脂氧素A4 通过激活PPARγ/Nrf2/HO-1途径保护HK-2细胞缺氧/复氧损伤

目的:探讨脂氧素A4(lipoxin A4,LXA4)在人肾脏近曲小管上皮细胞(HK-2)缺氧/复氧损伤中的保护作用及可能机制?方法:LXA4预处理HK-2细胞后进行缺氧/复氧处理,CCK-8法检测细胞活性水平,ELISA法检测细胞上清液γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)?氨基葡萄糖苷酶(NAG)和亮氨酸氨基肽酶(LAP)水平,羟胺法检测细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性,硫代巴比妥酸法检测细胞丙二醛(MDA)水平,实时定量PCR 和Western blot法分别检测HK-2细胞的过氧化物酶体增殖子活化受体γ(PPARγ)和血红素加氧酶-1(HO-1)的mRNA和蛋白表达的变化,利用RNA干扰技术干扰PPARγ表达后检测HO-1和核因子E2相关因子2(Nrf2)的表达?结果:LXA4预处理的缺氧/复氧组细胞活性和SOD活性明显升高,细胞中γ-GT?NAG?LAP和MDA水平降低,而加入HO-1抑制剂锌原卟啉(ZnPP)和转染PPARγ的siRNA后,LXA4对HK-2细胞缺氧/复氧损伤的保护作用被阻断;此外,LXA4预处理的缺氧/复氧组HO-1?PPARγ和Nrf2表达均明显升高,并且LXA4预处理诱导的HO-1和Nrf2过表达能够被PPARγ siRNA所抑制?结论:LxA4预处理能够通过诱导HK-2细胞的HO-1高表达对抗HK-2细胞缺氧/复氧损伤,其机制与激活PPARγ/Nrf2有关?     

LXA4诱导HO-1高表达对心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

目的:探讨脂氧素A4(lipoxinA4,LXA4)在大鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤中的保护作用及可能机制?方法:将细胞随机分为5组,每组6孔,分别为对照组(con组)?缺氧/复氧组(H/R组)?LXA4预处理的缺氧/复氧组(LXA4 + H/R组)?HO-1抑制剂锌原卟啉(ZnPP)预处理的缺氧/复氧组(ZnPP + H/R组)?LXA4 + ZnPP预处理的缺氧/复氧组(LXA4 + ZnPP + H/R组)?观察细胞形态改变,测定细胞上清液中乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)?肌酸激酶(creatine kinase,CK)水平以反映细胞损伤,并检测心肌细胞HO-1活性和HO-1的mRNA表达水平? 结果:与H/R组比较,LXA4 + H/R组细胞形态较规整,LDH?CK水平较低,而HO-1的活性及mRNA表达水平明显增加;LXA4 + ZnPP + H/R组终止了LXA4对缺氧/复氧细胞的保护作用,细胞形态明显改变,细胞死亡较多,HO-1的活性及mRNA水平受到抑制?结论:LXA4预处理可诱导大鼠心肌细胞HO-1高表达,具有抗心肌细胞缺氧/复氧损伤的保护作用?     

Nrf2/HO-1通路通过调控内质网应激改善小鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用研究

目的：探讨Nrf2/HO-1信号上调对小鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的改善作用及相关机制。方法：小鼠原代心肌细胞分为正常培养处理和缺氧/复氧处理,其中缺氧/复氧处理的心肌细胞分为模型组、Nrf2过表达组、HO-1过表达组、HO-1沉默+Nrf2过表达组。采用MTT法检测细胞活性,TUNEL染色检测细胞凋亡,ELISA法检测细胞培养上清中心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)及肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量,荧光定量PCR检测内质网应激相关分子水平。结果：小鼠心肌细胞缺氧/复氧处理后,心肌细胞活性降低、细胞凋亡增加及细胞培养上清中cTnⅠ和CK-MB含量升高(P<0.05)。Nrf2或HO-1过表达可有效减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞损伤(P<0.05)。给予HO-1基因沉默预处理后,Nrf2过表达产生的细胞保护作用明显减弱(P<0.05)。此外,缺氧/复氧处理后,心肌细胞内GRP78、ATF6、CHOP和Caspase-3的mRNA表达量升高(P<0.05)。Nrf2或HO-1过表达引起GRP78、ATF6、CHOP和Caspase-3表达水平下调(P<0.05),而下调...     

