汉坦病毒核衣壳蛋白抗原表位的研究进展

汉坦病毒核衣壳蛋白具有很强的抗原性和免疫原性，其氨基端约１００个氨基酸大多具有亲水性，且能被患者和免疫动物的血清及许多抗汉坦病毒的单克隆抗体所识别，是汉坦病毒核衣壳蛋白的主要抗原表位区。本文就近年来 一方面的研究作一简要综述。     

汉坦病毒核衣壳蛋白抗原表位的研究进展

汉坦病毒核衣壳蛋白具有很强的抗原性和免疫原性,其氨基端约100个氨基酸大多具有亲水性,且能被患者和免疫动物的血清及许多抗汉坦病毒的单克隆抗体所识别,是汉坦病毒核衣壳蛋白的主要抗原表位区。本文就近年来这一方面的研究作一简要综述。     

汉坦病毒核衣壳蛋白T细胞表位研究进展

汉坦病毒核衣壳蛋白是主要结构蛋白，具有很强的抗原性和免疫原性，可诱导细胞免疫，尤其是特异性细胞毒T淋巴细胞（CTL）反应，在抗病毒免疫中起着关键作用。本文就近年来汉坦病毒核衣壳蛋白T细胞表位方面的研究作一简要综述。     

汉坦病毒核衣壳蛋白T细胞表位研究进展

汉坦病毒核衣壳蛋白是主要结构蛋白,具有很强的抗原性和免疫原性,可诱导细胞免疫,尤其是特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)反应,在抗病毒免疫中起着关键作用。本文就近年来汉坦病毒核衣壳蛋白T细胞表位方面的研究作一简要综述。     

汉坦病毒感染者B淋巴细胞免疫应答

汉坦病毒感染存在错综复杂的免疫应答.B淋巴细胞受病毒抗原刺激后,可产生针对不同抗原的特异性抗体,发挥体液免疫效应,因此,B淋巴细胞免疫应答对疾病的预防、诊断治疗和发病机制研究具有重要意义.本文对汉坦病毒感染后的抗体应答、抗原交叉反应及B细胞表位定位作了简要综述.     

卡氏肺孢子虫MSG抗原片段细胞表位的预测

[目的]预测卡氏肺孢子虫主要表面抗原(MSG)片段的B细胞和T细胞抗原表位. [方法]运用Sig-nalp3.0、EMBOSS等网络服务器推测卡氏肺孢子虫MSG抗原片段的B细胞和T细胞抗原表位,分析预测结果. [结果]MSG抗原片段存在3个潜在的B细胞抗原表位及6个潜在的T细胞抗原表位.B细胞抗原表位在氨基酸序列的位置为69-79、96-101、133-140aa 3个区域内或其附近;T细胞抗原表位在氨基酸残基的位置为7-22、28-43、20-35、40-55、53-68、86-101aa. [结论]MSG抗原表位的预测为有目的的克隆基因片段,研究高效的表位疫苗奠定基础.     

肿瘤抗原SCCAg B细胞抗原表位及HLA I类限制性CTL表位的生物信息学分析

目的预测鳞状细胞癌抗原(squamous cell carcinoma antigen,SCCAg)的B细胞抗原表位及HLA I类限制性细胞毒性T细胞表位。方法获得SCCAg的三维结构后,采用生物信息学方法预测SCCAg蛋白存在的B细胞表位;而后,采用Net CTL、Prot Param等软件方法预测SCCAg中可能存在的HLA I类限制性CTL表位。结果 SCCAg蛋白中包含10个线性B细胞表位和5个构象B细胞表位;结合与HLA I类分子结合力、蛋白酶体切割效率和TAP转运效率,经Net CTL预测发现,针对不同的HLA I类分子,肿瘤抗原SCCAg蛋白中存在多个HLA I类分子的限制性CTL表位。结论综合运用多种方法预测了肿瘤抗原SCCAg蛋白中存在的B细胞抗原表位和HLA I限制性的CTL表位,为下一步针对SCCAg蛋白开展靶向免疫治疗提供了基础。     

