GST pulldown技术检测HEK293T细胞Daam1的活性

目的:运用GST pulldown技术建立真核细胞中Daam1活性检测的可靠方法?方法:构建GST-RhoA的原核表达载体,并使其在大肠杆菌BL21菌株中大量表达?用GST pulldown和Western blot技术分别检测HEK293T细胞中活化的Daam1及Daam1蛋白的表达?结果:在成功构建了GST-RhoA的原核表达载体,并使其在原核细胞中大量表达融合蛋白GST-RhoA后,用GST pulldown和Western blot技术证实HEK293T细胞中有活化的Daam1和Daam1总蛋白的表达?结论:本工作所建立的GST pulldown技术可以检测HEK293T细胞中Daam1的活性,从而为进一步深入研究Daam1在真核细胞中的功能提供了技术保障?     

小鼠Gtf2h2基因的克隆及其在真核细胞中的表达

目的:克隆小鼠Gtf2h2基因并使其在真核细胞HEK293中稳定表达?方法:采用小鼠卵母细胞cDNA为模板,经PCR扩增Gtf2h2后,利用新型In-Fusion分子克隆体系将该目的片段克隆至真核表达载体pCMV6-AC-3DDK和pCMV6-AN-mKate中?所得阳性克隆的质粒DNA在经限制性酶切电泳和测序鉴定克隆成功后,转染到HEK293细胞中进行表达?表达效果利用抗DDK和mKate标签的抗体通过免疫荧光以Western blot 的方法进行检测?结果:质粒DNA测序和酶切鉴定证明Gtf2h2基因克隆成功;Western blot 检测到GTF2H2-3DDK和GTF2H2-mKate融合蛋白在转染后的HEK293细胞内的表达;免疫荧光显示融合蛋白在转染后的HEK293细胞核内定位并呈颗粒状分布?结论:成功克隆了小鼠Gtf2h2基因并实现了其在真核细胞HEK293中的稳定表达,为进一步研究其功能和作用机制奠定了基础?     

NF2基因突变体真核表达载体的构建和表达

目的构建NF2突变体真核表达载体,并观察其在人胚肾细胞HEK293中的表达。方法采用分子生物学方法构建NF2突变体,将突变体克隆入真核表达载体pEGFP—N1中,进行筛选和鉴定,然后在脂质体介导下,将重组载体转染至真核细胞HEK293中,应用Western blot法检测蛋白的表达。结果通过使用重叠延伸PCR法定位突变,从野生型NF2基因cDNA模板中扩增得到预期大小的NF2突变体条带,DNA测序证实NF2突变体序列的正确性。重组载体转染HEK293后能产生merlin蛋白。结论本研究成功构建重组载体pEGFP—N1-NF2突变体,其转染HEK293后,能有效表达于HEK293中。     

Sedlin蛋白稳定表达细胞株的建立

目的建立稳定表达Sedlin蛋白的细胞株,研究Sed-lin蛋白在细胞内的分布。方法扩增SEDL基因全长编码序列,经双酶切后克隆至真核表达载体pCDGFP中,将重组表达质粒转染至HEK293细胞,用G418筛选阳性克隆,荧光显微镜和Western blot检测Sedlin蛋白的表达,并观察Sedlin蛋白在HEK293细胞中的分布。结果经测序鉴定,成功构建了SEDL基因的真核表达载体,转染HEK293细胞后,Western blot检测,证明SEDL基因能够稳定有效的表达,荧光观察显示,Sedlin蛋白在细胞核和细胞质中都有表达。结论成功建立了稳定表达Sedlin蛋白的细胞株,Sedlin蛋白广泛分布于整个细胞中。     

