脱细胞神经基质的制备及成分分析

目的:制备脱细胞神经基质,通过测定细胞核和DNA残留评价脱细胞程度,并对所制备的脱细胞神经基质进行成分分析,为开发新型神经修复生物材料提供研究基础。方法:1依次采用0.5%胰蛋白酶-3%曲拉通X-100-0.1%SDS-PBS溶液-水振荡漂洗的方法对异种动物的外周神经进行脱细胞处理。2冰冻切片并经苏木素-伊红染色观察细胞核残留。3微量样品DNA提取试剂盒提取脱细胞神经基质的DNA,超微量蛋白核酸分析仪检测其残留DNA含量。4免疫组织化学法分析脱细胞神经基质成分。结果:经脱细胞处理制备的神经基质呈乳白色;脱细胞神经基质经冰冻切片和苏木素-伊红染色后观察,未见有完整细胞核残留;脱细胞神经基质的DNA残留为6.6ng/mg;经免疫组织化学染色分析,脱细胞神经基质的主要成分为Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和层粘连蛋白。结论:采用本法制备的脱细胞神经基质,有效去除了神经组织中的细胞成分,保留了神经组织细胞外基质的主要成分,可以作为神经修复的新型生物材料。     

复合软骨修复材料支架的构建

目的：构建一种脱细胞软骨/GelMA复合材料支架用于修复软骨缺损。方法：对α-1,3-半乳糖苷转移酶基因敲除（GTKO）猪肋软骨脱细胞处理,得到低免疫原性脱细胞软骨基质,进行4,6-脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色、DNA含量检测评估脱细胞效果,苏木素-伊红（HE）染色、Masson三色染色分别评估细胞外基质结构及蛋白保留情况。再将脱细胞软骨冷冻研磨成粉末状,选取聚合物甲基丙烯酰化明胶（GelMA）溶液与脱细胞软骨粉末按不同比例均匀混合,制备一种可注射型生物材料,经紫外交联后获得可生物降解的复合支架,通过溶胀性能、储能模量检测对支架进行表征,并观察支架上细胞增殖情况。结果：天然软骨DNA含量为161.2 ng/mg,脱细胞软骨DNA含量仅为15.27 ng/mg,该种脱细胞方法效果良好。HE染色显示细胞外基质结构完整,Masson三色染色显示脱细胞组织保留了大部分细胞外基质成分。与纯GelMA相比,脱细胞软骨/GelMA复合支架溶胀率低,力学强度稍强。骨髓间充质干细胞能在支架上黏附并增殖。结论：通过可注射型脱细胞软骨/GelMA复合材料制备的支架具有低免疫原性,适宜的储能模量,良好的生物相容性,适用于软骨修复。     

利用异种脱细胞神经基质与脂肪源间充质干细胞构建周围神经移植物

由于合成的神经导管不具有促神经再生的特性,因此不能有效修复长距离神经缺损。本研究,利用异种脱细胞神经基质与神经分化的脂肪源间充质干细胞进行整合,构建了一种含神经再生特性的周围神经移植物。其中制备的异种脱细胞神经基质不但完全去除了细胞与髓鞘,并保留了生长因子和细胞外基质的天然结构,例如多孔隙率与基膜管。     

脱细胞异种神经移植体复合BMSCs修复大鼠坐骨神经缺损的研究

目的：对脱细胞异种神经的生物相容性进行评价,证明应用其复合BMSCs促进神经再生和功能恢复的效果。方法：采用化学萃取法制备兔的脱细胞神经,应用扫描电镜观察其超微结构;将BMSCs种植到神经支架构建神经移植体,体外培养后观察细胞形态;用构建的异种神经移植体桥接大鼠坐骨神经缺损,术后8周,检测胫前肌湿重比率,对再生神经进行组织形态学分析;并应用免疫荧光染色检测神经内NGF的表达。结果：脱细胞异种神经较完整地保留了天然立体的施万细胞基底膜管结构,完全地移除了神经内的施万细胞、轴突和髓鞘成分;在体外培养中支持种植的BMSCs黏附和生长。神经移植术后,与单纯异种脱细胞神经移植组相比,复合BMSCs的异种神经移植体移植能使胫前肌湿重比率增加、有髓神经纤维数目、髓鞘厚度和轴突直径增加;增加再生神经内NGF的表达。结论：异种脱细胞神经移植体具备天然的立体结构,移除了施万细胞、髓鞘等抗原成分;神经支架无细胞毒性,具有良好的细胞相容性;复合BMSCs的异种神经移植体可显著地促进神经再生及功能恢复。     

