仅女性发病的Leber遗传性视神经病变家系的表型分析

目的：对仅有女性发病的11个携带m.11778G＞A突变的Leber遗传性视神经病变（LHON）家系中患者的表型表现进行分析。方法：对1 362例汉族LHON患者的MT-ND4基因进行了系统的筛查,再对携带MT-ND4 11778G＞A突变的11个家系进行线粒体全基因组测序及线粒体单体型分析。结果：筛查发现11个携带m.11778G＞A突变的LHON家系仅累及女性母系成员。此11个家系中患者LHON外显率较低,分别为16.7%、18.8%、15.0%、6.7%、6.7%、33.3%、20.0%、16.7%、7.7%、8.3%、25.0%,平均每个家系外显率为15.90%±0.08%。LHON患者的视力损伤程度由轻度到重度不等,发病年龄7～25（12.4±4.8）岁,属于LHON的高发年龄阶段。11位先证者的线粒体单体型分别为B5a、Z、N9、B4c1b、G2h、B5a、M7b、N9a10、C7b、M7b1、M10。结论：本研究中11个携带相同m.11778G＞A突变的不同家系之间,及在相同线粒体遗传背景下的同一家系中不同母系成员间LHON外显率和发病年龄都存在着显著差异,表明m.11778G＞A突变是LHON发病的分子基础,但突变本身并不足以造成LHON的表型表达,提示其他修饰因子（线粒体单体型、核修饰基因及环境因素）在LHON的发生发展中发挥了一定的作用。     

线粒体tRNATyrA5834G突变与Leber遗传性视神经病变的相关性

目的：探讨线粒体tRNATyrA5834G突变与Leber遗传性视神经病变（LHON）的相关性。方法：对2个携带tRNATyrA5834G突变的LHON家系进行临床和分子遗传学特征等分析评估,对家系先证者和其他成员进行详细的眼科相关检查、线粒体全基因组分析、种系发生学分析及单体型分析。结果：先证者的临床症状及眼科相关检查均符合典型LHON表现,家系其他成员无异常。2个家系均未携带ND1 G3460A和ND4 G11778A及ND6 T14484C这3个原发突变位点,多态性变异位点均属于东亚单体型M7b。2个先证者均携带具有高度保守性的A5834G和T12811C突变位点,其中A5834G在17个物种中的保守系数为87.5%。结论：线粒体tRNATyrA5834G突变可能是与LHON相关的mtDNA突变位点,同时低外显率提示其他因素,如核修饰基因、环境等可能影响这2个家系的表型表达。     

MT-ND1 3571C>T 突变与Leber遗传性视神经病变相关研究

目的 探讨3个携带m.3571C＞T突变的中国Leber遗传性视神经病变家系（Leber＇s hereditary optic neuropathy,LHON）的临床和分子遗传学特征.方法 对3个LHON家系中66名成员和116例正常对照者线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）相关区域进行PCR扩增突变、纯化及测序,并对测序结果进行生物信息学分析.结果 线粒体DNA序列分析结果显示,3个家系所有受试者和正常对照者均未发现m.3460G＞A、m.11778G＞A和m.14484T＞C这3个常见的原发突变位点,而3个先证者及其母系成员均携带m.3497C＞T和m.3571C ＞T突变位点,非母系成员和116例正常对照均不携带m.3497C＞T和m.3571C＞T突变位点.m.3497C＞T是已知与LHON相关的突变位点.结论 m.3497C＞T和m.3571C＞T突变可能协同增加LHON的发生,考虑为LHON的易感位点.     

17例携带m.3460G>A突变的Leber遗传性视神经病变的线粒体单体型分析

目的：研究线粒体单体型对17个携带m.3460G＞A突变Leber遗传性视神经病变（LHON）家系外显率的影响。方法：对收集的1 218个LHON患者进行m.3460G＞A筛查,然后对携带m.3460G＞A患者进行线粒体全基因组测序、单体型分析。结果：共筛查出17个携带m.3460G＞A突变家系,占该研究群体的1.4%（17/1 218）,线粒体单体型分析显示,其分别为单体亚型A、B5b、B5b2、C4a1、D4、D5b1、F1、F1a1、H2、M7b1、M7b2、M7c1、M8a2、M10a、M12,单体亚型D5b1有3例,其余各1例。11例单体亚型属于单体型M,6例属于单体型N,前者出现视力损伤的人数明显多于后者,损伤程度亦重于后者。结论：LHON家系中单体型M出现重度视力损伤的概率大于单体型N。     