hLMO1编码基因重组质粒的构建及蛋白的表达和定位

目的 构建hLMO1真核表达载体并证实融合蛋白在细胞内的表达及定位.方法 以人胎脑文库cDNA为模板,PCR扩增hLMO1基因cDNA全长,亚克隆至pEGFP表达载体中.将构建的重组质粒进行酶切测序鉴定,并转染到人上皮细胞---HEK293细胞中,提取细胞蛋白进行Western blot检测.利用激光扫描共聚焦显微镜观察pEGFP-hLMO1在HEK293细胞内的定位.结果 hLMO1基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP中,酶切鉴定片段为471 bp.Western blot检测到了融合蛋白表达,分子量约为45 kDa.pEGFR-LMO1在人HEK293细胞核与细胞质均有表达.结论 成功构建了hLMO1基因cDNA全长的真核表达载体,pEGFP-LMO1蛋白定位于HEK293细胞的细胞质和细胞核内.     

稳定表达GlyRα1的HEK293细胞系的建立

目的:建立稳定表达甘氨酸受体α1亚基(GlyRα1)真核表达载体的人胚肾细胞(HEK293)细胞系.方法:构建pcDNA3.1-GlyRα1真核表达载体,应用脂质体介导的转染技术将该质粒导入HEK293细胞,再用G418筛选表达稳定的细胞系.真核细胞中GlyRα1的表达分别用RT-PCR与Western blot方法检测.结果:在7株转染并经G418反复筛选的HEK293细胞系中,有4株细胞系明显表达GlyRα1的mRNA及其蛋白质,其余3株细胞表达较弱或者没有表达.结论:用pcDNA3.1-GlyRα1转染的HEK293细胞经G418筛选,可成功建立GlyRα1稳定表达系.     

人Prohibitin 2哺乳动物细胞株的转染表达与定位的初步研究

目的 构建带FLAG标签的人类野生phb2 (prohibitin 2)表达载体,将其转染至HEK 293T细胞检测其表达,转染至COS7细胞观察phb2蛋白在细胞内的定位.方法 以含有人phb2全长cDNA序列的质粒为模板,通过带有FLAG标签上游引物,用PCR方法扩增phb2全长序列,然后插入真核表达载体pCDNA3中构建pCDNA3-FLAG-phb2表达载体,将构建的质粒转染至HEK 293T细胞,提取总蛋白,进行Western blot检测;转染至COS7细胞,在荧光显微镜下观察其细胞定位.结果 成功构建了pCDNA3-FLAG-phb2表达载体,转染表明此表达载体在HEK 293T细胞中能够有效表达,在COS7细胞中phb2呈斑点状主要在胞质内分布,细胞核中未见到明显的表达.结论 实验结果为进一步了解phb2的功能提供了一定的基础.     

人β-防御素4基因在HEK293细胞中的转染表达

目的人β-防御素4(humanβ-defensin 4,HBD 4)对多种病原菌有杀伤作用。HBD4的自然表达水平极低,体外获得难度较大且价格昂贵。利用基因工程技术生产重组的HBD4成为研究的焦点。文中旨在构建HBD4真核表达载体,探讨真核细胞表达HBD4的可行性。方法用PCR法从已构建的重组克隆载体pMD18-T/HBD4中扩增出HBD4全长编码基因,克隆入真核表达载体pEGFP-N2,构建pEGFP-N2/HBD4重组真核表达载体;通过脂质体转染法将pEGFP-N2/HBD4导入HEK293细胞,采用RT-PCR、荧光显微镜、Western blot检测HBD4的mRNA和蛋白表达情况,并对表达的HBD4进行抗菌活性的初步研究。结果构建的重组真核表达载体pEGFP-N2/HBD4,经酶切鉴定、测序,证实插入的序列与Genebank中的HBD4基因序列完全相同。将pEGFP-N2/HBD4转染HEK293细胞,在转染细胞检测到HBD4mRNA表达。荧光显微镜下可在细胞膜及细胞质中观察到绿色荧光。Western blot分析显示:在pEGFP-N2/HBD4转染的HEK293细胞及细胞培养液中检测到了HBD4蛋白的表达。Kirby—Bauer纸片扩散法证实表达的HBD4蛋白对铜绿假单胞菌具有较强的杀伤作用。结论成功构建了HBD4基因的真核表达载体,并在HEK293细胞中表达出具有抗菌活性的HBD4多肽。     