登革病毒E蛋白抗原表位研究进展

提要登革病毒是虫媒病毒B组的一个成员,其RNA编码3种结构蛋白和7种非结构蛋白。研究发现,病毒抗原中既存在有中和性抗原表位,又有免疫增强抗原表位。本文阐述了登革病毒主要抗原E蛋白的表位研究进展。     

肠道病毒71型衣壳蛋白的抗原表位及其单克隆抗体

肠道病毒71(EV71)是手足口病的主要致病原之一,可引发大部分重症病例和死亡病例,其衣壳蛋白VP1～VP4作为免疫原包含了能够诱导体液免疫(产生抗体)和细胞免疫的抗原表位.迄今为止已有多个免疫显性的线性或构象性B细胞抗原表位被确定,与之相关的单克隆抗体在EV71感染的早期诊断和单克隆抗体治疗方面也已显示一定程度的应用前景,同时也有少数T细胞抗原表位被确定.本文对上述研究情况进行综述.     

SARS冠状病毒S基因序列及细胞抗原表位预测

目的 比较SARS冠状病毒各分离株S基因序列及氨基酸序列之间的差异，预测SARS-CoV的S蛋白的抗原表位。方法 利用Lasergene软件包中的EditSeq从21株SARS冠状病毒分离株截取S基因序列并翻译成氨基酸序列，然后用ClustalX软件对截取序列进行比较分析，确定基准株，最后用Protean软件对基准株进行抗原表位预测。结果 在21株分离株的S基因中有8株核苷酸序列、13株氨基酸序列没有发生点突变；预测出78个可能性抗原表位。结论 SARS-CoV的S蛋白相当保守，只发生个别点突变，可能性抗原表位多，且在其中的14个区域中可能性最显著。     

汉坦病毒G2糖蛋白在昆虫细胞中的表达及其在免疫诊断中的应用

目的构建汉坦病毒(HV）Z10株包膜糖蛋白G2基因的重组表达载体，探索其在昆虫细胞中的表达及在免疫荧光诊断中的应用。方法以质粒pUCm—Z10M为模板设计引物，用聚合酶链反应(PCR)扩增Z10株G2基因片段，将G2片段克隆入pUCm—T质粒载体，碱法提取质粒pUCm-Z10-G2，酶切后将回收片段插入杆状病毒转移载体pFastBacHTa，构建重组体pFastBacHTa-Z10-G2，重组体转化感受态细胞E．coli DH10Bac后，经2轮筛选，提取重组质粒转染昆虫细胞sf9，并用间接免疫荧光技术检测表达的G2蛋白。结果获得含有编码HV Z10株的包膜糖蛋白G2基因的重组质粒，转染昆虫细胞表达出G2蛋白，与肾综合征出血热(HFRS)阳性血清反应，昆虫细胞内呈现特异性环状荧光。检测40份HFRS血清，与全病毒细胞抗原片的符合率为95％。结论成功构建HV Z10株包膜糖蛋白G2基因的表达载体，并在昆虫细胞中表达。可利用重组G2蛋白检测HV感染。     

汉坦病毒核蛋白基因表达及产物抗原活性的研究

为了制备肾综合征出血热（ ＨＦＲＳ） 诊断用基因工程抗原,构建了合汉坦病毒７６１１８ 株编码核蛋白（ ＮＰ） 基因片段的重组质粒ｐＢＶ２２０Ｈ１－３Ｓ, 经转化大肠杆菌和诱导表达,ＳＤＳＰＡＧＥ 显示菌体中有分子量约为４８ ＫＤ 的新蛋白质生成。用经包含体纯化获得的表达产物做抗原,以间接酶联免疫（ＥＬＩＳＡ） 检测了４８ 份疑似出血热患者的血清特异性ＩｇＧ,其结果与经典的间接免疫荧光（ＩＦＡ） 检测的阴性、阳性及总符合率分别为１００ ％ 、９２－８６ ％ 和９３－７５ ％ 。证实该重组ＮＰ 具有良好的生物活性和诊断抗原价值     