线粒体tRNAPhe 593T>C对m.14484T>C相关 Leber遗传性视神经病变表型表达的影响

目的：探讨线粒体tRNAPhe593T＞C对 MT ND614484T＞C相关Leber遗传性视神经病变（LHON）发生发展中的作用。方法：对收集的742例汉族LHON患者和376例对照进行线粒体全基因组测序，并对其 中4个LHON家系进行临床、遗传和分子生物学特征评估。结果：4个LHON家系（WZ133、WZ1224、WZ1225和 WZ1260）的外显率分别为42.9%、12.5%、12.5%和5.6%，发病年龄9～23岁，平均发病年龄为16岁。线粒体 全基因组分析显示WZ133携带m.14484T＞C和m.593T＞C突变，而其他3个家系仅携带m.593T＞C突变。线粒 体tRNA二级结构分析发现：m.593T＞C突变的tRNAPhe二级结构发生改变，且自由能增加，使得tRNAPhe结构 的稳定性降低，从而导致线粒体功能紊乱。结论：tRNAPhe593T＞C可能对m.14484T＞C相关LHOH的表型表 达有影响。     

11个携带线粒体tRNASer（UCN）G7444A突变的中国汉族非综合征型耳聋家系分析评估

目的：通过对11个携带线粒体tRNASer（UCN）G7444A突变的中国汉族非综合征型耳聋家系进行临床和分子遗传学特征等分析评估,探讨线粒体tRNASer（UCN）G7444A突变在母系遗传非综合征型耳聋发生发展中的作用。方法：PCR扩增2650例中国汉族非综合征型耳聋样本的线粒体12SrRNA、线粒体tRNASer（UCN）基因以及GJB2基因。对11个携带线粒体tRNASer（UCN）G7444A突变的中国汉族非综合征型耳聋家系进行听力学检测、耳聋相关热点基因突变检测以及家系资料等综合分析。结果：在2650例中国汉族非综合征型耳聋患者中,14例携带线粒体tRNASer（UCN）G7444A突变,突变率为0.53%。在这11个携带线粒体tRNASer（UCN）G7444A突变的家系中,同时携带线粒体tRNASer（UCN）G7444A突变和线粒体12SrRNAA1555G、12SrRNAC1494T或GJB2c.235delC的家系分别为3、1和2个。临床资料分析表明,这11个中国汉族非综合征型耳聋家系母系成员在听力损失严重程度、发病年龄以及耳聋外显率方面存在较大差异。同时携带线粒体tRNASer（UCN）G7444A突变和线粒体12SrRNAA1555G、C1494T或GJB2c.235delC突变家系的耳聋平均外显率分别为29.4%、42.9%和19.0%。前两者的外显率明显高于只携带线粒体tRNASer（UCN）G7444A突变家系的耳聋平均外显率（为14.0%）。结论：线粒体tRNASer（UCN）G7444A突变可能与线粒体12SrRNAA1555G和C1494T原发突变存在协同作用,共同影响非综合征型耳聋的表型。     

浙江省余姚地区22个非综合征型耳聋家系遗传分析

目的：对宁波市余姚地区22个非综合征型耳聋（NSHI）家系GJB2、GJB3、GJB6编码区以及线粒体基因突变分析,进行临床、遗传和分子特征分析评估。方法：调查对象来自于余姚市人民医院22个NSHI家系22名先证者及患病家属33名,听力正常者254例,且均未携带GJB2、GJB3、GJB6编码区以及线粒体基因致病突变。所有受检者均采集外周血并提取DNA,并对受检者GJB2、GJB3、GJB6基因编码区以及线粒体基因进行测序,结合患者听力学检查、耳聋相关突变热点基因检测以及患者家系资料进行综合遗传分析。结果：在来源于宁波市余姚地区的22个NSHI家系的33名患者中,发现携带有GJB2基因235delC单突变家系4例,GJB2双杂合突变家系2例,线粒体基因1555位点突变3例。在GJB3、GJB6编码区并未发现有致病突变。在这22个NSHI患者家系中,有27.3%的家系检测出携带有GJB2基因病理性突变;有13.6%的家系携带有线粒体12S rRNA基因1555A＞G突变。据临床资料显示,6个携带GJB2基因病理性突变家系以及3个携带1555A＞G 突变家系的听力损失程度、发病年龄、耳聋外显率等都有差异。结论：GJB2基因以及线粒体12S rRNA基因1555A＞G突变是浙江省余姚地区NSHI患者的主要相关基因,可能也存在其他未知基因与这2个基因相互协同作用,对患者表型产生影响。     