稳定表达人血红素加氧酶-1细胞系的建立及其功能鉴定

目的 构建稳定表达人血红素加氧酶-1(HO-1)的细胞系,探讨内源性过表达HO-1对抗细胞氧化损伤的作用。方法 PCR扩增HO-1基因并将其克隆至改造的慢病毒载体pLentiLox3.7中,构建携带目的基因的重组质粒。用重组质粒转染HEK293T细胞,并用Western blot检测HO-1的表达。将重组质粒与慢病毒辅助质粒(plp1、plp2、VSVG)共同转染HEK293T细胞,包装有活力的慢病毒。用携带HO-1的慢病毒感染HEK293T细胞,筛选出能稳定表达目的基因的单克隆,并行Western blot检测HO-1的表达。将过氧化氢加入正常的及过表达HO-1的HEK293T细胞和人脐静脉内皮细胞,检测细胞内活性氧的含量。结果 成功筛选出能稳定表达HO-1的单克隆细胞系并扩大培养,Western blot检测其HO-1的表达明显升高。加入过氧化氢后,过表达HO-1的HEK293T细胞和人脐静脉内皮细胞内的活性氧明显减少。结论 成功构建了能稳定表达人HO-1的细胞系,内源性过表达HO-1能够对抗细胞的氧化损伤。     

GST-hPBD融合蛋白的克隆、表达及活化Rac1蛋白的分析

目的:制备GST-hPBD融合蛋白,探讨活化的Rac1在血管内皮细胞中的表达. 方法:采用RT-PCR方法克隆与活化Rac1相结合的hPBD基因片段,构建pGEX-2T/hPBD原核表达载体,并纯化GST-hPBD融合蛋白;应用pull down测定血管内皮细胞中活化Rac1的蛋白表达. 结果:基因测序证实原核表达载体pGEX-2T/hPBD序列正确,并在大肠杆菌中高效表达,纯化得到纯度约75% GST-hPBD融合蛋白,其Mr为36 000;进一步分析证实血管内皮细胞可表达活化的Rac1蛋白. 结论:成功构建了人pGEX-2T/hPBD原核表达载体,纯化了GST-hPBD融合蛋白,并检测到血管内皮细胞中活化Rac1蛋白的表达.     

GST-p43/AIMP1融合蛋白表达和纯化以及与NF-L的相互作用

目的 构建人p43/AIMP1蛋白与谷胱甘肽转移酶(GST)重组的融合蛋白原核表达载体并进行表达纯化,通过GST-pull down方法验证其与神经中间丝轻链(NF-L)的体外直接相互作用.方法 以重组质粒pcDNA3.1-p43为模板,扩增p43/AIMP1基因,产物经纯化回收后与原核表达载体pGEX4T-1连接构建成新载体GST-p43/AIMP1,经鉴定完全正确后转化大肠埃希菌B.21(DE3),通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,并纯化获得目的蛋白;将myc-NF-L体外转染HEK293T细胞,利用GST pull-down原理和方法验证人p43蛋白与神经中间丝轻链蛋白NF-L之间的相互作用.结果 酶切鉴定和测序结果显示,成功构建了GST-p43/AIMPI融合蛋白原核表达载体;考马斯亮蓝染色和Western blotting结果显示,成功获得有生物活性的GST-p43/AIMPI融合蛋白;GST pull-down实验结果证实,p43/AIMP1与NF-L存在直接相互作用.结论 获得有生物活性的GST-p43/AIMP1蛋白,并成功应用GST pull-down方法证实p43/AIMP1与NF-L在体外存在直接的相互作用.     

