EBV-LMP1与HSP90真核双表达质粒的构建及体外表达

目的从鼻咽癌组织中克隆EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP1)与热休克蛋白90β(HSP90β)基因,构建其真核双表达质粒pIRES-LMP1-HSP90β,并检测其在体外的表达。方法提取鼻咽癌组织总RNA,逆转录PCR获得LMP1基因片段和HSP90β基因片段,将二者连接于真核双表达质粒pIRES中,测定序列后,用脂质体包裹转染COS细胞,采用RT-PCR和Westernblot检测LMP1和HSP90β的表达。结果核酸序列测定证实本实验所构建的质粒正确,该双表达质粒在体外转染COS细胞后可表达LMP1和HSP90β分子。结论实验所构建的pIRES-LMP1-HSP90β双表达质粒能在体外同时表达LMP1和HSP90β分子。     

潜伏膜蛋白1基因真核表达载体的构建及其在鼻咽癌细胞中的表达

目的：构建真核细胞中表达潜伏膜蛋白1（LMP1）基因的增强荧光表达载体,观察其在鼻咽癌细胞中的表达。方法：从鼻咽癌C15细胞中获取编码LMP1的cDNA片段,经双酶切亚克隆到pEGFP-C1质粒载体,构建pEGFP-C1-LMP1真核表达载体。重组质粒经双酶切和测序鉴定,利用脂质体介导的方法将pEGFP-C1-LMP1体外瞬时转染鼻咽癌CNE2细胞,激光共聚焦显微镜观察LMP1的表达及其细胞内定位。结果：重组载体经SalⅠ和BglⅡ双酶切后,行琼脂糖凝胶电泳,可见1条与理论预测值一致的目的条带。DNA序列鉴定证实插入片段与GenBank提供的序列一致。将pEGFP-C1-LMP1瞬时转染鼻咽癌细胞株CNE2后,LMP1基因表达产物定位于细胞膜和细胞质中。结论：成功构建LMP1真核表达载体,并可在鼻咽癌CNE2细胞株中表达。     

SARS冠状病毒核蛋白与mGM-CSF融合质粒的构建及表达

目的构建SARS冠状病毒(SARS—COV)核蛋白(N)与mGM—CSF的融合真核表达质粒,借助mGM—CSF的免疫佐剂作用,提高SARSDNA疫苗的免疫效果。方法采用PCR方法扩增N和mGM—CSF基因片段,用分子克隆和基因融合的方法将目的片段定向插入真核表达载体中,构建融合表达质粒pVAX 1／N—mGM—CSF,并以融合质粒转染细胞,用免疫细胞化学和Western Blot的方法鉴定融合质粒在体外的表达。结果经酶切鉴定及DNA序列测定证实融合质粒构建正确,细胞转染实验表明,融合质粒能在COS-7细胞中表达。结论成功构建SARS—COV核蛋白与mGM—CSF的融合表达质粒,重组质粒能在真核细胞内表达。     

干扰HSP70-2的shRNA表达载体的构建及筛选

目的:利用pGenesil-1质粒构建针对热休克蛋白HSP70-2的短发夹RNA(shRNA)表达载体。方法:设计针对HSP70-2表达shRNA结构的互补DNA序列,经退火成双链,分别克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析。利用质粒转染大鼠精原细胞,用RT-PCR和Western blotting法检测转染后HSP70-2 mRNA和蛋白表达变化。结果:成功构建靶向HSP70-2的3个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-HSP70-21、pGenesil-1-HSP70-22和pGenesil-1-HSP70-23。酶切鉴定和测序分析重组质粒,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功。质粒筛选实验提示pGenesil-1-HSP70-23质粒对精原细胞HSP70-2基因的抑制作用最强,而pGenesil-1-HSP70-21的抑制作用最弱。结论:成功构建表达靶向HSP70-2的shRNA重组质粒载体。     

重组质粒pLMP1-p53mt的构建与表达

目的构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的双基因真核表达质粒,为研究突变型p53基因和EB病毒LMP1基因在鼻咽癌发生中的相互作用奠定基础.方法通过分子克隆技术,构建含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的真核表达载体pLMP1-p53mt;培养HeLa细胞,采用脂质体lipofectAMINETM 2000将该质粒转入HeLa细胞中,转染后48h,利用免疫细胞化学法研究突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的表达情况.结果重组质粒限制性内切酶酶切及PCR鉴定结果与预期一致;观察到转染细胞中突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的高效表达.结论成功构建了含突变型p53基因和EB病毒LMP1基因的双基因真核表达质粒.     