大鼠去细胞神经支架制备方法的改良

目的:探讨去除大鼠周围神经中的细胞和髓鞘以取得去细胞神经支架的方法.方法:取15只SD大鼠的坐骨神经30条,随机分为3组(每组10条).分别为正常神经组(A组),TritonX-200处理的化学去细胞组(B组),TritonX-200联合sulfobetaine-16(SB-16)、sulfobetaine-10(SB-10)去细胞组(C组).在光镜和电镜下观察各组神经组织的组织学结构.采用免疫组织化学SP法检测各组神经组织中S-100蛋白和层黏连蛋白(Laminin)的表达.结果:制备出的去细胞神经呈淡乳白色圆柱状外观.略透亮,其延展性较化学处理前略增加.B、C组神经经去细胞处理后,均去除了Schwann细胞、神经髓鞘和轴突,C组更好地保存了由Schwann细胞基底膜管以及外膜和束膜的细胞外基质构成的三维支架结构.结论:TritonX-200联合SB-16、SB-10改良化学方法处理可获得达到要求的去细胞神经支架.     

化学萃取的异种神经修复神经缺损的可行性研究

目的 探讨联合应用十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)和脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate)的化学萃取方法,对异种神经移植段进行脱细胞处理,构建异种神经去细胞基质膜管,应用于修复周围神经缺损的可行性.方法 取新鲜兔坐骨神经,切成长10mm的神经段,用十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)和脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate)反复处理新鲜的兔神经段构建成异种神经去细胞基质膜管,修复大鼠坐骨神经缺损.结果 4个月后异种神经基质膜管与大鼠坐骨神经缝合处愈合良好,未见有神经瘤及粘连,HE染色显示异种神经基质膜管组桥接处再生神经结构连续性良好,移植段可见神经纤维及新生的血管.S-100免疫组织化学染色可见阳性的雪旺氏细胞沿神经纤维分布成条带状.电镜超微结构观察可见再生的神经纤维较粗大,排列紧密,呈均匀一致圆型或椭圆型,髓鞘较厚,轴突结构完整.结论 联合应用十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)和脱氧胆酸钠(Sodium deoxycholate)的化学萃取方法构建的异种神经去细胞基质膜管可以修复大鼠坐骨神经缺损.     

脱细胞基质面神经修复材料的制备

目的 制备具有天然神经组织结构的支架,构建组织工程化面神经用于修复面神经损伤。方法 取家兔面神经,改良化学萃取法制备脱细胞神经基质,HE染色形态学观察去细胞及脱髓鞘情况,荧光分光光度计测定支架内细胞经Quant-iT PicoGreen工作液染色后的DNA含量。MTT法检测细胞在支架上的相对生长率从而检测支架的细胞毒性。结果 支架移植体呈圆柱形,弹性与正常神经基本一致,组织观察显示细胞结构未见残余完整细胞及细胞碎片残留,未见神经髓鞘及轴突结构,细胞外基质形成纵向排列结构,结构之间可见空隙。兔脱细胞面神经基质支架内残留的DNA含量较正常兔面神经明显下降(P<0.01)。神经基质供体无细胞毒性。结论 改良化学萃取法可有效去除面神经细胞,天然结构保存完好,细胞毒性低,可作为组织工程化面神经的支架。     