加味丹参饮抑制p38MAPK表达保护缺氧/复氧乳鼠心肌细胞损伤的实验研究

目的 观察加味丹参饮含药血清对缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)乳鼠心肌细胞p38 MAPK蛋白表达的影响, 以探讨其保护心肌的作用机制. 方法 将20只SD乳鼠的心肌细胞进行原代培养, 建立H/R模型并随机分为H/R组、SB203580 (p38MAPK阻断剂组)、加味丹参饮含药血清组,正常心肌细胞组作为对照组. 采用T淋巴细胞化学染色法鉴定心肌细胞,罗丹明B(Rhodamine B)染色法观察细胞形态,MTT 比色法检测含药血清对乳鼠心肌细胞的毒性,Western-blot 法检测MKK3 (促分裂原活化蛋白激酶-激酶3)、MKK6 (促分裂原活化蛋白激酶-激酶6)、p38MAPK、phospho-p38MAPK蛋白表达. 结果 与正常血清对照组比较,H/R组MKK3、MKK6的蛋白表达增多,p38MAPK通路阻断剂SB203580和加味丹参饮均不能减少其表达;p38MAPK、phospho-p38MAPK在H/R 时表达均增加(P<0.01),而SB203580 和加味丹参饮含药血清均能减少其表达(P<0.01). 结论 加味丹参饮含药血清预处理可通过抑制缺氧,复氧心肌细胞p38MAPK信号通路发挥保护作用,抑制p38MAPK表达及其磷酸化,减轻心肌细胞损伤,起到保护心肌细胞的作用.     

异氟烷预处理激活Nrf2-ARE通路保护H9c2心肌细胞缺氧-复氧损伤

目的 研究异氟烷预处理对大鼠胚胎心肌细胞(H9c2)缺氧-复氧损伤及Nrf2-ARE信号通路的影响.方法 用大鼠H9c2细胞低氧模拟缺血性损伤,并将细胞分为空白对照组、缺氧-复氧组、异氟烷预处理组、转染Nrf2 siRNA组、转染非特异性siRNA组(Scramble组)、异氟烷预处理的Scramble组和异氟烷预处理的siRNA组.采用MTT法检测H9c2细胞存活率,TUNEL染色检测细胞凋亡,分别使用硫代巴比妥酸法(TBA)和分光光度法测定MDA和GSH水平,qRT-PCR及Western blot检测Nrf2、HO-1和NQO1基因的表达.结果 与空白对照组比较,缺氧-复氧组细胞活力降低,凋亡细胞数上升,MDA水平升高,GSH水平降低,同时H9c2细胞中Nrf2、HO-1和NQO1的mRNA和蛋白表达降低,差异均具有统计学意义(JP＜0.01).与缺氧-复氧组比较,异氟烷可提高H9c2细胞活力,降低凋亡细胞数,并降低MDA水平,升高GSH水平,上调Nrf2、HO-1和NQO1的表达(P＜0.05).siRNA转染组Nrf2的mRNA和蛋白表达与缺氧-复氧组和Scramble组相比均降低(P＜0.05),2％异氟烷对siRNA转染组Nrf2 mRNA和蛋白表达均无影响(P＞0.05);经2％异氟烷处理的siRNA转染组H9c2细胞存活率与空白对照组、2％异氟烷处理组和2％异氟烷处理的Scramble组相比降低,凋亡细胞数增多,MDA水平升高,GSH水平降低(P＜0.05).结论 异氟烷预处理对H9c2细胞缺氧-复氧损伤具有保护作用,这种保护作用与激活Nrf2-ARE信号通路有关.     

消退素D1通过抑制p38 MAPK活化上调H2O2诱导心肌细胞HO-1表达的实验研究

目的探讨消退素D1(RvD1)对H2O2诱导状态下H9C2心肌细胞血红素氧合酶-1(HO-1)的调节作用及相关的分子机制。方法将大鼠心肌H9C2细胞分为对照组、消退素D1+H2O2组(Resolvin D1+H2O2组)和H2O2组3组,在200μM的H2O2干预6小时后使用RT-PCR法和western blot法对各组H9C2心肌细胞HO-1mRNA和蛋白的表达水平进行检测;并使用western blot法对H9C2心肌细胞p38 MAPK磷酸化水平(Phospho-p38 MAPK/total p38MAPK比值)进行测量。结果与对照组比较,在H2O2干预6小时后H9C2心肌细胞HO-1mRNA和蛋白的表达水平明显降低,而p38 MAPK磷酸化水平均明显升高,差异均有统计学意义(均P<0.05);但H2O2组较Resolvin D1+H2O2组HO-1mRNA和蛋白表达的降低以及p38 MAPK磷酸化水平的增加更加显著,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论本研究结果表明,在过氧化氢诱导的H9C2心肌细胞氧化应激和损伤过程中消退素D1可能是通过抑制P38 MAPK的活化上调了HO-1的表达,对心肌细胞有保护作用。     