mGITRL真核表达质粒的构建及其在Lewis细胞中的表达

目的:构建含小鼠GITRL基因的真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,体外转染小鼠肺癌细胞株Lewis细胞。方法:利用PCR方法扩增mGITRL基因,克隆至pIRES2-eGFP载体,选择阳性克隆并进行序列测定。以电穿孔法转染Lewis细胞,通过G418筛选,获得稳定表达细胞株。结果:构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,基因测序与GenBank中发表的序列完全一致,体外转染Lewis细胞,经G418筛选,体外传代30代以上,RT-PCR及流式细胞仪检测该细胞株稳定表达mGITRL。结论:成功构建了真核表达质粒pIRES2-eGFP/mGITRL,并在小鼠Lewis细胞中稳定表达,为进一步研究GITRL的生物学功能提供研究基础。     

结核杆菌ESAT-6抗原及Flt3配体双表达核酸疫苗的构建与体外表达

目的:构建可同时表达flt3配体(flt3-ligand,FL)和结核杆菌6kD早期分泌蛋白(ESAT-6)的重组pIRES质粒,并在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中表达,为进一步研究结核杆菌DNA疫苗提供实验基础.方法:采用PCR方法将FL和ESAT-6基因分别定向克隆入真核双表达载体pIRES.在酶切分析及序列测定后,用脂质体转染至GMC细胞,Western blot鉴定其体外表达.结果:核酸序列测定证实重组质粒构建正确,该重组质粒在体外GMC细胞中能表达FL和ESAT-6两种蛋白.结论:成功构建了结核杆菌FL和ESAT-6双顺反子真核表达质粒,并在体外实现了共表达.     

人真核表达质粒载体pcDNA3.1-hOPG的构建及体外表达

目的 构建表达人骨保护素基因（hOPG）的真核表达质粒pcDNA3．1-hOPG,并检测其在体外的表达,为治疗破骨细胞功能异常引起的骨吸收提供实验基础。方法 从MGC：29565上获得hOPG基因片段并用PCR方法扩增,将其连接于真核表达质粒pcDNA3．1（-）,测定序列后,用脂质体包裹转染C2C12细胞,采用免疫组化和骨吸收抑制实验检测OPG的表达及功能。结果 经酶切和测序鉴定证实本实验构建的重组表达质粒正确,该质粒在体外转染C2C12细胞后可表达功能性OPG蛋白。结论成功构建的pcDNA3．1-hOPG重组质粒能在体外表达OPG蛋白。     

细胞周期蛋白D1重组质粒的构建及其在鼻咽癌细胞中的表达

目的克隆人细胞周期蛋白D1基因,构建真核表达载体,诱导并鉴定其表达。方法利用RT-PCR法,以低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞mRNA为模板,扩增周期蛋白D1基因,构建重组表达载体pIRES2-EGFP-D1和pEGFP-C2-D1,用脂质体LipofectamineTM 2000将重组质粒转染到低分化鼻咽癌CNE-2Z细胞,诱导其表达,免疫荧光、Western blotting等鉴定其表达。结果电泳获得918bp预期片段,重组质粒经酶切、PCR和测序分析证实含有周期蛋白D1完整读码框,将重组质粒导入CNE-2Z细胞并成功表达,目的蛋白经免疫荧光和Western blotting鉴定具有生物学活性。结论成功克隆并构建含周期蛋白D1基因的真核表达GFP质粒,为进一步研究周期蛋白D1在鼻咽癌CNE-2Z细胞中的作用奠定基础。     

TH和GDNF双基因表达载体的构建及其在MES23.5细胞中的表达

目的 构建酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase,TH)和胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor,GDNF)双基因表达载体并检测其在体外的表达,为帕金森病提供新的治疗措施.方法 采用分子克隆技术,从pWAV2-TH质粒酶切获得人TH基因片段,将其克隆入真核表达质粒载体pIRES的上游,构建出pIRES-TH.PCR法扩增小鼠GDNF基因片段,克隆入pIRES-TH的下游,构建出携带TH和GDNF双基因的重组质粒pIRES-TH-GDNF.用酶切电泳验证重组结果的正确性,测序检测质粒重组后的序列.随后将重组质粒用Lipofectamine2000转染至MES23.5细胞,经G418筛选后,以RT-PCR及免疫荧光法检测TH和GDNF基因在mRNA及蛋白水平的表达.结果 重组质粒酶切后其片段大小与预期结果相同,测序发现基因序列完全正确.转染后MES23.5细胞中TH和GDNF基因的水平明显升高(P＜0.05).结论 重组pIRES-TH-GDNF质粒构建成功并能在体外正确表达TH和GDNF基因.     