异种源性脱细胞神经支架修复坐骨神经损伤后再生的可行性

目的:评价异种脱细胞神经支架修复大鼠坐骨神经损伤的疗效。方法:以兔源性胫神经为原材料,通过萃取技术制备脱细胞神经支架;HE染色、甲苯胺蓝染色、免疫组化(IHC)、扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)检测技术评价脱细胞效果;体内实验部分采用坐骨神经离断模型,按照移植物的不同,将SD大鼠随机分为两组:异种神经支架移植组(实验组)、自体神经移植组(对照组),术后12周内,流式细胞术检测大鼠外周血中CD3~+、CD4~+、CD8~+淋巴细胞含量,以判定机体免疫系统情况;通过神经功能测定及形态学手段评价10 mm缺损神经的修复效果。结果:支架内的细胞和髓鞘成分能够彻底去除,基底膜管状结构保留较为完整。术后1、4、12周时间点,实验组大鼠外周血CD3~+、CD4~+、CD8~+淋巴细胞含量与对照组比较,差异均无统计学意义(P0.05)。4周及12周后,两组坐骨神经功能指数(SFI)比较差异均无统计学意义(P0.05);实验组移植物内的再生轴突数量、再生髓鞘厚度方面与对照组比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论:异种神经脱细胞支架干预10 mm大鼠坐骨神经缺损,并不会引起机体系统性排斥反应,同时能够有效促进损伤神经再生。     

微囊化神经组织联合脱细胞神经移植修复犬坐骨神经缺损

目的 了解微囊化神经组织与脱细胞神经联合移植桥接犬坐骨神经30 mm缺损后腓肠肌的变化.方法 将健康成年杂种犬12只随机分为A、B、C、D 4组(n=3):A组截取双侧坐骨神经行化学萃取制备脱细胞神经;B、C组使用脱细胞神经移植修复犬的坐骨神经30 mm缺损,B组同时辅以微囊化神经组织移植;D组行自体神经移植修复缺损.术后定期观察术侧肢体运动功能恢复情况,6个月时检测神经移植段运动传导速度,并取术侧及健侧腓肠肌行琥珀酸脱氢酶(succinic dehydrogenase,SDH)、突触素和运动终板染色,以及取距远端吻合口以远1 cm的坐骨神经神经行Masson、固蓝及NF-200染色.结果 B、C、D组实验动物均纳入实验动物数量分析、无脱失.图像分析表明B组腓肠肌SDH光密度、肌纤维截面积、突触素及运动终板光密度及面积等与C组有明显统计学差别,而与D组无明显统计学差别,运动功能恢复、电生理及坐骨神经形态学检测均与腓肠肌检测结果相符合.结论 微囊化神经组织细胞与脱细胞神经联合移植修复缺损神经后,重新支配靶器官,使腓肠肌萎缩明显减弱,效果优于单纯脱细胞神经移植,有望代替自体神经移植.     

不同脱细胞方法制备的AECM成分分析及比较

目的:比较不同脱细胞方法制备的大鼠坐骨神经细胞外基质材料(acellular extracellular matrix,AECM)的组分,为解决临床周围神经损伤修复移植体的来源提供实验依据。方法:分别采用优化的化学萃取脱细胞方法和低渗-酶消化法制备大鼠坐骨神经AECM,通过HE染色、变色酸2R-亮绿染色、免疫组织化学染色和SDS-PAGE对AECM的结构成分进行检测和比较。结果:不同方法制备的大鼠坐骨神经AECM在基底膜管完整性、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)活性、去细胞程度和脱髓鞘程度方面无显著性差异。结论:应用优化的化学萃取脱细胞方法和低渗-酶消化法制备的AECM,均具有良好的仿生性,是修复周围神经缺损的适宜移植物。     

