siRNA 表达载体抑制宫颈癌SiHa细胞增殖的实验研究

目的 观察HPV16E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响.方法 利用脂质体将HPV16E7特异性siRNA表达载体转染SiHa细胞,通过荧光定量RT-PCR检测E7 mRNA的变化;流式细胞仪检测E7蛋白的变化和细胞周期的分布;MTT法检测细胞增殖的变化.结果 HPV16E7 siRNA表达载体可明显抑制SiHa细胞E7 mRNA和E7蛋白的表达,抑制率分别为92.15%、84.30%;阻滞SiHa细胞由G1期进入S期;抑制细胞的生长.结论 HPV16E7 siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达,从而调控肿瘤细胞周期,抑制肿瘤细胞增殖.     

siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响

目的: 观察HPV16 E6 siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响.方法: 利用脂质体将HPV16 E6特异性siRNA表达载体转染Caski细胞,通过荧光定量RT-PCR检测E6 mRNA的变化,流式细胞仪检测E6蛋白和细胞凋亡率的变化,MTT法和细胞克隆法检测细胞增殖的变化.结果: HPV16 E6 siRNA表达载体可明显抑制Caski细胞E6 mRNA和E6蛋白的表达,抑制率分别为89.5%和98.1%;表达载体可明显增加细胞凋亡率,抑制细胞的增殖和克隆的形成.结论: HPV16 E6 siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌Caski细胞E6基因的表达,增加细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞增殖和克隆的形成.     

载体介导的RNAi技术抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达

目的 探讨HPV16E7特异性小干扰RNA(siRNA)表达载体对宫颈癌CaSki细胞E7基因的抑制作用.方法 构建HPV16 E7特异性siRNA表达载体,利用脂质体转染CaSki细胞,以荧光定量RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白表达的影响.结果 3种表达载体P1、P2、P3均能抑制CaSki细胞E7基因mRNA和蛋白的表达,其中载体P1抑制作用最强,在转染后3周,对E7 mRNA和蛋白的抑制率分别为92.86%和81.0%.结论 HPV16E7 siRNA表达载体能有效地抑制宫颈癌CaSki细胞E7基因的表达.     

RNAi表达载体对宫颈癌HPV16 E6基因表达的抑制作用

目的研究RNA干扰(RNA interference，RNAi)表达载体对宫颈癌HPV16E6基因的抑制作用。方法构建针对HPV16E6基因的RNAi质粒表达载体，脂质体法转染宫颈癌caski细胞株，应用荧光定量PCR及流式细胞术检测其对HPV16E6mRNA及蛋白表达的影响。结果构建的三种表达载体均抑制了HPV16E6的mRNA及蛋白的表达，其中转染B号载体的caskiB细胞HPV16E6mRNA表达仅相当于空白组的21．7％，蛋白抑制率达98．1％。结论RNAi表达载体可以有效的抑制HPV16E6基因的表达。     

RNA干扰HPV16 E6基因表达对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响

目的：探讨HPV16 E6小干扰RNA（siRNA）对宫颈癌SiHa细胞增殖的影响。方法：利用化学合成的方法,合成针对HPV16 E6的siRNA,借脂质体转染SiHa细胞。应用荧光定量RT—PCR和Western—blot检测HPV16 E6mRNA及其蛋白水平的表达。MTT法绘制细胞生长曲线。流式细胞术评价HPV16 E6siRNA对细胞周期的影响。结果：HPV16 E6siRNA转染细胞48h及72h后,细胞内HPV16 E6mRNA及蛋白表达量明显下调,与HPV16 E6阴性对照组及空白组比较[48h（1．85±0．15）vs（2．14±0．13）,（2．29±0．11）;72h（1．82±0．06）vs（2．32±0．14）,（2．35±0．23）],差异有显著性意义（P〈0．01）;MTT显示细胞生长明显受到抑制;流式细胞术‘检测显示,E6siRNA可将细胞阻滞在G1期。结论：HPV16 E6siRNA能抑制SiHa细胞增殖。     

HPV-16 E6基因沉默对宫颈癌CaSki细胞的影响

目的: 研究特异性抑制HPV E6基因的表达对宫颈癌CaSki细胞的影响. 方法: 构建表达HPV-16 E6基因siRNA重组质粒,体外转染CaSki细胞后检测E6 mRNA表达变化及E6主要作用靶分子P53的蛋白变化;流式细胞术分析细胞周期. 结果: 特异RNAi表达质粒转染CaSki细胞后明显降低了E6 mRNA水平,且P53蛋白水平增高. 流式细胞仪测定发现细胞停滞在G0-G1期,细胞增殖受到抑制. 结论: 采用RNA干扰技术能沉默CaSki细胞中整合的HPV-16 E6基因的表达,使细胞中抑癌蛋白P53水平增高,导致肿瘤细胞生长停滞.     

稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆的建立

目的构建针对HPV16 E6基因的逆转录病毒载体,感染HPV16阳性宫颈癌细胞,筛选稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆。方法采用DNA重组技术构建表达靶向HPV16E6基因的pSUPER．retro RNAi逆转录病毒载体,脂质体法将逆转录病毒载体转染人包装细胞PA317,G418筛选稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,收集病毒上清,感染靶细胞SiHa,G418筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆,RTPCR检测细胞中E6 mRNA表达,细胞增殖实验检测细胞增殖力。结果获及稳定产生逆转录病毒的细胞克隆,病毒感染靶细胞SiHa后,筛选出稳定表达HPV16 E6 siRNA的细胞克隆,RTPCR示HPV16 E6 mRNA表达受到抑制。细胞增殖实验示克隆细胞增殖率明显下降。结论成功建立稳定表达HPV16 E6 siRNA细胞克隆,特异性的siRNA能抑制细胞生长、HPV16 E6 mRNA表达,HPV16 E6 siRNA可能成为治疗宫颈癌的一种新方法。     

RNA干涉（RNAi）抑制宫颈癌细胞SiHa中E7基因表达的实验研究

目的探讨HPV16 E7特异性小干涉RNA（siRNA）表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的抑制作用。方法构建HPV16 E7特异性表达载体,利用脂质粒转染SiHa细胞,用RT-PCR及Western blot检测其对E7 mRNA及蛋白的影响。结果两条siRNA均能有效抑制E7mRNA的转录表达,其中以pshRNA-HPV16 E71作用效果最明显,在转染后72h,对E7 mRNA和蛋白的抑制率分剐为78．4％和57．6％。结论HPV16 E7 siRNA表达载体对宫颈癌SiHa细胞E7基因的表达有抑制作用。     

HPV16E6对不同p53基因型宫颈癌细胞 凋亡及化疗敏感性的影响

目的：探讨HPV16E6对不同p53基因型的宫颈癌细胞化疗药物敏感性的影响。方法：应用AO/EB染色结合荧光显微镜技术及Annexine V-FITC/PI双标法流式细胞仪检测不同浓度DDP干预前后宫颈癌细胞凋亡情况;Western印迹检测DDP干预后对HPV16E6和p53mt蛋白表达的影响;通过差异RT-PCR检测不同浓度DDP干预C33A,C33A-E6,C33A-P和CaSki 4组细胞24和48 h后HPV16E6基因mRNA表达的变化。结果：AO/EB染色和流式细胞术检测的C33A,C33A-E6,C33A-P,CaSki细胞随着DDP干预剂量的增大,凋亡率亦明显增加(P＜0.05)。Western印迹结果示C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6蛋白的表达随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长而逐渐降低甚至难以检测到表达(P＜0.01),而未干预的对照组C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6的表达量稍有增加。C33A-E6,C33A和C33A-P 3组细胞中均检测到p53mt的表达,但随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长,3组细胞总蛋白中p53mt的表达量均无明显改变(P＞0.05)。差异RT-PCR结果表明,在未予DDP干预的情况下,C33A-E6与CaSki细胞在24 h时HPV16E6 mRNA的表达量无差异,而在48 h时则C33A-E6细胞的HPV16E6 mRNA表达量显著高于CaSki细胞(P＜0.05),且两组细胞48 h的HPV16E6 mRNA表达均较24 h显著增高(P＜0.05);在24和48 h两时间段内,随着DDP干预浓度的增加,两组细胞的HPV16E6 mRNA表达量均逐渐减少(P＜0.01);但在同样浓度的DDP干预时,C33A-E6与CaSki的HPV16E6 mRNA表达量无统计学差异(P＞0.05)。结论：HPV16E6基因对宫颈癌细胞株化疗敏感性的影响与p53的基因型(p53mt/p53wt )无明显关系,其可能通过其他作用机制对C33A细胞的凋亡和化疗敏感性产生作用。     

沉默HPV16 E6基因对人宫颈癌裸鼠移植瘤的抑制作用

目的 采用RNA干扰抑制人宫颈癌CaSki细胞裸鼠移植瘤中人乳头瘤病毒(human papillomavirus-16,HPV16)E6基因的表达,观察对裸鼠移植瘤的抑制作用.方法 将HPV16 E6特异性的小干扰RNA(small interference RNA,siRNA)真核表达载体转染到人宫颈癌细胞株CaSki细胞中,经G418筛选,RT-PCR检测E6基因的表达;将细胞接种到BALB/c裸鼠背部皮下,同时将该质粒注射到人宫颈癌CaSki细胞移植瘤的裸鼠中,观察肿瘤出现时间及体积变化;观察肿瘤组织的病理改变.结果 成功筛选到持续表达E6 siRNA的CaSki细胞,经RT-PCR检测该细胞中HPV16 E6基因表达降低;裸鼠成瘤实验结果显示,处理后的CaSki细胞成瘤能力明显降低,抑瘤率为71.4%;注射质粒进行基因治疗后,裸鼠肿瘤生长受到抑制,肿瘤的体积与质量明显低于CaSki细胞组,差异具有显著性(P＜0.05).病理检查结果显示,经pGensil-CH2处理的肿瘤生长不佳,细胞分裂像少见,组织内有较多坏死区域.结论 沉默CaSki细胞中HPV16 E6基因的表达能明显降低宫癌细胞的成瘤作用.     