汉坦病毒感染Vero细胞病毒滴度和抗原滴度的动态观察

目的　观察汉坦病毒 (HV)在Vero细胞上的适应能力和毒株在该细胞中的增殖规律。方法　将HV感染Vero细胞 ,每隔 3d收取细胞培养液 ,直到细胞衰老 ,并观察细胞的病变情况。采用间接免疫荧光法 (IFAT)和反向被动血凝试验 (RPHA) ,观察细胞培养液的病毒滴度和抗原滴度的动态变化。结果　HV不致Vero细胞产生病变 ,病毒感染细胞第 8～ 11天时细胞培养液的病毒滴度和抗原滴度最高 ,以后逐渐降低 ,但直到细胞感染病毒 3 2d时其培养液的病毒滴度和抗原滴度仍稳定在 5 .0 0LgTCID50 /ml和 1∶2 0以上。结论　两株病毒已适应于Vero细胞 ,且具有病毒滴度高、毒力强和抗原性良好的特性 ,是Vero细胞肾综合征出血热灭活疫苗良好的后备筛选毒株。     

HBsAg重组腺病毒载体的构建及在树突状细胞的表达

目的构建能高效转导HBsAg基因的重组腺病毒Ad-S,证实其能在小鼠树突状细胞内表达,以用于基因治疗的实验研究。方法应用AdEasyTMXL腺病毒载体系统,首先将HBV S基因克隆到p-shuttle-CMV形成重组穿梭载体,用PmeⅠ酶切使之线性化,电转化到BJ5183-AD-1细胞中形成重组腺病毒Ad-S质粒,后者以PacⅠ酶切线性化,转染到AD293细胞包装为重组腺病毒Ad-S。Ad-GFP或Ad-S以MOI为100转染经GM-CSF、IL-4和TNF-α等细胞因子诱导培养的小鼠骨髓来源的树突状细胞,用流式细胞仪分析细胞荧光表达,Western blot、RIA和ELISA法检测HBsAg的表达。结果PCR、序列测定和酶切鉴定证明HBsAg重组腺病毒Ad-S构建正确,扩增到的病毒颗粒滴度为108/ml;流式细胞仪分析细胞荧光表达率为(92.93±2.35)%,荧光强度达236.67±45.72;Western blot、RIA和ELISA法均检测到Ad-S转染的树突状细胞能表达HBsAg。结论HBsAg重组腺病毒Ad-S构建正确并能高效转染树突状细胞和表达HBsAg,为进一步研究腺病毒介导HBsAg基因修饰的DC疫苗的免疫治疗作用奠定了基础。     

2007年浙江省鼠类感染汉坦病毒监测及病毒分离

目的了解浙江省鼠类自然感染汉坦病毒（HV）情况和病毒型别,为肾综合征出血热（HFRS）防治提供科学依据。方法采集鼠类肺组织和血清标本,用间接免疫荧光试验检测鼠血清IgG抗体,直接免疫荧光试验检测鼠肺Hv抗原。HV抗原阳性鼠肺接种Vero—E6细胞分离病毒,用HV单克隆荧光抗体鉴定分离株的型别。结果共捕获鼠形动物1129只,其中黑线姬鼠为优势种,鼠肺HV抗原阳性率为3．0％,鼠血标本IgG抗体阳性57份,阳性率8．0％。分离到6株汉滩（HTN）型病毒,其中来自黑线姬鼠5株,褐家鼠1株。结论浙江省存在以黑线姬鼠为主要传染源的HFRS疫源地,HV主要流行型别为HTN型。     

汉坦病毒和恙虫病东方体复合感染的组织细胞培养研究

目的了解汉坦病毒（HV）和恙虫病东方体（Ot）在宿主体内共生情况.方法采用Vero E6细胞体外培养法研究HV、Ot在宿主细胞内共生特征.结果5组感染Vero E6细胞体外培养检测结果发现：先后、同时和单纯实验感染的5组细胞中,HV和Ot先后、同时接种感染组在细胞传至第3代时检测均见有HV和Ot的双重感染,阳性率随传代次数增加而增加.而HV和Ot单纯分别感染组细胞传第2代时即可检测到HV和Ot,阳性率亦随传代次数的增加而增加.在传代培养中单纯感染组的阳性率均显著高于先后和同时感染组.其结果均用PCR和RT-PCR进行了基因鉴定.结论研究结果提示HV和Ot可在同一宿主细胞内共生,在感染初期有相互抑制作用;对HV和Ot的流行病学有一定的理论意义.     