脱细胞鼠肾生物支架的制备及其体内相容性

目的：制备一种抗原封闭完全,蛋白成分保留完好,生物性能较好的鼠肾脱细胞基质支架,并对其体内生物相容性进行分析。方法：取健康SD大鼠,采用腹主动脉在体灌注去污剂的方法制备全肾脱细胞基质支架,对处理后的支架材料进行形态结构观察,主要成分分析;将其支架进行皮下包埋检测体内细胞相容性。结果：经脱细胞处理后,肾支架形态上具有三维立体空间结构,肉眼可见其内血管脉络;DNA残留量不及正常组3%;HE、透射电镜（TEM）、PAS等观察细胞成分已完全去除,细胞外基质网络结构保留完整;免疫荧光显示细胞外基质成分Ⅳ型胶原（collagen Ⅳ）、层黏连蛋白（laminin）及纤维黏连蛋白（fibronectin） 均呈强阳性表达,未见明显细胞核成分残留;皮下植入结果显示,初期炎症反应明显,随着时间推移,炎症减轻,支架内逐渐有血管长入,基质逐渐降解。结论：经去污剂灌注处理的脱细胞肾基质,可有效清除肾内所有细胞成分,较好地保留细胞外基质支架且形态完好,具有良好的组织相容性。     

大鼠子宫去细胞化支架的制备和评价

目的：通过去细胞化灌注技术,探讨成功制备天然子宫去细胞化生物支架的理想灌注策略,并通过系统的评价体系,以鉴定其能否作为子宫组织再生工程研究的良好应用载体。方法：选择健康成年雌性SD大鼠,采用子宫动脉入路途径,通过冻融、酶解及曲亚通（TritonX-100）联合十二烷基硫酸钠（SDS）的洗脱灌注等流程,获取子宫去细胞化支架。并通过大体形态观察、美兰染色、HE染色观察、基因组DNA定量分析、EGF、bFGF、TGF-β含量测定、电镜观察、胶原蛋白总量检测及主要胶原成分鉴定等对去细胞化后的子宫支架进行全面的评价。结果：成功建立动脉灌注入路并获得了肉眼透明的子宫去细胞化支架,HE染色和透射电镜观察均表明去细胞化子宫支架内无细胞残留,DNA含量检测表明支架内DNA残留量为（45.6±7.3）ng/mg,不足正常子宫的5%（P＜0.01）,美兰染色和扫描电镜显示子宫支架的脉管网络和空间结构保存完整;而胶原蛋白含量由新鲜子宫组织的（0.57±0.12）μg/mg增加到去细胞化子宫支架的（0.88±0.10）μg/mg,差异有统计学意义（P＜0.05）,结合各型胶原的免疫组织化学定性分析,说明去细胞化后子宫支架的细胞外基质成分保留得较为完整;ELISA结果显示去细胞化子宫支架中细胞因子EGF、bFGF和TGF-β分别保留了66%、85%和54%,表明其仍具备一定的生物活性。结论：本研究方法能够成功制备理想的去细胞化子宫支架,并且支架的基质成分和理化特性完整保留,能够作为子宫组织工程研究的良好载体。     

渗透冲击联合超声和去污剂处理对新生牛真皮组织学和生物活性成分的影响

目的采用渗透冲击联合超声和去污剂处理新生牛真皮,观察处理前后新生牛真皮基质的组织学和生物活性成分的变化。方法从8头健康雄性新生牛皮肤获取网状层真皮组织。采用反复渗透压改变、超声震荡和去污剂联合法对新生牛网状层真皮进行处理,HE染色、DAPI染色和核酸电泳检测细胞成分残留情况;扫描电镜(SEM)观察胶原束结构和细胞成分;PicoGreen法、DMMB法和BCA法对脱细胞前后真皮基质的DNA、sGAG和蛋白质含量进行定量分析;ELISA法测定脱细胞前后真皮基质内TGF-β1、EGF、bFGF和KGF含量。结果形态学观察可见脱细胞处理后的真皮三维结构完整,胶原纤维束排列较疏松,细胞清除较彻底,未见明显细胞及细胞碎片残留。与脱细胞处理前比较,脱细胞处理后的DNA含量[(2 516.1±324.2)ng/mg vs(249.5±53.8)ng/mg,P=0.000)]、sGAG含量[(5.92±0.50)μg/mg vs(2.48±0.24)μg/mg,P=0.000]、TGF-β1含量[(478.8±196.1)pg/g vs(180.3±111.0)pg/g,P=0.009]和EGF含量[(10.52±2.78)pg/g vs未能检测到EGF含量]均明显减少;而bFGF含量[(788.6±333.8)pg/g vs(364.8±294.8)pg/g,P=0.424]下降了53.7%,KGF含量[(0.033±0.000)pg/g vs(0.033±0.000)pg/g,P=0.433]变化不显著。结论反复渗透冲击联合超声和去污剂处理对新生牛真皮基质明显地清除了细胞及细胞碎片,较好地保留了真皮细胞外基质的三维结构和主要生物活性成分。     