HPV16E6对不同p53基因型宫颈癌细胞凋亡及化疗敏感性的影响

目的：探讨HPV16E6对不同p53基因型的宫颈癌细胞化疗药物敏感性的影响。方法：应用AO/EB染色结合荧光显微镜技术及Annexine V-FITC/PI双标法流式细胞仪检测不同浓度DDP干预前后宫颈癌细胞凋亡情况;Western印迹检测DDP干预后对HPV16E6和p53mt蛋白表达的影响;通过差异RT-PCR检测不同浓度DDP干预C33A,C33A-E6,C33A-P和CaSki4组细胞24和48h后HPV16E6基因mRNA表达的变化。结果：AO/EB染色和流式细胞术检测的C33A,C33A-E6,C33A-P,CaSki细胞随着DDP干预剂量的增大,凋亡率亦明显增加（P〈0.05）。Western印迹结果示C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6蛋白的表达随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长而逐渐降低甚至难以检测到表达（P〈0.01）,而未干预的对照组C33A-E6和CaSki细胞中HPV16E6的表达量稍有增加。C33A-E6,C33A和C33A-P3组细胞中均检测到p53mt的表达,但随着DDP干预剂量的增大及作用时间的延长,3组细胞总蛋白中p53mt的表达量均无明显改变（P〉0.05）。差异RT-PCR结果表明,在未予DDP干预的情况下,C33A-E6与CaSki细胞在24h时HPV16E6 mRNA的表达量无差异,而在48h时则C33A-E6细胞的HPV16E6 mRNA表达量显著高于CaSki细胞（P〈0.05）,且两组细胞48h的HPV16E6 mRNA表达均较24h显著增高（P〈0.05）;在24和48h两时间段内,随着DDP干预浓度的增加,两组细胞的HPV16E6 mRNA表达量均逐渐减少（P〈0.01）;但在同样浓度的DDP干预时,C33A-E6与CaSki的HPV16E6mRNA表达量无统计学差异（P〉0.05）。结论：HPV16E6基因对宫颈癌细胞株化疗敏感性的影响与p53的基因型（p53mt/p53wt）无明显关系,其可能通过其他作用机制对C33A细胞的凋亡和化疗敏感性产生作用。     

RNA干涉抑制宫颈癌HPV16 E6基因的研究

目的采用RNA干涉（RNAi）技术干扰宫颈癌HPV16 E6基因转录,通过体外和体内实验了解其特异性抑制HPV16 E6基因的效率。方法设计合成针对HPV16 E6的小干扰RNA（siRNA）,借脂质体转染宫颈癌CaSki细胞,通过测定转染后不同时间点的细胞凋亡率、HPV16 E6mRNA及蛋白表达变化了解基因抑制的效率。体内实验中建立子宫颈癌荷瘤裸鼠模型,将E6 siRNA直接注入瘤体,观察肿瘤体积的变化,肿瘤切片HPV16 E6免疫组化染色,观察肿瘤坏死和细胞的凋亡。结果HPV16 E6siRNA转染细胞后24h、48h、5d和9d时凋亡率分别为7．7％、11．8％、37．4％和12．6％。RT-PCR显示转染后24h、48h、5d和9d HPV16 E6 mRNA量减少了77％、83％、59％和41％。Western blot显示转染后的HPV16 E6蛋白表达在24h、48h、5d明显减少,9d时有所恢复;流式细胞仪HPV16 E6蛋白定量测定结果显示,转染后24h、48h、5d和9d蛋白表达抑制率分别为79．7％、80．4％、71．3％和57．4％。体内实验瘤内注射HPV16 E6 siRNA明显抑制肿瘤的生长,HPV16 E6蛋白表达明显受抑,肿瘤组织坏死和细胞凋亡增加,重复给药较单次给药效果更好。结论体内和体外实验均表明RNA干涉HPV16 E6基因的效果具有特异性和高效性。     

表达HPV-16 E6基因siRNA真核载体的构建及体外转染效率鉴定

目的：采用RNA干扰技术选择性的沉默宫颈癌CaSki细胞株中HPV-16E6基因的表达。为观察HPV-16E6基因的小干扰片段能否在CaSki细胞特异性的抑制E6基因的表达,构建能在哺乳动物细胞中表达E6小干扰RNA的真核表达质粒,并观察其转染效率。方法：根据HPV-16E6基因序列,设计特异性的小干扰片段,并将其定向克隆到带有卡那霉素抗性和增强绿色荧光蛋白的真核表达载体pGenesil-1上,将其转染至CaSki细胞中,观察荧光表达,鉴定其转染效率：结果：通过酶切鉴定和序列测定,成功的构建二条表达小干扰RNA的质粒及其阴性对照质粒,并成功的转染到CaSki细胞株中,转染效率达到50％以上：结论：siRNA真核表达载体的构建及体外转染的成功为下一步研究奠定了良好的基础：