苯并芘激活ERK1/2信号通路促进气道平滑肌细胞外基质蛋白沉积对气道重塑的影响

目的 探讨苯并芘对人气道平滑肌细胞(HASMC)细胞外基质(ECM)蛋白沉积的影响及相关通路机制.方法 原代培养HASMC,将2～6代细胞用于实验.用实时荧光定量PCR和Western Blot法分别检测ECM的基因及蛋白的表达量;用Western Blot法分析ERK1/2的磷酸化水平.结果 苯并芘可以诱导HASMC胶原蛋白Ⅰα1(P＜0.01)及ECM蛋白(包括胶原蛋白Ⅰ α1、多功能蛋白聚糖、纤连蛋白、层粘连蛋白α2)mRNA表达增加(P＜0.05).苯并芘可引起ERK1/2磷酸化水平快速增高(P＜0.01);ERK通路抑制剂PD98059能显著抑制苯并芘诱导的胶原蛋白Ⅰ α1(P＜0.01)及ECM蛋白(包括胶原蛋白Ⅰ α1、纤连蛋白、多功能蛋白聚糖、层粘连蛋白α2) mRNA表达增加(P＜0.01).结论 苯并芘通过激活ERK1/2通路诱导HASMC中ECM蛋白沉积,阻断ERK1/2信号通路可以抑制苯并芘诱导的气道重塑.     

幽门螺旋杆菌毒力因子CagA介导的ERK信号通路活化对胃癌细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨幽门螺旋杆菌毒力因子细胞毒素相关基因A蛋白（CagA）对细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路的作用,阐明CagA的致癌机制。方法：构建pcDNA3.1/CagA真核表达载体,将胃癌AGS细胞分为空白对照组（空载体转染）、CagA转染组（GZ7/CagA转染）和CagA+ERKi组（ERK1/2抑制剂预处理+GZ7/CagA转染）,采用Western blotting法测定各组细胞中CagA、磷酸化ERK（p-ERK）、总ERK（T-ERK）、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）和激活型caspase-3（cleaved caspase-3）蛋白表达水平,采用CCK-8法检测各组胃癌AGS细胞活性,采用流式细胞术检测胃癌AGS细胞凋亡率。结果：与空白对照组比较,CagA转染组胃癌细胞中CagA、p-ERK和Bcl-2蛋白表达水平明显升高（P<0.01）,Bax和cleaved caspase-3蛋白表达水平明显降低（P<0.01）;与CagA转染组比较,CagA+ERKi组胃癌细胞中p-ERK和Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P<0.01）,Bax和cleaved caspase-3蛋白表达水平明显升高（P<0.01）;与CagA转染组比较,CagA+ERKi组各时间点胃癌细胞活性明显降低（P<0.01）;与CagA转染组比较,CagA+ERKi组胃癌细胞凋亡率明显升高（P<0.05）。结论：幽门螺旋杆菌毒力因子CagA可抑制胃癌细胞凋亡,促进胃癌细胞增殖,其机制可能与CagA活化ERK信号通路有关。     

BRAF干扰对甲状腺癌SW579细胞系的影响

目的:研究BRAF干扰对甲状腺癌SW579细胞系的影响.方法:设计合成了2对siRNA干扰序列,脂质体转染进入甲状腺癌SW579细胞,采用RT-PCR检测干扰的效果.对干扰成功的细胞系,检测细胞增殖、细胞周期和丝裂原活化蛋白/细胞外信号调节激酶(mitogen-activated protein signa1-regulated kinase/extracellular signal-regulated kinase,MEK/ERK)信号通路相关蛋白的变化.结果:2种siRNA转染甲状腺癌SW579细胞系后,显著地抑制了BRAF mRNA及蛋白水平的表达(P＜0.01),SW579的生长增殖受到抑制,细胞周期发生改变,G1/S期增加,同时,MEK/ERK信号通路的激活受到抑制.结论:干扰BRAF可能通过失活MEK/ERK信号通路而抑制SW579细胞系的生长和增殖.     