In Vivo Confocal Microscopic Observation of Lamellar Corneal Transplantation in the Rabbit Using Xenogenic Acellular Corneal Scaffolds as a Substitute

Background:

The limiting factor to corneal transplantation is the availability of donors. Research has suggested that xenogenic acellular corneal scaffolds (XACS) may be a possible alternative to transplantation. This study aimed to investigate the viability of performing lamellar corneal transplantation (LCT) in rabbits using canine XACS.

Methods:

Fresh dog corneas were decellularized by serial digestion, and LCT was performed on rabbit eyes using xenogeneic decellularized corneal matrix. Cellular and morphological changes were observed by slit-lamp, light, and scanning electron microscopy at 7, 30 and 90 days postoperatively. Immunocytochemical staining for specific markers such as keratin 3, vimentin and MUC5AC, was used to identify cells in the graft.

Results:

Decellularized xenogenic corneal matrix remained transparent for about 1-month after LCT. The recipient cells were able to survive and proliferate into the grafts. Three months after transplantation, grafts had merged with host tissue, and graft epithelialization and vascularization had occurred. Corneal nerve fibers were able to grow into the graft in rabbits transplanted with XACS.

Conclusions:

Xenogenic acellular corneal scaffolds can maintain the transparency of corneal grafts about 1-month and permit growth of cells and nerve fibers, and is, therefore, a potential substitute or carrier for a replacement cornea.     

去细胞异种神经支架的制备和组织学观察

目的用改良的化学萃取方法,制备去细胞异种神经支架。方法切取青紫蓝兔胫神经,以Triton X-100溶液和脱氧胆酸钠溶液按一定浓度和程序进行化学处理,对萃取神经行组织学HE染色及Laminin和S-100蛋白免疫组织化学观察。结果去细胞异种神经支架的延展性及韧弹性良好,细胞和髓鞘被彻底清除,该神经支架保持了网管柱状组织结构,保留了雪旺细胞(SC)基底膜及其Laminin、神经内膜、神经束膜和神经外膜。结论该方法可为异种神经移植提供较为理想的支架材料。     

