓度H₂O₂和作用时间建立细胞氧化损伤模型,应用0.01,0.10,1.00 μmol/L浓度盐酸右美托咪定分别处理24 h后,再应用MTT比色法检测H₂O₂诱导的损伤细胞的存活率;用相应试剂盒测定细胞乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)释放量。结果: 50~300 μmol/L H₂O₂浓度依赖性地引起肺泡巨噬细胞氧化损伤,降低细胞存活率,增加LDH和TNF-α释放。0.01~1.00 μmol/L盐酸右美托咪定可以浓度依赖性地对抗H₂O₂诱导的细胞氧化损伤,使细胞存活率明显增加,减少LDH和TNF-α释放,这种作用具有剂量依赖性。α2受体拮抗剂育亨宾能够完全拮抗盐酸右美托咪定的这种保护作用,并且育亨宾本身对细胞的氧化损伤没有影响。结论: 盐酸右美托咪定能保护肺泡巨噬细胞对抗H₂O₂诱导的氧化应激损伤,此作用可能通过α2肾上腺素受体发挥作用。     

亚甲基蓝类似物抗谷氨酸诱导HT22细胞氧化损伤及其机制

目的：探讨亚甲基蓝（MB）类似物[2-氯吩噻嗪（2-C）、天青A（A-A）、天青B（A-B）、中性红（NR）]抗谷氨酸（Glu）诱导HT22细胞氧化损伤及其作用机制。方法：采用MTT法检测MB、2-C、A-A、A-B、NR在HT22细胞中的毒性；采用MTT法、LDH法检测各个化合物对Glu诱导HT22 细胞氧化损伤模型的保护作用；采用 H2DCF-DA染色剂检测各组细胞中ROS水平；采用siRNA干扰技术，抑制HT22细胞内MEF2D表达；采用Western blot法检测各个化合物对HT22细胞中肌细胞增强因子2D（MEF2D）、NADH脱氢酶6（ND6）、Akt、GSK-3β蛋白变化情况。结果：根据MTT实验结果计算各个化合物LD50：MB（50.66 μmol/L）、2-C（175.90 μmol/L）、A-A（152.40 μmol/L）、A-B（140.40 μmol/L）、NR（73.19 μmol/L）。除NR外，其余化合物均对Glu诱导的HT22 细胞氧化损伤具有显著的细胞保护作用，随后计算各个化合物EC50值得出：MB（42.13 nmol/L）、2-C（34.32 nmol/L）、A-A（48.96 nmol/L）、A-B（44.42 nmol/L）；ROS染色结果显示：100 nmol/L的MB、2-C、A-B和A-A能显著降低Glu诱导的HT22细胞中ROS水平，而NR对Glu诱导的HT22细胞中ROS水平上升无明显作用；Western blot检测结果证明MB、A-B和A-A明显提高HT22细胞内MEF2D的蛋白水平（P ＜0.05）；采用siRNA干扰技术抑制HT22细胞内MEF2D表达后，MTT结果显示抑制MEF2D表达能部分取消化合物MB、2-C、A-B和A-A对 Glu诱导HT22细胞损伤的保护作用（P ＜0.05）；MB、2-C、A-B和A-A能够激活Akt，增加GSK-3β磷酸化（P ＜0.05），使GSK-3β失活，这可能与其激活MEF2D进而提高ND6活性有关。结论：2-C与MB相比具有更低的细胞毒性，且其抗Glu诱导细胞损伤作用效价强于MB；具有吩噻嗪结构的化合物：MB、2-C、A-B和A-A可能通过调节Akt/GSK-3β通路，提高MEF2D/ND6活性，改善线粒体呼吸链功能，进而产生抗Glu诱导的神经细胞氧化损伤作用。     

低氧对体外培养的神经干细胞中Wnt/β-catenin 信号通路相关分子表达的影响

目的     观察常氧(20%O2)和低氧［(3%±2%)O2］条件下体外培养的神经干细胞(NSCs)中Wnt/β-catenin信号通路相关分子的表达,探讨低氧促进NSCs增殖的机制。方法    体外分离培养新生小鼠海马NSCs,分别置于常氧和低氧条件下进行培养,采用RT-PCR法检测NSCs中Wnt/β-catenin通路关键分子的表达情况,通过电穿孔转染荧光素酶报告基因质粒检测NSCs内Wnt/β-catenin信号通路对低氧的反应性,采用Western blot法检测低氧对β-catenin和CyclinD1表达的影响。结果    NSCs表达Wnt/β catenin信号通路的主要分子,且该通路对低氧具有明显的反应;经低氧培养后NSCs表达β-catenin、CyclinD1较常氧组明显增加(P<0.05)。结论    Wnt/β-catenin通路可能通过增加β-catenin及CyclinD1的表达促进体外低氧条件下NSCs的增殖。     