脂氧素A4通过p38 MAPK及Nrf2通路调控气道炎症反应

目的：研究脂氧素A4（LXA4）对脂多糖（LPS）诱导的人正常支气管上皮细胞炎症反应的抑制作用及其机制。方法：将对数生长期的BEAS-2B细胞分为3组。对照组：不做任何处理;LPS组：100 ng/mL LPS刺激24 h;LPS+LXA4组：100 nmol/L LXA4预处理30 min,加入100 ng/mL LPS刺激24 h。qPCR法检测IL-6、IL-1β、血红素加氧酶-1（HO-1）、醌氧化还原酶（NQO-1）mRNA表达水平;流式细胞术测定胞内活性氧（ROS）水平;谷胱甘肽（GSH）试剂盒检测GSH水平。为进一步了解LXA4的作用机制,Western blot法检测各处理组p38的磷酸化水平以及Nrf2的核转位及磷酸化水平。结果：与对照组相比,LPS组IL-6、IL-1β mRNA以及胞内ROS表达水平升高（P＜0.05）,HO-1 mRNA水平下降（P＜0.01）,p38磷酸化水平上升（P＜0.01）,胞核中Nrf2相对表达量下降（P＜0.01）,总Nrf2磷酸化水平下降（P＜0.05）。经LXA4干预后,与LPS组相比,除上述改变逆转外（P＜0.05）,NQO-1和GSH水平显著上升（P＜0.05）。结论：LXA4可减轻LPS引起的BEAS-2B细胞炎症反应并促进炎症消退,其机制可能一方面与抑制p38 MAPK通路,减少促炎因子的分泌有关;另一方面与增强Nrf2的核转位以及磷酸化,减轻氧化应激损伤有关。     

丙烯醛对缺氧复氧H9c2心肌细胞损伤的影响及机制初探

目的研究丙烯醛对缺氧复氧H9c2心肌细胞损伤的影响,并探讨其促凋亡作用机理。方法建立H9c2心肌细胞缺氧复氧(H/R)损伤模型,分为正常对照组、丙烯醛组(ACR)、缺氧复氧组(H/R)、丙烯醛+缺氧复氧组(ACR+H/R)。用10μmol/L丙烯醛预处理H9c2心肌细胞30min后2h缺氧16h复氧,采用MTT法检测细胞存活率,4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)荧光染色检测细胞核凋亡的形态学改变,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot检测凋亡相关蛋白cytochrome c(cyt c)、caspase 9和caspase 3的表达水平。结果与H/R组相比,ACR+H/R组H9c2细胞存活率下降、凋亡增加(P<0.05),cyt c的线粒体蛋白表达水平下调、细胞浆蛋白表达水平上调,caspase 9和caspase 3蛋白表达水平下调并出现明显裂解蛋白。结论作为一种来源于人类生活环境的心血管毒物,丙烯醛能加剧缺氧复氧H9c2心肌细胞的损伤,可能与cyt c由线粒体释放到细胞浆、激活caspase级联反应导致线粒体功能损伤有关。     

ERK等激酶途径介导五味子提取物激活Nrf2信号通路的研究

目的考察细胞外信号调节激酶（ERK）、 p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）等不同激酶途径在五味子提取物（FSE）激活核因子相关因子（Nrf2）信号通路中的作用。方法给予不同的蛋白酶抑制剂预处理2 h后再以FSE干扰24 h;采用逆转录—聚合酶链反应（RT－PCR）法检测Nrf2及下游靶基因HO－1、 NQO1、 P－gp、 MRP2 mRNA的表达; Western blotting法检测蛋白水平及Nrf2核转位。结果 RT－PCR结果显示： PD98059、 SB203580、 Rottlerin处理可抑制FSE对HO－1、NQO1、 P－gp、 MRP2 mRNA的诱导作用,但仅SB203580、 Rottlerin处理可抑制FSE对Nrf2 mRNA的表达。 Western blotting结果显示： PD98059、 SB203580、 Rottlerin处理可抑制FSE对HO－1、 P－gp蛋白的诱导作用;各抑制剂处理后均能诱导胞浆中Nrf2蛋白的表达,但PD98059、 SB203580处理可抑制Nrf2核转位。结论 FSE激活Nrf2信号通路机制可能与ERK、p38MAPK直接磷酸化Nrf2,促进Nrf2入核增加其核聚积有关。     