新生小牛皮肤的形态学和生物力学特点及脱细胞方法探索

目的通过新生小牛与成人皮肤组织在形态学和生物力学性能方面的对比研究,寻找临床应用牛真皮基质的可能证据,并初步探索对牛真皮组织进行脱细胞处理的方法。方法收集新生小牛和成人背部全层皮肤标本,采用大体观察、HE染色、Masson三色染色、天狼猩红染色、Gomori醛复红染色、扫描电镜和透射电镜的方法,显微照相后进行形态学观察和图像分析软件的测量;采用力学生物材料试验机检测皮肤的力学性能。采用胰蛋白酶与去污剂的不同浓度和时间组合方式对牛真皮组织进行脱细胞处理,初步观察其脱细胞效果。结果新生小牛与人的皮肤比较,真皮和表皮的厚度均明显变薄,两者的比值显著减小;真皮内Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维分别较人真皮增多和减少,但真皮胶原纤维束的间隙率[(41.72±1.81)∶(40.66±1.40),P=0.467]和胶原纤维束粗细[(11.28±0.18)μm∶(10.88±0.66)μm,P=0.368]差异却没有统计学意义。扫描电镜观察可见新生牛真皮胶纤维束与人真皮胶原纤维束均较纤细,排列疏松,且有一定的孔隙分布;透射电镜显示新生牛真皮胶原原纤维横纹周期长度较人真皮短,但两者的胶原原纤维直径显著差异。生物力学检测示新生牛皮肤最大应力[(21.08±0.91)MPa]和杨氏模量[(82.12±1.23)MPa]均要明显高于人皮肤的最大应力[(12.76±1.60)MPa,P=0.001]和杨氏模量[(48.63±5.50)MPa,P=0.001],而最大应变却明显低于人真皮[(0.51±0.002)mm∶(0.75±0.028)mm,P=0.001]。脱细胞方法探索显示随着胰酶浓度的增加、处理时间的延长,新生牛真皮基质内细胞核成分越来越少,但对真皮胶原结构的破坏也越来越大。结论新生牛皮肤虽然在表皮与真皮厚度、真皮胶原类型比例以及生物力学上与人皮肤有明显差异,但真皮的胶原纤维束三维结构两者之间存在较大相似性。适当浓度和时间的胰蛋白酶组合可制备出空间结构和脱细胞效果较为理想的新生牛脱细胞真皮基质,为修复人体软组织缺损提供有应用前景的生物材料。     

适用于犬输尿管脱细胞基质制备的灌注系统

目的探讨应用灌注系统制备输尿管脱细胞基质的可行性方案。方法利用输尿管本身存在的管腔结构,通过灌注系统制 备输尿管脱细胞基质。根据化学洗涤剂的不同特性设置3 个不同的灌注组,单纯SDS 组、单纯TritonX-100 组以及联合组 （TritonX-100+SDS）。利用HE染色,DAPI染色,DNA定量,琼脂糖凝胶电泳评价输尿管脱细胞基质中细胞核的残留情况。采 用Masson’s 3色染色、Alcian Blue染色、胶原含量测定、GAG含量测定、扫描电镜和毒性检测等手段评价制备输尿管脱细胞基质 的三维结构和生物活性成分。结果HE染色和DAPI染色显示联合组制备的输尿管脱细胞基质中没有明显的核物质残留, DNA定量和凝胶电泳证实了这一结果。Masson’s 3色染色、Alcian Blue染色、胶原含量测定和GAG含量测定显示联合组保留 了输尿管脱细胞基质三维胶原结构和生物活性成分。扫描电镜观察联合组制备的输尿管脱细胞基质表面存在大量的孔隙结 构。毒性测定证实联合组制备的输尿管脱细胞基质无毒性。结论本研究灌注系统可用于输尿管脱细胞基质的制备,筛选出一 套比较理想的脱细胞方案,制备的输尿管脱细胞基质可用于输尿管组织工程再造。     

去细胞化技术在全肝生物支架建立中的应用

目的 通过去细胞化技术建立保留细胞外基质的完整肝脏支架,并对支架进行形态结构和保留成分鉴定.方法 通过门静脉插管,依次灌注去垢剂曲拉通X-100(Triton X-100),十二烷基硫酸钠(SDS),并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗脱残留去垢剂,对所得支架进行HE染色、门静脉及月日道铸型、扫描电镜、纤维成分染色鉴定等形态学观察.并将支架切成50 μm的厚度后与C3A细胞系共培养,进行生物相容性验证.结果 经本实验方案得到肝脏生物支架的成功率为75%.肝脏生物支架包膜完整,肉眼可见肝脏内Gllisson管道结构.HE染色示无细胞及胞核残存.管道铸型见胆道、门静脉完整,无铸型液溢出.扫描电镜示大量纤维网状结构存在.纤维成分染色见大量胶原纤维、弹力纤维存在.生物相容性实验初步显示该支架具备较好的生物相容性,可以作为生物支架材料应用.结论 经本实验去细胞化过程,肝组织细胞可从细胞外基质中完全洗脱下来,并保留比较完整的肝脏管道系统.本研究获得全肝生物支架可以作为肝脏器官培养的基础支架.