ERK5信号通路参与BMP9诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞的分化

目的：研究细胞外信号调节激酶5（extracellular signal-regulated kinase 5,ERK5）信号通路在骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic protein 9,BMP9）诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化中的作用。方法：用AdBMP9和AdGFP转染C3H10T1/2细胞,流式细胞术检测转染效率,Western blot检测磷酸化ERK5（phosphorylation ERK5,p-ERK5）和ERK5的表达水平,免疫荧光检测p-ERK5在细胞内的表达位置;ERK5特异性抑制剂BIX02189预处理细胞再经AdBMP9诱导,Western blot检测p-ERK5和ERK5表达水平,RT-qPCR检测心肌特异性基因肌细胞增强因子（myocyte enhancer factor,MEF）2C、GATA结合蛋白4（GATA binding protein 4,GATA4）表达,Western blot检测心肌特异性蛋白缝隙连接蛋白４３（connexin 43,CX43）、心肌肌钙蛋白T（cardiac troponin T,cTnT）表达。结果：AdGFP与AdBMP9的转染效率达50%左右,经AdBMP9诱导后的细胞p-ERK5表达明显增高（P＜0.01）,免疫荧光结果显示BMP9组p-ERK5表达明显增强且主要集中于胞核;15 ?滋mol/L BIX02189可完全抑制p-ERK5的表达（P＜0.01）,且明显降低了由AdBMP9诱导的C3H10T1/2细胞GATA4、MEF2C基因与CX43、cTnT蛋白表达（P=0.000）。结论：BMP9可以通过激活ERK5信号通路调控C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化。     

siRNA—ID-1对人肝癌细胞HepG2中ERK信号通路的影响

目的观察siRNA-ID-1转染入肝癌细胞HepG2细胞后对肝癌细胞系HepG2细胞增殖的影响及其对ERK1／2通路的作用。方法实验分为4组,即空白对照组、转染试剂组、转染对照组及转染siRNA—ID-1组。阳离子脂质体法介导si-ID-1转染肝癌细胞后,唑蓝比色法（MTT）观察HepG2细胞增殖情况。分别用反转录聚合酶链式反应法（RT－PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blotting）检测转染后p-ERK1／2、ERK1／2mRNA与蛋白表达的情况。结果转染siRNA-ID-1的HepG2细胞增殖速度明显减慢（P〈0．01）。转染后ERK1／2及p-ERK1／2mRNA表达降低（P〈0．01）;p-ERK1／2蛋白的表达较空白对照组明显降低（P〈0．05）．ERK1／2蛋白表达空白变化不明显。结论sirNA-ID－l转染HepG2细胞后可明显抑制细胞的增殖,使得ERK1／2基因表达活性下降,提示ID-1有可能通过ERK1／2信号转导通路介导,促进肝细胞癌HepG2细胞的增殖。     

ORP8对结直肠癌DLD-1细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响

目的 观察和分析氧化固醇结合蛋白相关蛋白8(ORP8)蛋白对人结直肠癌DLD-1细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,并初步探究其影响机制.方法 通过在结直肠癌DLD-1细胞中转染ORP8表达质粒或特异性沉默siRNA上调和下调ORP8的表达,采用CCK-8、Transwell实验检测干扰或过表达ORP8对DLD-1细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;采用Western blot检测了 ORP8对DLD-1细胞细胞外蛋白调节激酶(ERK1/2)的总蛋白及其磷酸化(p-ERK1/2)水平和上皮-间质转化(EMT)相关分子标志物蛋白上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)、神经型钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达的影响.结果 干扰DLD-1细胞ORP8表达,细胞增殖、迁移和侵袭能力均升高(P＜0.01),EMT相关分子标志物中上皮标志物E-cadherin蛋白表达水平下降,间质标志物Vimentin和N-cadherin蛋白表达水平升高,ERK1/2蛋白的磷酸化水平也升高;相反,过表达ORP8,细胞增殖、迁移和侵袭能力均下降(P＜0.01,P＜0.01,P＜0.05),上皮标志物E-cadherin蛋白表达水平升高,间质标志物Vimentin和N-cadherin蛋白表达水平降低,p-ERK1/2水平也降低.结论 ORP8蛋白能够抑制结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭,其机制可能与阻断EMT和抑制ERK1/2磷酸化有关.     