汉黄芩苷对缺氧复氧诱导H9c2心肌细胞损伤及P38和ERK1/2表达的影响

目的 探讨汉黄芩苷（Wog）对缺氧复氧诱导H9c2心肌细胞损伤及P38和ERK1/2表达的影响。方法 培养心肌细胞H9c2构建缺氧复氧模型（A/R）,给予Wog低、中、高剂量（12.5、25、50 μM）处理24h,采用CCK8检测48 h后细胞活力,Hochest染色检测细胞凋亡,ELISA检测细胞上清液中心肌损伤标记物［肌酸激酶（CK）,肌酸激酶同工酶（CK MB）、肌红蛋白（Mb）］和炎性细胞因子［白介素6（IL-6）、白介素1β（IL-1β）和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）］的含量,生化试剂盒检测氧化应激指标［超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）及乳酸脱氢酶（LDH）］的含量,Western blot检测相关蛋白［B淋巴细胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相关x蛋白（Bax）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）、Caspase-9］、丝裂原活化蛋白激酶P38及细胞外调节激酶（ERK1/2）的表达。 结果 低、中、高剂量Wog处理缺氧复氧模型细胞H9c2,细胞存活率、Bcl-2及SOD的表达显著升高,凋亡率、Bax、Caspase-3、Caspase-9、CK、CK-MB、Mb、IL-6、IL-1β、iNOS、MDA、LDH、P38及ERK1/2的表达显著降低（均P＜0.05）。 结论 汉黄芩苷可通过改善炎症反应和氧化应激损伤,减少心肌细胞的凋亡,对缺氧复氧诱导H9c2心肌细胞损伤具有一定的保护作用,可能与下调P38、ERK1/2磷酸化有关。     

心肌营养素-1预处理减轻缺氧复氧对心肌细胞损伤的机制研究

目的观察心肌营养素-1(CT-1)预处理对大鼠心肌细胞缺氧复氧损伤模型细胞损伤、凋亡及血红素加氧酶-1(HO-1)表达的影响,进一步探讨其心肌保护机制。方法选择H9C2大鼠心肌细胞株,实验分为对照组、缺氧复氧组(H2/R24组)、各浓度CT-1预处理组,酶标仪检测细胞上清中LDH释放率,RT-qPCR检测HO-1 mRNA,Western Bolt检测活Cleaved Caspase3及HO-1蛋白。设计合成靶向HO-1的特异性siRNA片段,通过脂质体转染至H9C2细胞中,48 h后给予CT-1预处理及缺氧复氧(si-HO-1组)并重复检查HO-1 mRNA及蛋白的表达、LDH释放率、Cleaved Caspase3表达验证干扰效果。结果与H2/R24组相比,各浓度CT-1预处理组细胞上清LDH释放率下降,Cleaved Caspase3表达减少,而HO-1 mRNA及蛋白表达水平与H2/R24相比均明显增加。经siRNA干扰后,si-HO-1组HO-1表达水平与对照组相当,较H2/R24组、CT-1组则明显减少;而LDH释放率、Cleaved Caspase3蛋白表达较H2/R24组下降,而较CT-1组升高。结论 CT-1能通过上调HO-1表达,减轻心肌细胞缺氧复氧损伤。     

查耳酮衍生物L2H24对H2O2诱导损伤的心肌细胞的保护作用

目的：探讨查耳酮衍生物L2H24 对H2O2 诱导氧化损伤的心肌细胞的抗氧化保护作用及其相关分子机制。方法：MTT法检测大鼠心肌细胞H9c2 活性;集落克隆实验检测细胞增殖能力;倒置显微镜下观察细胞焦亡形态学变化;硫代巴比妥酸显色反应检测细胞中脂质过氧化MDA水平;Western blot法检测HO-1、核/浆Nrf2、Caspase-1 p48、Caspase-1 p20、IL-1β的表达水平。结果：L2H24能上调H2O2氧化损伤的H9c2细胞的存活率（P ＜0.05）,促进其细胞集落形成,降低其MDA水平（P ＜0.05）,减少细胞中Caspase-1 p48、Caspase-1 p20、IL-1β的表达水平（P ＜0.05）,改善细胞焦亡现象;能促进细胞中Nrf2易位入核,并上调其下游抗氧化蛋白HO-1的表达水平（P ＜0.05）,对H2O2诱导氧化损伤的心肌细胞起到保护作用。结论：查耳酮衍生物L2H24具有抗氧化损伤作用,其机制可能与激活Nrf2/HO-1信号通路有关。     