蛇毒cystatin基因真核表达质粒的构建与表达

目的 构建蛇毒cystatin真核表达载体pcDNA3.1/His-cystatin,对其在COS7细胞中的表达进行初步研究.方法 采用PCR法扩增蛇毒cystatin基因片段,插入pcDNA3.1/His C载体中,测定DNA序列后,转染COS7细胞,利用Western-blot检测COS7细胞中cystatin基因的表达.结果 经酶切、测序鉴定证实插入片断已正确,Western-blot检测表明融合蛋白能够在COS7细胞中表达.结论 构建的真核表达载体peDNA3.1/His-cystatin能够在COS7细胞中表达蛇毒cystatin融合蛋白.     

人IGF-I基因真核表达质粒pIRES2-EGFP-IGF-I的构建

目的利用基因工程原理构建人胰岛素样生长因子I(IGF—I)全长基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-IGF-I。方法应用PCR方法从人肝细胞eDNA文库中提取人IGF-I全长cDNA序列，克隆人T载体pMDl8中，经测序证实序列正确后，进行双酶切并定向插入真核表达载体pIRES2-EGFP中，利用双酶切、电泳和PCR证实插入片段的正确性。结果经测序证实，目的基因人IGF-I的全长基因序列被正确扩增；构建的真核表达载体经双酶切和PCR鉴定证实，hIGF-I被定向插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的多克隆位点中：结论利用基因工程原理可以正确地构建人IGF-I全长基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-IGF-I。     

人DC-SIGN真核表达载体的构建及表达

目的构建含有FLAG标签的人DC—SIGN真核表达载体,并在人胚肾293T细胞中进行表达。方法通过PCR方法获得含有FLAG标签的人DC—SIGN分子基因,将其插入到真核表达载体pIRES—neo中。构建的重组质粒pIRES—neO—FLAG—DC—SIGN转染293T细胞,利用流式细胞仪、免疫荧光及WesternBlot检测其表达情况。结果含FLAG标签的人DC—SIGN基因测序正确,PCR和酶切鉴定证明FLAG—DC—SIGN基因已成功连入真核表达载体pIRES—neo中;检测结果显示重组质粒pIRES—neo—FLAG—DC—SIGN在293T细胞中得到表达。结论成功构建了重组质粒pIRES—neo—FLAG—DC—SIGN,且在293T细胞中能有效表达,为后续DC靶向性疫苗研究奠定了基础。     

9 ku颗粒溶素真核表达质粒的构建与分泌表达

目的:构建能分泌表达人9 ku颗粒溶素(granulysin)的真核质粒,为下一步利用颗粒溶素基因治疗肿瘤奠定基础.方法:以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板,通过聚合酶链反应(PCR)扩增获得含分泌肽编码基因的9 ku的颗粒溶素基因片段后,定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,获得重组表达质粒pBudCE4.1-S9K,通过PCR,双酶切及插入片段序列测定对重组质粒进行鉴定;采用RT-PCR,免疫细胞化学与Dot-ELISA法检测pBudCE4.1-S9K在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌.结果:成功扩增出含分泌肽编码基因的9 ku的颗粒溶素基因片段;经酶切,PCR及测序鉴定证明得到读码框正确的重组质粒;转染细胞证实可分泌表达9 ku颗粒溶素.结论:成功构建能分泌表达9 ku颗粒溶素真核表达质粒pBudCE4.1-S9K.     