结肠癌细胞中组织因子/活性凝血因子Ⅶ-表皮生长因子受体通路间交互作用机制

目的：探讨结肠癌细胞中组织因子/活性凝血因子Ⅶ（tissue factor/active coagulation factor Ⅶ，TF/FⅦa）通路与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）通路之间是否存在交互作用。方法： 在KRAS野生型的HT-29及KRAS突变型的LoVo结肠癌细胞中，以FⅦa活化TF/FⅦa通路，采用qRT-PCR、Western blot检测EGFR配体双调蛋白（amphiregulin，AREG）及表皮调节素（epiregulin，EREG）基因、蛋白表达改变；利用RNA干扰技术敲低TF表达后活化TF/FⅦa通路，检测其对AREG、EREG基因表达的影响，以证实FⅦa对AREG、EREG表达调节作用依赖TF。以表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）激活两细胞EGFR通路后，检测TF/FⅦa通路关键分子TF、FⅦ基因表达改变。结果： TF/FⅦa通路活化后，HT-29细胞AREG、EREG基因表达及EREG蛋白表达水平均较对照组显著下调（AREG、EREG基因表达量分别为0.55±0.09 vs.0.99±0.09、0.67±0.10 vs.1.02±0.02，EREG蛋白表达量0.54±0.09 vs.1.04±0.13，P均＜0.05）；LoVo细胞AREG基因表达及AREG、EREG蛋白表达水平较对照组显著上调（AREG基因表达量1.87±0.39 vs.0.93±0.23，AREG、EREG蛋白表达量3.09±0.73 vs.1.11±0.21、1.53±0.19 vs. 0.97±0.23，P均＜0.05）；TF敲低后均可部分阻断FⅦa对两细胞AREG、EREG表达调节作用；EGFR通路激活后，HT-29细胞TF基因表达较对照组无显著变化，FⅦ基因表达未检测到，而LoVo细胞的FⅦ及TF基因表达均较对照组显著上调，表达量分别为1.53±0.23 vs.1.00±0.23、53.20±6.08 vs.1.00±0.15（P均＜0.05）。结论： 结肠癌LoVo细胞TF/FⅦa通路与EGFR通路的活化可分别上调另一通路的关键分子表达并发生交互作用，KRAS基因突变可能对该交互作用的发生发挥关键作用。     

WNK1激酶对Maxi K通道的调节作用

目的：研究WNK1激酶对Maxi K通道的调节作用。方法：将携带WNK1和Maxi K目的基因的质粒DNA转染在HEK-293T细胞上,分别应用细胞免疫荧光染色、Western blot观察WNK1对Maxi K在细胞上分布及总蛋白表达水平的影响。结果：免疫荧光染色发现实验组的Maxi K在细胞上的分布明显增多。Western blot结果显示,与对照组相比,实验组1和实验组2的Maxi K总蛋白表达水平均明显升高（P＜0.01）;与实验组1相比,实验组2的Maxi K总蛋白表达水平亦明显升高（P＜0.05）。结论：WNK1能上调Maxi K的总蛋白表达水平,且随着WNK1 DNA剂量的增加,上调作用逐渐增强,显示其上调作用具有剂量依赖性。     