汉坦病毒单克隆抗体的制备和鉴定

本文用汉坦病毒A16和R22株活毒免疫BALB／c小鼠，取牌细胞与sp2／0骨髓瘤细胞融合，制备了6株分泌抗汉坦病毒单克隆抗体的杂交癌细胞系。单克隆抗体IgG亚类鉴定表明，其中2株为IgG1，1株为IgG2b，3株为IgG2a。用间接免疫荧光检测单抗腹水滴度，分别在1：10240～1：81920之间；用反向被动血凝抑制试验测定单抗腹水，滴度均低于1：20。免疫印迹试验表明，6株单克隆抗体均为抗核蛋白单抗。对已知型别病毒的反应话表明，其中3株为组特异性单抗，1株为汉滩型特异性单抗，2株为汉城型特异性单抗。还用6株单抗对宁夏新分离毒株进行抗原性分析。     

汉坦病毒接种小白鼠后病毒的分布及血清中抗体与生化值的动态观察

用汉坦病毒ＮＱＲ－１０７Ｒ株接种小白鼠，观察病毒在小白鼠体内各器官的分布和消长情况以及血清抗体和血清中的ＧＰＴ、ＬＤＨ、总ＢＩＬ、ＢＵＮ及尿酸值的变化趋势。结果，初期几乎能从小白鼠所有的器官分离到病毒，随着时间的推移，病毒的分离越来越少，而血清抗体的滴度则相反，随时间而升高，从血清的各生化值看出，初期是一过性的血清ＬＤＨ、尿酸升高，ＢＵＮ值下降，但是，病毒对肝肾的直接损害不大。     

黄曲霉毒素B_1抗原的构建

黄曲毒素Ｂ１是只有反应原性而无免疫原性的半抗原，不能直接刺激动物抗体，只有和牛血清蛋白（ＢＳＡ）、卵清白蛋白（ＯＶ）等载体蛋白连接后才能刺激动物产生分泌抗体，黄曲霉毒素Ｂ１抗原的构建是黄曲霉毒素Ｂ１免疫学检测研究的第一步。本文首先研究了回流温度和时间对黄曲霉毒素Ｂ１肟产生的影响，通过统计分析得到８５℃，回流２ｈ时黄曲霉毒素Ｂ１肟的产率最高，产率高达８９％。在此基础上进一步研究了黄曲霉毒素Ｂ１肟与载体蛋白—牛血清白蛋白反应的起始摩尔比对产物摩尔比的影响，随着反应起始摩尔比的增加，产物的摩尔比也稍有增加，但是增加幅度不显著，而黄曲霉毒素Ｂ１肟的利用率则随着起始摩尔比的增加而减少，选择３０∶１为黄曲霉毒素Ｂ１肟与牛血清白蛋白的反应起始摩尔比得到摩尔比为６．５∶１的黄曲霉毒素Ｂ１肟与牛血清蛋白的连接物。     

梅毒苍白密螺旋体多表位抗原基因的构建、表达及免疫反应性的鉴定

目的为梅毒检测试剂提供特异性强、灵敏度高的新型多表位重组抗原。方法PCR扩增Tp17和Tp0453基因的优势抗原表位,连接后插入pQE32质粒中构建多表位嵌合重组体pQE32/Tp0453-17,IPTG诱导表达,免疫印迹法检测表达产物的免疫反应性。结果成功构建了多表位嵌合重组质粒pQE32/Tp0453-17,经酶切、测序分析表明,插入的基因片段为Tp0453和Tp17基因,片段长约1180 bp,其测序结果与GenBank上登录序列完全一致;SDS-PAGE分析表达产物发现,融合基因表达的重组蛋白Mr约为52×103,表达产物占全菌总蛋白的19.3%,并且在细胞内主要以包涵体形式存在;用Western印迹法检测显示,该重组蛋白能与梅毒患者的阳性血清反应,具有良好的抗原性。结论成功表达了具有良好免疫反应性的多表位嵌合重组抗原,为新型梅毒快速诊断试剂盒的研究奠定了良好的实验基础。