11个携带线粒体tRNASer(UCN) G7444A突变的中国汉族非综合征型耳聋家系分析评估

目的：通过对11个携带线粒体tRNASer(UCN) G7444A突变的中国汉族非综合征型耳聋家系进行临床和分子遗传学特征等分析评估,探讨线粒体tRNASer(UCN) G7444A突变在母系遗传非综合征型耳聋发生发展中的作用。方法：PCR扩增2 650例中国汉族非综合征型耳聋样本的线粒体12S rRNA、线粒体tRNASer(UCN)基因以及GJB2基因。对11个携带线粒体tRNASer(UCN) G7444A突变的中国汉族非综合征型耳聋家系进行听力学检测、耳聋相关热点基因突变检测以及家系资料等综合分析。结果：在2 650例中国汉族非综合征型耳聋患者中,14例携带线粒体tRNASer(UCN) G7444A突变,突变率为0.53%。在这11个携带线粒体tRNASer(UCN) G7444A突变的家系中,同时携带线粒体tRNASer(UCN) G7444A突变和线粒体12S rRNA A1555G、12S rRNA C1494T或GJB2 c.235delC的家系分别为3、1和2个。临床资料分析表明,这11个中国汉族非综合征型耳聋家系母系成员在听力损失严重程度、发病年龄以及耳聋外显率方面存在较大差异。同时携带线粒体tRNASer(UCN) G7444A突变和线粒体12S rRNA A1555G、C1494T或GJB2 c.235delC突变家系的耳聋平均外显率分别为29.4%、42.9%和19.0%。前两者的外显率明显高于只携带线粒体tRNASer(UCN) G7444A突变家系的耳聋平均外显率（为14.0%）。结论：线粒体tRNASer(UCN) G7444A突变可能与线粒体12S rRNA A1555G和C1494T原发突变存在协同作用,共同影响非综合征型耳聋的表型。     

中国汉族Leber遗传性视神经病线粒体DNA 11778位点突变与外显率分析

目的：分析Leber遗传性视神经病（LHON）中线粒体DNA（mtDNA）11778位点突变与外显率。方法：应用PCR-SSCP和DNA测序方法,对3个中国汉族LHON家系的31例母系成员进行mtDNA 11778位点突变检测,其中男14例,女17例;31例中15例为患者。40例正常人作为对照。结果与结论：3个家系31例样本中全部存在mtDNA 11778位G→A突变,说明LHON患者均存在mtDNA 11778位点突变。平均外显率48.4％,男性外显率（11／15）高于女性（4／16）。男性外显率有逐代降低,患者发病年龄随传代数增加呈现遗传早发现象。     

2 型糖尿病患者线粒体常见基因突变PCR检测的局限性

目的:研究北京地区汉族人群中线粒体DNA(m itochondrial DNA,m tDNA)多位点突变频率与2型糖尿病之间的相关性。方法:采用直接PCR、PCR-限制性片段长度多态性(restriction fragm ent length polymorph ism,RFLP)、PCR-时相温度梯度凝胶电泳(temporal temperature grad ient gel electrophoresis,TTGE)法筛查m tDNA 4977片段缺失、线粒体tRNALeu(UUR)A3243G突变和m tDNA T14577C突变。结果:在250例2型糖尿病患者及142例健康对照外周血基因组总DNA中,未发现m tDNA 4977缺失、线粒体tRNALeu(UUR)A3243G突变及m tDNA T14577C突变。结论:m tDNA 4977缺失、线粒体tRNALeu(UUR)A3243G突变及m tDNA T14577C突变在外周血中没有检出,采用常规PCR法检测2型糖尿病患者外周血线粒体DNA突变具有较大的局限性。     

Leber遗传性视神经病相关的三种原发性线粒体突变的无创检测方法建立

目的：建立1种Leber遗传性视神经病（LHON）相关的3种原发性线粒体突变11778G＞A、14484T＞C和3460G＞A的无创检测方法。方法：研究对象为在温州医科大学附属眼视光医院就诊的3例（WZ1481、WZ1478、WZ1435）基因检测确定为m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突变的LHON患者。采集3例LHON患者和2例野生型健康对照的静脉血样及口腔黏膜细胞样本,然后分别用手工法和试剂盒法提取全基因组DNA,分析比较2种样本、2种方法提取的DNA的纯度及浓度有无差别。最后以携带m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突变的LHON患者和野生型的口腔黏膜细胞和外周血提取的全基因组DNA作为模板,通过PCR扩增分别包含以上3种突变的DNA片段,然后进行焦磷酸测序、斑点杂交和Southern blot分析PCR产物。结果：口腔黏膜细胞和血液提取的DNA浓度的差异无统计学意义（P＞0.05）。手工法提取的口腔黏膜细胞DNA纯度低于试剂盒法提取的口腔黏膜细胞和血液DNA的纯度,差异有统计学意义（P＜0.05）。口腔黏膜细胞提取的DNA产量与血液相似。DNA测序结果显示血液样本和口腔黏膜细胞样本具有很好的一致性,对照组均检测不到突变,而突变组可以检测到相应的突变。斑点杂交和Southern blot的结果也一致,对照组均为阳性而突变组均为阴性。结论：口腔黏膜细胞DNA可用于筛查和鉴定LHON的3个主要线粒体突变。本研究建立了一种方便、无创的方法来检测LHON相关的m.11778G＞A、m.14484T＞C和m.3460G＞A突变。     