干扰和过表达热休克转录因子2对肠上皮细胞炎症的影响

【摘要】 目的 通过脂质体法干扰和过表达肠上皮细胞的热休克转录因子2（heat shock factor 2,HSF2）,探讨其对肠上皮细胞炎症反应的影响和涉及的信号通路,为溃疡性结肠炎发病机制及诊治靶点提供线索。方法 选取结肠肿瘤上皮细胞Caco 2作为研究材料,采用脂质体法分别转染HSF2 siRNA和pCMV HSF2 FLAG重组质粒,四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测转染前后细胞生理特性的变化;并用脂多糖（LPS）刺激转染组及对照组细胞,Griess Reagent System 测定各组细胞的NO浓度;RT PCR检测细胞炎性酶iNOS、COX 2,炎症因子TNF α、IL 8mRNA转录水平;ELISA检测细胞培养基中TNF α、IL 8含量;Western Blot检测COX 2、IκB、NF κB p65蛋白水平,以及 ERK1/2、JNK和p38磷酸化水平。结果 MTT法检测结果显示,脂质体法转染入siRNA或重组质粒对细胞活性无显著影响;干扰HSF2后,LPS刺激Caco 2产生iNOS、COX 2、TNF α及IL 8,在mRNA和蛋白水平均较对照组表达上调（P＜0.05）,这一过程中信号通路IκB表达降低,而NF κB p65表达升高,MAPK中ERK1/2磷酸化水平降低,而JNK和p38则呈增强趋势。转染入重组质粒过表达HSF2后,结果则相反。结论 HSF2通过增强ERK1/2蛋白磷酸化水平,抑制JNK、P38及NF κB表达,能有效抑制LPS引起Caco 2细胞的炎性酶及炎性因子的表达,在炎症反应中起保护性作用,对研究溃疡性结肠炎的发病机制提供线索,可能成为其治疗新的靶点。     

自体浓缩生长因子凝胶治疗肛瘘 的疗效及作用机制研究

目的探讨自体浓缩生长因子（CGF）凝胶治疗肛瘘的疗效及作用机制。方法采用挂线法对6只猪进行肛瘘造模，30d后行瘘管造影及病理检查确认造模成功。将左右侧瘘管按随机数字表法分为凝胶组（填塞CGF凝胶）和对照组；观察两组瘘管创面愈合情况，检测术后第7天瘘管外口组织样本血小板衍生生长因子（PDGF）、增殖细胞核抗原（PCNA）、α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、c-fosmRNA及蛋白表达水平，以及细胞外调节蛋白激酶（ERK）信号通路因子[包括丝裂原激活蛋白激酶（MEK）1/2、磷酸化MEK（p-MEK）1/2、ERK1/2、磷酸化ERK（p-ERK）1/2]蛋白表达水平。取人皮肤成纤维细胞（HSF），按随机数字表法分为对照组（10%FBS）、20%CGF组、20%CGF+干扰RNA（siRNA）组、20%CGF+siRNAERK组，采用免疫荧光法检测CGF对HSF细胞增殖能力的影响。结果动物实验结果显示，凝胶组创面愈合时间明显短于对照组（P＜0.05），瘘管外口组织样本PDGF、PCNA、α-SMA、c-fosmRNA及蛋白表达水平均明显高于对照组（均P＜0.05），p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白水平均明显高于对照组（均P＜0.05），MEK1/2、ERK1/2蛋白表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。细胞实验结果显示，与对照组比较，20%CGF组、20%CGF+siRNA组HSF细胞增殖百分比均明显升高（均P＜0.05）；与20%CGF+siRNA组比较，20%CGF+siRNAERK组HSF细胞增殖百分比明显降低（P＜0.05）。结论CGF凝胶治疗肛瘘有效，其作用机制是通过上调ERK信号通路因子水平来促进HSF增殖，从而加速瘘管愈合。     

小分子干扰RNA沉默Notch1后增加胰腺癌细胞凋亡活性而提高吉西他滨化疗敏感性

目的：探讨应用小分子干扰RNA（siRNA）沉默Notch1信号通路对胰腺癌吉西他滨化疗敏感性的影响及其可能机制。方法：Notch1 siRNA转染AsPC 1、BxPC 3、MIAPaCa 2 和Panc 1这4种胰腺癌细胞株。实时PCR检测胰腺癌细胞株Notch1受体相对表达量;应用Notch1 siRNA转染后,CCK 8法计算吉西他滨（10 μmol/L）作用时细胞抑制率,蛋白质印迹法检测促凋亡蛋白Bax表达水平,CaspACETM比色法检测caspase 3活性。结果：4株胰腺癌细胞中BxPC 1 Notch1受体相对表达量最高,Panc 1最低。Notch1 siRNA转染组吉西他滨作用抑制率较对照siRNA转染组明显增高,同时伴随促凋亡蛋白Bax表达上调,caspase 3活性明显增高（均P<005）。结论：应用siRNA降低Notch1信号通路活性可通过激活凋亡活性而增加胰腺癌吉西他滨化疗敏感性。     