人DC-STAMP真核表达载体的构建及鉴定

目的构建和鉴定人DC-STAMP基因的真核表达载体,并分析在293T细胞中的表达情况。方法通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术从人破骨细胞体外扩增DC-STAMP的cDNA片段,连接入真核表达载体pEGFP-N1-FLAG后转入293T细胞中,Western blot进行表达鉴定。结果成功扩增出人DC-STAMP全长,构建了重组质粒pEGFP-DC-STAMP-FLAG,并在其转染的293T细胞检测到融合蛋白的表达。结论成功构建了DC-STAMP融合基因表达载体pEGFP-DC-STAMP-FLAG。     

分泌性HIV-1 Nef-EGFP融合蛋白表达载体的构建与鉴定

目的： 构建含有人类免疫缺陷病毒I型（human immunodeficiency virus type I,HIV-1）负性调节因子（negative regulation factor,Nef）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的重组融合蛋白分泌性表达载体,并检测该融合蛋白在真核细胞中的表达及其在培养上清中分泌情况,为进一步研究Nef功能奠定基础。方法： 利用PCR扩增出HIV-1 Nef和EGFP基因,插入到分泌性表达载体pSecTag2B中。构建的pSecTag2B-Nef-EGFP融合蛋白表达质粒,转染293T细胞,荧光显微镜下观测细胞中Nef-EGFP融合蛋白的表达。收集细胞及上清液,蛋白质印迹和ELISA法分别检测Nef-EGFP融合蛋白的表达及其分泌。结果： 限制性内切酶酶切鉴定和核酸序列测定证实,成功构建了含有Nef-EGFP基因的分泌性表达载体,该质粒转染293T细胞后,蛋白质印迹法能够检测到Nef EGFP融合蛋白的表达条带,ELISA法检测上清液中目的蛋白分泌量为1.7 ng/ml。结论： 成功构建含有Nef-EGFP的融合蛋白表达质粒,融合蛋白Nef EGFP在293T细胞中获得表达,并能分泌到胞外。     

Nogo-66受体LRR功能区的真核分泌表达

目的: 构建含有人Nogo-66受体LRR功能区段cDNA序列的真核分泌型表达载体,并在COS-7细胞中表达. 方法: 采用定向克隆的策略,在保证阅读框正确的前提下,从原核表达载体pES-His/LRR上切下编码LRR的DNA片段,亚克隆入真核分泌型表达载体pSectag2B中,构建LRR与c-Myc表位、6His标签基因相融合的真核表达质粒pSectag2B/LRR,在Lipofectamine 2000介导下瞬时转染COS-7细胞. 结果: 利用针对c-Myc表位和6His标签的抗体分别作免疫荧光和Westernblot,证实胞内表达正确融合的目的蛋白;同时双抗体夹心ELISA也检测到转染细胞上清中存在融合蛋白. 结论: 真核表达质粒构建成功,转染后目的蛋白在COS-7细胞中实现分泌表达.     

小鼠FGFR1/MIP3a-Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的 构建小鼠成纤维细胞生长因子受体1/巨噬细胞炎性蛋白3a-Fc融合基因(FGFR1/MIP3a-Fc)的真核表达质粒,并在293T细胞中的表达。方法 设计合成FGFR1/MIP3a融合基因引物,用PCR方法扩增获得FGFR1/MIP3a基因片段,用内切酶消化后插入pc DNA3.1(+)/Fc(Mouse Ig G2a)质粒中,构建FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒;经PCR鉴定、酶切鉴定以及测序鉴定后,将该融合基因表达质粒瞬时转染293T细胞,用ELISA法检测其在293T细胞的表达。结果 经PCR、酶切鉴定以及测序证实,FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒构建成功;ELISA检测FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒能够在293T细胞中表达。结论 FGFR1/MIP3a-Fc融合基因表达质粒构建成功,该质粒能够在293T细胞中表达。     