LHON患者携带新的线粒体多态位点

目的:寻找此Leber遗传性视神经病变(leber′s hereditary optic neuropathy,LHON)家系的致病突变位点。方法:采集静脉血,提取全基因组DNA,聚合酶链反应(PCR)扩增目的片段,酶切和直接测序反应寻找碱基改变位点。结果:患者mtDNA序列存在G11778A突变,发现4个多态性位点,其中G14476A为未报道的多态位点,该位点未引起编码蛋白质的改变,属无义突变。该多态位点在100例正常人中所占比例为3%。结论:该家系以G11778A为致病突变,G14476A为新的线粒体多态位点。     

Leber遗传性视神经病遗传早发现象观察

目的:了解Leber遗传性视神经病(LHON)家系遗传早发现象及其与突变位点的关系.方法:调查5个LHON家系,采用DNA测序方法对其中3个家系的31位母系成员和40例健康人的原发突变位点11778和继发突变位点13730、13708、15257进行检测.结果:5个被调查的家系中4个存在遗传早发现象,31位母系成员均存在11778位点,无继发位点突变;40例正常人4个位点均无突变.所有受试者中新发现11719和15326位点的突变.结论:LHON存在遗传早发现象,但与各突变位点均无明显关系.     

用位点特异PCR法检测Leber遗传性视神经病家系的mtDNA11778G→A点突变

目的 寻找一种快速、准确、有定量突变比例的简单PCR方法,以识别Leber遗传性视神经病(LH0N)息者所携带的mtDNA ll778G→4A点突变。方法 根据已知致病突变的碱基变化,设计M(突变)和N(正常)引物,分别与反向引物R配对扩增,严格控制退火温度和其他PCR反应条件达到特异扩增。病例组为LH0N家系共10个个体,对照组为40位正常人。结果 在先证者、母系已发病亲属和一个10岁男孩(未发病)体内分别检出突变比例各不相同11778G→A点突变,而在家系的正常配偶、父系子女及40位正常对照组未检出该突变。结论 位点特异PCR是一种不受DNA序列有否限制性内切酶位点的检测突变的方法,适用于LH0N等致病突变明确的遗传病的基因诊断。     

Mitochondrial D-loop variation in leber hereditary neuropathy patients harboring primary G11778A, G3460A, T14484C mutations: J and W haplogroups as high-risk factors

BACKGROUND: Leber hereditary optic neuropathy (LHON) is a maternally inherited form of retinal ganglion cell degeneration leading to optic atrophy in young adults. It is caused by three primary point mutations including G11778A, G3460A, and T14484C in the mitochondrial genome. These three mutations account for the majority of LHON cases and affect genes that encode for different subunits of mitochondrial complex I. Mitochondrial DNA (mtDNA) has a non-coding region at the displacement loop (D-loop) that contains two hypervariable segments (HVS-I and HVS-II) with high polymorphism. METHODS: To investigate any possible association between LHON primary mutations and mtDNA haplogroups (hg), the nucleotide sequence of the HVS-I region of mtDNA was determined in 30 unrelated Iranian patients with LHON harboring one of the primary mutations and 100 normal controls with the same ethnicity. DNA was extracted from the peripheral blood after having obtained informed consent. The nucleotide sequence of HVS-I (np 16,024-16,383) was directly determined. RESULTS: Our analysis revealed a relatively high proportion of haplogroup J in LHON patients (53.3%) compared to normal controls (20%). In addition, a slightly significant increase of normal controls of haplogroup L has been confirmed (14% in normal controls vs. 0% in LHON patients at p = 0.03), whereas other haplogroups did not show contribution to LHON contingency. CONCLUSIONS: The analysis presented here provides evidence that there is an association between G11778A and G3460A with haplogroup J (including J1 and J2) and W, respectively. Therefore, we hypothesize that mtDNA haplogroups J (J1 and J2) and W might act as predisposing haplotypes, increasing penetrance of LHON disease.