磷脂酰肌醇3激酶调节亚基基因对HepG2细胞增殖的影响

目的：初步探讨磷脂酰肌醇3激酶调节亚基（PIK3R1）在肝癌发生发展中的生物学作用及其机制。方法：首先通过蛋白质印迹法和免疫组织化学法检测p85α（PIK3R1所编码的蛋白）在肝癌组织标本中的表达情况;接着利用脂质体转染法将PIK3R1的小分子干扰RNA（siRNA）和含有PIK3R1 cDNA的重组质粒转染入HepG2细胞中,并利用实时定量PCR检测其干扰效率和过表达效率;采用MTT法和集落形成实验检测PIK3R1 对细胞增殖的影响,应用流式细胞术分析PIK3R1对细胞周期的影响;最后蛋白质印迹法检测PI3K/AKT信号通路下游效应分子的表达变化。结果：p85α在肝癌组织中的表达高于其癌旁组织,差异有统计学意义（P<0.05）;PIK3R1被干扰后,HepG2细胞增殖速度减慢,集落形成率减少,差异有统计学意义（均P<0.05）;PIK3R1过表达后,HepG2细胞增殖速度加快,集落形成率增多,差异有统计学意义（均P<0.05）;PIK3R1提高了HepG2细胞中S期细胞的比例（P<0.01）;且PIK3R1可提高PI3K/AKT通路下游效应分子p-AKT的水平,并降低p53的水平。结论：PIK3R1在肝癌组织中表达上调,PIK3R1可能通过激活PI3K/AKT信号通路促进HepG2细胞的增殖。     

长链非编码RNA FENDRR在子宫颈癌中的作用

目的：探讨长链非编码RNA FENDRR在子宫颈癌（下面简称宫颈癌）中的作用。方法：在宫颈癌细胞系中使用siRNA干扰技术特异性干扰FENDRR的表达,用qRT-PCR检测siRNA的干扰效率;运用CCK-8和Transwell实验分别检测干扰FENDRR表达对宫颈癌细胞体外增殖和运动能力的影响;运用裸鼠成瘤实验验证干扰FENDRR表达对宫颈癌细胞体内成瘤能力的影响。结果：siRNA转染使FENDRR在SiHa和HeLa细胞中的相对表达量分别由（1.013±0.120）、（1.001±0.025）降为（0.226±0.024）、 （0.099±0.010）,差异均有统计学意义（P＜0.01）;干扰FENDRR后宫颈癌细胞系的增殖能力明显增强（P＜0.01）,迁移和侵袭能力也显著增强（P＜0.01）;干扰FENDRR后宫颈癌细胞HeLa在裸鼠体内的成瘤能力明显增强,与对照组相比肿瘤体积从（853.2±59.4）mm3增加到（1 155.0±51.5）mm3（P＜0.01）,肿瘤的质量从（0.544±0.053）g增加到（0.814± 0.061）g（P＜0.05）。结论：干扰FENDRR的表达明显增强宫颈癌细胞的体外增殖和运动能力以及体内成瘤能力,FENDRR可能在宫颈癌的进展中发挥重要的抑癌作用。     

siRNA沉默MACC1基因表达对宫颈癌细胞增殖及侵袭的影响

目的探讨siRNA沉默结肠癌转移相关基因1(MACC1)表达对Hela宫颈癌细胞增殖及侵袭的影响。方法通过脂质体将siRNA MACC1及siRNA NC转入Hela细胞中,RT-PCR及western blot检测转染效果,MTT法检测细胞活力,流式细胞术检测细胞周期,Transwell法检测细胞侵袭能力,western blot检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、cyclin E,基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9蛋白表达及细胞外调节蛋白激酶(ERK)磷酸化水平。结果与siRNA NC组比较,siRNA MACC1组中MACC1蛋白及mRNA表达量降低(P0.01),细胞活力及侵袭能力下降(P0.01),细胞周期阻滞在G1期,cyclin D1、cyclin E、MMP2、MMP9及p-ERK表达量下调(P0.01)。结论siRNA MACC1能显著的抑制宫颈癌Hela细胞增殖与侵袭,可能与下调ERK磷酸化水平有关。     

凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1在C反应蛋白诱导人脐静脉内皮细胞组织因子表达中的作用

目的研究凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体-1(lectin-type oxidized LDL receptor1,LOX-1)在C-反应蛋白(c-reactive protein,CRP)诱导人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)组织因子(tissue factor,TF)表达中的作用。方法用人重组质粒pTracer CMV2-CRP转染HUVECs细胞,分正常对照组、空质粒GFP组和CRP-GFP组(n=3),RT-PCR、Western blot检测TF、LOX-1 mRNA和蛋白表达。Western blot检测各组P-ERK1/2、T-ERK1/2、P-JNK、T-JNK蛋白表达。CRP-GFP组分别加LOX-1阻断剂、ERK1/2阻断剂(U0126)、JNK阻断剂(SP600125),Westernblot检测TF蛋白。结果用表达人CRP的质粒转染HUVECs显著增加LOX-1 mRNA和蛋白表达[(0.70±0.03)vs(0.24±0.01),(0.661 6±0.020 0)vs(0.255 8±0.040 0),P<0.05]、TF的mRNA和蛋白表达[(0.442±0.040)vs(0.146 0±0.030 0),(0.727 4±0.020 0)vs(0.217 4±0.020 0),P<0.05]。CRP启动了ERK1/2 MAPK,未启动JNKMAPK。CRP上调TF表达被ERK1/2阻断剂而非JNK阻断剂阻断.抗LOX-1的中和抗体显著减少CRP诱导的TF mRNA和蛋白表达[(0.264 0±0.030 0)vs(0.442 0±0.040 0),(0.324 4±0.040 0)vs(0.727 4±0.020 0),P<0.05]。结论CRP诱导HUVECs细胞LOX-1表达上调,并通过LOX-1受体这一新途径上调TF表达,且CRP通过ERK1/2 MAPK信号途径非JNK MAPK途径上调了HUVEC细胞TF的表达。     

钙调磷酸酶Aα基因过表达在缺血/再灌注和肾上腺素能受体介导的心肌凋亡中的作用

目的研究腺病毒介导钙调磷酸酶Aα基因(AdCnAα)过表达对缺血/再灌注和肾上腺素能受体介导的心肌凋亡中的作用及p38MAPK的变化。方法体外培养乳鼠心肌细胞,分别给予Iso(10μmol/L) 缺氧24h/复氧4h(Iso H/R)及感染重组腺病毒(AdCnAα) Iso H/R处理,观察AdCnAα对Iso H/R诱导的心肌细胞凋亡的影响。用DNALadder法及流式细胞仪DNA含量测定法(PI标记)检测心肌细胞凋亡,用RT-PCR法和Westernblot法分别检测CaNmRNA及蛋白表达,用Westernblot法检测p38、p-p38MAPK的变化。结果CnAα过表达组(AdCnAα Iso H/R)的心肌细胞凋亡率比Iso H/R组明显增加(14.247±0.525vs10.763±1.554,P<0.01),且均高于正常对照组;同时p-p38MAPK的表达也比正常对照组增加(2.42±0.19vs1.60±0.22,P<0.01);p38MAPK的表达在干预前后同正常对照组比较无差异性变化(P>0.05)。结论腺病毒介导的CnAα过表达可使Iso H/R共同作用诱导的心肌细胞凋亡率增加,p38MAPK可能参与了CaN促进Iso H/R诱导心肌细胞凋亡的信号转导过程。     