去铁胺在甲基汞诱导细胞铁死亡中的作用及其机制

目的: 探讨去铁胺预处理对甲基汞毒性作用的影响及其潜在的机制。方法: 选用大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞与大鼠肝BRL细胞,对照组用含10%胎牛血清的高糖培养基培养0.5 h,甲基汞组用不同浓度甲基汞(1.0、2.5、5.0、10.0 μmol/L)处理0.5 h,MTT法检测细胞活力,免疫印迹法检测谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPx4)蛋白表达,筛选最适浓度甲基汞。另取PC12细胞与BRL细胞,对照组用含10%胎牛血清的高糖培养基培养6.5 h,去铁胺+甲基汞组分别用0、50、100、200、400 μmol/L去铁胺预处理6 h,再用10.0 μmol/L甲基汞处理0.5 h,免疫印迹法检测GPx4及缺氧诱导因子-1α (hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)蛋白表达,MTT法检测细胞活力。结果： 与对照组相比,10.0 μmol/L甲基汞组两种细胞活力降低最显著,以此浓度进行后续实验;随着甲基汞浓度逐渐增加,两种细胞中GPx4表达逐渐降低。与0 μmol/L去铁胺+甲基汞组比较,随着去铁胺浓度增加,两种细胞中GPx4和HIF-1α蛋白表达逐渐增加;400 μmol/L去铁胺+甲基汞组PC12细胞活力明显增加,200 μmol/L去铁胺+甲基汞组BRL细胞活力明显增加。结论： 去铁胺可拮抗甲基汞致细胞的铁死亡,可能与上调HIF-1α及铁死亡关键调控因子GPx4表达相关。     

辛伐他汀对转β分泌酶HEK293细胞RhoA/ROCK途径及Aβ42生成的影响

目的 观察辛伐他汀(Sim)通过RhoA/ROCK途径对转β分泌酶(BACE1)-HEK293细胞分泌β-淀粉样蛋白(Aβ)的影响。方法 体外培养BACE1-HEK293细胞,在保证培养环境胆固醇充足的条件下分为对照组、1μmol/L Sim组、1μmol/L Sim+250μmol/L甲羟戊酸(Mev)组、5μmol/L Sim组、5μmol/L Sim +250μmol/L Mev组对细胞进行处理。MTT检测细胞存活率;ELISA检测Aβ42分泌量;Western blotting检测细胞膜RhoA及细胞浆磷酸化肌球蛋白磷酸酶肌球蛋白结合亚基(p-MYPT1)表达量。结果 MTT显示各组细胞存活率无差异(P>0.05); 1μmol/L Sim组和5μmol/L Sim组细胞分泌Aβ42较对照组减少(P<0.05); 两组细胞膜上RhoA及细胞浆p-MYPT1含量较对照组显著降低(P<0.01),分别加入250μmol/L Mev后能对抗Sim的作用(P<0.01)。结论 Sim可以通过降低胆固醇以外的途径减少RhoA蛋白的细胞膜定位和下游激酶ROCK的活化,抑制细胞Aβ42的分泌。     

丹酚酸A对心肌成纤维细胞在高浓度葡萄糖刺激下Wnt信号通路的影响

目的探讨丹酚酸A对高浓度葡萄糖诱导的心肌成纤维细胞（CFs）Wnt信号通路的影响及作用机制。方法采用高浓度葡萄糖刺激CFs构建细胞增殖模型,以22 mg/L卡托普利为西药对照,不同浓度丹酚酸A处理CFs。MTT比色法检测细胞的增殖能力,流式细胞术分析细胞增殖周期,ELISA法测定细胞中Ⅰ型、Ⅲ型胶原的生成和转化生长因子-β1（TGF-β1）蛋白的分泌,蛋白质印迹法检测β-catenin、GSK-3β、p-GSK-3β蛋白的表达水平。结果干预24、48 h,与模型对照组相比,25、50、100 mg/L丹酚酸A均可明显抑制细胞增殖（P < 0.01）。与模型对照组相比,25、50、100 mg/L丹酚酸A均能抑制CFs Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的分泌（P < 0.05~P < 0.01）;50、100 mg/L丹酚酸A均能明显抑制TGF-β1的合成及β-catenin的表达（P < 0.01）;100 mg/L丹酚酸A可以上调p-GSK-3β的表达（P < 0.05）。结论丹酚酸A可抑制高浓度葡萄糖诱导的CFs增殖、胶原蛋白分泌和TGF-β1的合成,其机制可能与抑制Wnt信号通路有关。