七氟烷预处理对缺氧/复氧损伤的心肌细胞H9c2 LC3蛋白表达的影响

目的观察七氟烷预处理对缺氧/复氧（H/R）损伤的H9c2大鼠心肌细胞自噬相关蛋白LC3表达的影响,探讨自噬在七氟烷预处理延迟性保护中的作用。方法 H9c2心肌细胞随机分为5组：空白对照组（CON）;缺氧/复氧组H/R（缺氧2 h,复氧1 h）;七氟烷预处理组（SEVO）予2.5%七氟烷预处理1 h,24 h后进行H/R;3-MA＋SEVO组,七氟烷预处理前15 min在培养液内加入3-MA（10 mmol/L）,24 h后进行H/R;3-MA组,即在培养液内加入3-MA（10 mmol/L）,25 h后进行H/R。取复氧后心肌细胞,MTT法检测各组H9c2心肌细胞存活率,Western blot法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ的表达。结果与CON组相比H/R组和SEVO组细胞存活率均降低（均P〈0.05）;与H/R组相比SEVO组、3-MA组和3-MA＋SEVO组细胞存活率均增高（均P〈0.05）。Western blot结果显示,与CON组相比SEVO组、H/R组自噬蛋白LC3-Ⅱ表达均上调（均P〈0.05）,与H/R组相比SEVO组LC3-Ⅱ蛋白表达均下调（均P〈0.05）,而3-MA组和3-MA＋SEVO组表达均显著下调（均P〈0.01）。结论七氟烷预处理对H/R损伤H9c2心肌细胞具有延迟性保护作用,自噬可能参与了七氟烷预处理的延迟性保护机制。     

低氧降低大鼠肺动脉平滑肌细胞Kv1.5通道表达的p38MAPK通路机制

目的 探讨低氧对肺细小动脉平滑肌细胞Kv1.5通道表达的影响及其与p38 MAPK通路的关系,明确低氧性肺动脉高压（HPH）的发病机制.方法 SPF级雄性SD大鼠,超净工作台内分离3～4级肺动脉平滑肌细胞（PASMCs）.采用p38MAPK通路抑制剂SB203580和激活剂茴香霉素干预低氧过程.细胞传至3～6代后随机分为5组：正常对照组（N）,低氧组（H）,低氧＋ DMSO组（HD）,低氧＋SB203580组（HS）,低氧＋茴香霉素组（HA）,其中N组继续5％ CO2培养箱培养.其他组于低氧培养箱培养（5％ CO2,2％O2,PO2：25 ～ 35mmHg）,均培养60h.采用RT-PCR法测定PASMCs Kv1.5 mRNA含量,采用Western blot法测定PASMCs Kv1.5蛋白含量.结果 与N组相比,H组、HD组、HA组Kv1.5mRNA和蛋白表达均明显降低（P＜0.05）.较之H组和HD组,HS组Kv1.5 mRNA和蛋白表达明显上升,差异有统计学意义（P＜0.01）,H组和HD组间差异无统计学意义（P＞0.05）,与HS组相比,HA组Kv1.5mRNA和蛋白表达明显降低（P＜0.01）.结论 低氧通过激活p38 MAPK信号通路降低Kv1.5通道表达,这可能是（HPH）的发病机制.     

p38丝裂素活化蛋白激酶信号传导通路对低氧预处理后心脏成纤维细胞血红素氧化酶-1基因表达的影响

目的:探讨p38丝裂素活化蛋白激酶(MAPK)信号传导对低氧预处理(HPC)的细胞保护作用以及HPC后血红素氧化酶-1(HO-1)mRNA表达的影响。方法:选用新生Wistar大鼠心脏进行成纤维细胞培养,给予HPC及低氧/复氧处理(HR)。药物处理组在HPC和HR处理过程中向培养液中加入SB203580。测定细胞培养上清液中乳酸脱氢酶(LDH)浓度和细胞HO-1 mRNA表达量。结果:低氧/复氧后,HPC/SB组LDH浓度显著高于HPC/NSB组(P<0.05)。HR组低氧/复氧后各亚组LDH浓度均显著升高(P<0.01,P<0.01);低氧/复氧处理前HPC组中NSB亚组于低氧预处理后HO-1 mRNA表达显著上升(P<0.001),低氧/复氧处理后其表达有所下降;SB亚组其表达也显著上升(P<0.01)。HR组中各亚组于低氧/复氧处理后HO-1 mRNA表达也显著上升(P<0.01)。结论:对培养的心脏成纤维细胞给予低氧预处理能够减轻其后低氧/复氧对细胞的损伤,低氧预处理较低氧/复氧处理更能够显著诱导心脏成纤维细胞HO-1 mRNA的表达。