SIRPα-GFP真核表达载体构建及其在HEK293T细胞中的表达

目的：构建信号调节蛋白α-绿色荧光蛋白（SIRPα-GFP）真核表达载体,转染HEK293T细胞获得稳定表达SIRPα-GFP融合蛋白的细胞系,研究SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞的膜定位。方法：将SIRPα质粒和带有GFP的表达载体分别用限制性内切酶MluⅠ和SgfⅠ进行双酶切,将SIRPα基因克隆到pLenti-GFP载体中,构建pLenti-SIRPα-GFP质粒;将pLenti-SIRPα-GFP质粒转化DH5α大肠杆菌感受态细胞,对重组质粒pLenti-SIRPα-GFP进行DNA测序;采用Lipofectamine 3000转染试剂将pLenti-SIRPα-GFP质粒转染到HEK293T细胞中,通过荧光显微镜观察SIRPα-GFP在稳定转染HEK293T细胞中的表达,采用Western blotting法检测HEK293T细胞中SIRPα-GFP融合蛋白的表达。结果：酶切鉴定和DNA测序,重组质粒pLenti-SIRPα-GFP构建成功。荧光显微镜检测,SIRPα-GFP融合蛋白在HEK293T细胞膜上表达。Western blotting法检测,SIRPα蛋白在pLenti-SIRPα-GFP质粒转染的HEK293T细胞中成功表达。结论：成功构建了pLenti-SIRPα-GFP质粒。通过在HEK293T细胞中转染pLenti-SIRPα-GFP质粒,成功制备了稳定表达SIRPα-GFP的细胞系。SIRPα-GFP蛋白定位于HEK293T细胞的细胞膜上。     

肿瘤相关抗原RCAS1重组质粒的构建与GST-RCAS1融合蛋白的表达和纯化及鉴定

目的：构建RCAS1的重组质粒、表达GST—RCAS1融合蛋白并进行纯化和生物学活性鉴定。方法：从MCF-7细胞提取总RNA，通过RT—PCR得到RCAS1的扩增产物，纯化后用EcoRⅠ和BarnHⅠ双酶切。选择pGEX-2T作为载体，用EcoRⅠ和BarnHⅠ双酶切后与上述酶切后DNA连接，转化感受态JM109大肠杆菌，挑单个菌落提取质粒进行双酶切和测序鉴定。选择测序正确的质粒重新转化BL21大肠杆菌，用终浓度0．1mmol／L的IPTG诱导表达GST—RCAS1蛋白，用GST亲和层析纯化并通过SDS—PAGE电泳和Western印迹试验证实。利用特异性抗RCAS1多抗（N-18和C-20）鉴定所表达的融合蛋白，通过流式细胞仪检测GST—RCAS1融合蛋白诱导活化T细胞凋亡的作用。结果：通过RT—PCR得到大小为642bp的产物，重组质粒通过双酶切和测序鉴定正确。通过IPTG诱导在BL21大肠杆菌中表达并纯化得到GST—RCAS1蛋白，通过SDS—PAGE电泳鉴定分子量为52kMr，与预测一致，并由Western印迹试验证明为GST融合蛋白。该融合蛋白能被特异性抗RCAS1（N-18和C-20）多抗识别。GST—RCAS1对诱导活化的T细胞凋亡有一定的作用。结论：成功构建RCAS1的重组质粒，并表达GST—RCAS1融合蛋白，对其生物学活性作了初步研究。     

DDR2/Fc融合基因真核表达载体的构建及表达

目的:构建DDR2/Fc真核表达载体,使其在HEK293细胞中进行表达. 方法:采用PCR技术,分别从大鼠脑组织、含人IgG1 Fc全长互补DNA(cDNA)的质粒中扩增出盘状结构域受体2(DDR2)的DS区域、Fc段,以定向克隆的方法将其串联至真核表达载体pcDNA3.1(-)中,获得重组表达载体DDR2/Fc-pcDNA3.1(-);采用脂质体转染技术转染HEK293细胞; RT-PCR、免疫印迹检测融和蛋白的表达. 结果:DNA测序和限制型酶切鉴定证明两段基因正确克隆至pcDNA3.1(-)的多克隆位点,细胞裂解物中检测到融合蛋白的表达,其分子质量与预期大小一致,该融合蛋白能正确表达于HEK293细胞中. 结论:成功构建了DDR2/Fc融和表达载体,表达了融合蛋白.