αA晶体蛋白基因启动子与HSP70融合基因表达载体的构建及鉴定

目的构建αA晶体蛋白基因启动子与HSP70融合基因表达载体pαACP-HSP70。方法应用聚合酶链反应(PCR)技术,从质粒pIRES2-EGFP-HSP70中扩增HSP70基因,将已构建的含αA晶状体蛋白基因特异性启动子活性片段(αACP)的质粒pαACP-IRES2-EGFP双酶切,回收载体片段,利用基因重组技术,将HSP70基因片段定向插入载体启动子αACP之后,构建特异性表达载体,命名为pαACP-HSP70,并通过PCR、酶切和DNA测序进行鉴定。结果构建的pαACP-HSP70质粒通过酶切图谱鉴定、PCR检测有1924 bp条带出现,通过测序显示所克隆的HSP70基因与基因库中的同种序列比较,核苷酸序列有100%的同源性。结论成功构建了晶状体上皮细胞特异性表达载体pαACP-HSP70。     

乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达载体的构建

目的：构建乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达质粒。方法：用PCR方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出结核杆菌HSP70基因序列,应用T－A克隆技术,克隆到质粒pGEM-T vector,经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( ),构建成pcDNA3.1-HSP70重组质粒,然后,再用PCR方法,从质粒pEcob6中扩增出HBsAg基因,并克隆到质粒pcDNA3.1-HSP70,将HBsAg基因的C端与HSP70基因N端连接,构建HBsAg和HSP70融合表达质粒pcDNA3。1－SHSP70,结果：经酶切鉴定和DNA测序证实重组质粒构建正确,结论：乙肝HBsAg和结核杆菌HSP70融合表达载体构建成功。     

小鼠IL-5真核表达质粒的构建和体外表达

目的 构建小鼠白细胞介素-5（IL-5）基因真核表达质粒,了解该质粒在真核细胞COS细胞中有效表达情况.方法 以含有小鼠IL-5基因的克隆质粒pORF9-mIL-5为模板,通过PCR扩增小鼠IL-5全段基因,应用基因工程技术将扩增的基因片段插入peDNA3.1（＋）真核表达质粒,构建重组真核表达质粒pcDNA-m IL-5,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,用脂质体转染技术转染COS细胞,用Western Blot鉴定该质粒是否能够在真核细胞中表达相应的目的蛋白质.结果 成功扩增了小鼠IL-5全长基因,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA-m IL-5,Westem blot方法证实该质粒能在COS真核细胞中有效表达小鼠IL-5目的蛋白.结论 成功构建了小鼠IL-5基因的真核表达质粒载体,为进一步研究IL-5的新功能和免疫基因治疗奠定了基础.     

人前列腺干细胞抗原基因PSCA的扩增及真核表达

目的：从人前列腺癌细胞系中扩增获得目的基因前列腺干细胞抗原（PSCA）,构建真核表达载体并进行真核表达。方法：从人前列腺癌细胞系LNCaP中扩增目的基因PSCA,构建真核表达质粒plRES-neo—PSCA-His,脂质体法转染小鼠黑色素瘤B16细胞,用RT—PCR及免疫荧光和流式细胞仪分别检测B16细胞中人PSCA基因的mRNA和蛋白表达。结果：得到372bp人PSCA目的基因片段,序列测定证实与GenBank上登录的序列一致。结论：成功构建pIRES—neo—PSCA—His质粒并验证其真核表达,为PSCA在前列腺癌免疫治疗研究中的应用奠定了基础。     

人热休克蛋白70基因在大肠杆菌中的表达及纯化

目的:构建人热休克蛋白70(HSP70)的原核表达载体,诱导其表达并纯化.方法:应用PCR技术从人胆管癌组织中扩增出HSP 70基因片段,经T-A克隆连接到末端经平滑处理后的pMD18-T Simple质粒并测序.利用双酶切技术构建重组原核表达载体pGEX-4T-1-HSP 70,并转化大肠杆菌JM 109,经IPTG诱导后表达得到HSP70融合蛋白.应用Glutathione-Sepharose4B亲和层析柱提纯融合蛋白,用生物素化凝血酶分离并纯化目的蛋白,最后行Wsetern blot鉴定.结果:PCR扩增结果与预计目的基因大小一致;序列分析与GeneBank中收录完全一致;重组表达载体pGEX-4T-1-HSP 70构建成功;Western blot结果显示目的蛋白可以与兔抗人的HSP70单克隆抗体特异性结合.结论:HSP 70编码序列已经成功克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,并在大肠杆菌JM 109中获得表达.