膜联蛋白A7与IGFBP2结合抑制肝癌细胞增殖

目的 分析膜联蛋白A7(ANXA7)与肝癌发生的相关性及筛选、鉴定ANXA7的相互作用分子,探讨ANXA7在肝癌发生中的机制.方法 通过实时定量PCR法检测48对肝癌与癌旁组织以及多种肝和肝癌细胞株中ANXA7表达量的差异,并通过肝癌细胞ANXA7过表达及特异性干扰抑制分析其对肝癌细胞增殖的影响.采用免疫共沉淀法筛选与ANXA7发生结合的蛋白,并以点突变法分析蛋白质相互作用的关键位点;用蛋白免疫印迹法分析了ANXA7对肝癌相关的重要信号通路中ERK1/2磷酸化水平的影响.结果 ANXA7在肝癌组织与肝癌细胞中均呈下调表达.胰岛素样生长因子结合蛋白2(insulin-like growth factor binding protein 2,IGFBP2)能与ANXA7蛋白发生特异性结合,且IGFBP2上的RGD序列是两者结合的关键位点.肝癌细胞中ANXA7表达上调能抑制肿瘤细胞增殖(P＜0.05),并能使IGFBP2介导的ERK1/2的磷酸化水平降低.下调ANXA7的表达可促进肝癌细胞增殖(P＜0.01),磷酸化ERK1/2的水平升高.结论 ANXA7可能作为一种抑癌基因,通过介导IGFBP2对ERK1/2磷酸化水平的影响参与对肝癌增殖的调控.     

Hiwi基因靶向沉默对乳腺癌MCF-7/ADM细胞化疗敏感性的影响

目的：探讨耐阿霉素乳腺癌MCF-7/ADM细胞应用Hiwi基因靶向沉默技术后对阿霉素敏感性的变化,阐明Hiwi基因在乳腺癌MCF-7/ADM细胞耐药机制中的作用。方法：MCF-7/ADM细胞分为对照组、Hiwi siRNA1组和Hiwi siRNA2组,分别转染Hiwi control、Hiwi siRNA1和Hiwi siRNA2 3种不同载体,应用实时定量PCR和Western blotting法检测Hiwi基因mRNA和蛋白表达水平,判断转染效率。转染后各组乳腺癌MCF-7/ADM细胞加入不同浓度阿霉素（0、0.1、0.5和1.0mg·L^-1）,0mg·L^-1阿霉素组为对照组,采用MTT法检测各组MCF-7/ADM细胞的存活率,即耐药敏感性。结果：与对照组比较,转染后Hiwi siRNA1和Hiwi siRNA2组细胞中Hiwi基因mRNA和蛋白表达水平均明显降低（P<0.01）。与对照组比较,经不同浓度阿霉素作用后,Hiwi siRNA1组和Hiwi siRNA2组细胞存活率明显降低（P<0.01）,阿霉素浓度为1.0 mg·L^-1时,2组细胞存活率分别为（48.15±6.28）%和（41.73±6.17）%,对阿霉素的敏感性明显增强。结论：Hiwi基因在MCF-7/ADM细胞中具有高效的靶向沉默,Hiwi基因沉默后的MCF-7/ADM细胞对阿霉素恢复敏感性。     

长链非编码RNA PVT1沉默对K562细胞增殖的影响

目的 筛选靶向抑制长链非编码RNA(lncRNA)浆细胞瘤转化迁移基因1(PVT1)的小干扰RNA(siRNA),并探讨其对人白血病细胞株K562细胞增殖的影响.方法 针对PVT1设计合成PVT1-siRNA1、2、3、4序列及无关对照siRNA(SC-siRNA)序列.利用HiperFect转染试剂将各条siRNA转入K562细胞,实验依此分为siRNA1组、siRNA2组、siRNA3组、siRNA4组和SC-siRNA组,并设空转组和细胞组.转染后用实时定量RT-PCR检测细胞中PVT1 RNA的相对表达情况,用CCK8法检测细胞增殖情况,用流式细胞仪检测细胞周期.结果 转染24、48 h后siRNA4组PVT1 RNA水平下降,与SC-siRNA组、空转组和细胞组相比差异有统计学意义(P<0.01), 而siRNA1组、siRNA2组和siRNA3组PVT1 RNA水平与细胞组相比差异无统计学意义(P>0.05);转染24、48、72 h后siRNA4组细胞增殖抑制率都增加,与SC-siRNA组和空转组相比差异均有统计学意义(P<0.01);转染48、72 h后siRNA4组出现了G1期阻滞,G1期细胞比例增加,与SC-siRNA组、空转组和细胞组相比差异有统计学意义(P<0.01).结论 PVT1-siRNA可通过阻滞细胞周期的进展而抑制K562细胞的增殖.