大鼠XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及IRF-1结合位点的鉴定

目的:构建大鼠X染色体连锁的凋亡抑制蛋白相关因子1(X-linked inhibitor of apoptosis associated factor 1,XAF1)基因启动子(全长和截断)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞HEK293中过表达干扰素调节因子-1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)对XAF1基因启动活性的影响,同时,筛选其可能的IRF-1结合位点?方法:采用PCR技术,扩增出大鼠XAF1基因启动子序列(-1497 ~ +166 nt),将XAF1基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中获得pGL3-XAF1-QC,与大鼠野生型IRF-1表达质粒(pcDNA3.1-IRF-1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定IRF-1对XAF1基因的启动作用?同时,应用生物信息学软件预测XAF1基因启动子上IRF-1潜在的结合位点,并构建截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒(pGL3-XAF1-1?pGL3-XAF1-2?pGL3-XAF1-3和pGL3-XAF1-4)?将上述全长和各截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒和IRF-1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选IRF-1的结合位点?结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功?将pGL3-XAF1-QC和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞发现,XAF1基因启动子活性显著增加?而将pGL3-XAF1-QC?pGL3-XAF1(1~4号)和pcDNA3.1-IRF-1共转染HEK293细胞后证实,pGL3-XAF1-3的启动活性显著低于pGL3-XAF1-1和pGL3-XAF1-2?提示IRF-1可能结合在大鼠XAF1基因启动子的-337 ~ -47 nt区域?结论:本实验成功构建了大鼠全长及截断的XAF1基因启动子荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-1在XAF1基因启动子上的结合区域,为后续研究奠定了基础?     

大鼠MIP⁃1α基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其IRF⁃8结合元件的初步鉴定

目的：构建大鼠巨噬细胞炎性蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α,MIP-1α)基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察在人胚肾细胞(HEK-293T)中过表达干扰素调节因子-8(interferon regulatory factor-8,IRF-8)对MIP-1α基因启动活性的影响,同时,筛选其可能的IRF-8结合元件。方法：采用PCR技术,扩增出大鼠MIP-1α基因启动子序列,将MIP-1α基因启动子插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,构建MIP-1α基因启动子全长荧光素酶报告质粒(pGL3-MIP-1α-FL)。将上述pGL3-MIP-1α-FL和本课题组已构建的大鼠IRF-8过表达质粒(pIRES2-IRF-8)共转染HEK-293T细胞,检测细胞内荧光素酶活性,确定IRF-8对MIP-1α基因的启动作用。同时,应用生物信息学软件预测MIP-1α基因启动子上IRF-8的结合元件,并据此构建3个MIP-1α基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(pGL3-MIP-1α-1~3)。将上述MIP-1α基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和IRF-8过表达质粒共转染HEK-293T细胞,再测定荧光素酶活性,初步确定IRF-8的结合元件。结果：菌液PCR及核酸测序证实,上述pGL3-MIP-1α-FL(-1400 ~ +94nt)质粒构建成功。将pGL3-MIP-1α-FL和pIRES2-IRF-8共转染HEK-293T后发现,过表达IRF-8可显著增加MIP-1α基因启动子活性。应用生物信息学软件预测发现MIP-1α基因启动子上IRF-8的结合元件(-1157~ -1144nt、-740~ -734nt、-683~ -670nt、-365 ~ -359nt、-249 ~ -236nt),并据此构建3个MIP-1α基因启动子截短的荧光素酶报告质粒,即pGL3-MIP-1α-1(-453 ~ +94nt)、pGL3-MIP-1α-2(-352 ~ +94nt)和pGL3-MIP-1α-3(-3 ~ +94nt)。将pGL3-MIP-1α-FL、pGL3-MIP-1α-1~3和pIRES2-IRF-8共转染HEK-293T后发现,pGL3-MIP-1α-3的启动活性显著低于pGL3-MIP-1α-FL、pGL3-MIP-1α-1和pGL3-MIP-1α-2。提示,IRF-8可能结合在大鼠MIP-1α基因启动子的-352 ~ -3nt区域的IRF-8结合元件(-249 ~ -236nt)上。结论：本实验成功构建了大鼠MIP-1α基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,并初步筛查出IRF-8在MIP-1α基因启动子上的可能的结合元件,为后续研究奠定了基础。     

大鼠IL-6基因启动子荧光素酶报告质粒的构建及其与C/EBP β结合位点的鉴定

目的:构建大鼠IL-6基因启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒并予鉴定,观察人胚肾细胞(HEK293)中过表达CCAAT/增强子结合蛋白 β(CCAAT/enhancer binding protein β,C/EBP β)对该质粒基因启动子活性的影响?同时,筛选C/EBP β与IL-6基因启动子区的结合位点?方法:采用PCR技术,扩增出大鼠IL-6基因启动子全长序列(-1 791~ +30 nt),将IL-6基因启动子插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中?将IL-6基因启动子全长荧光素酶报告质粒(pGL3-IL-6-1)和大鼠野生型C/EBP β表达质粒(pIRES2-EGFP-C/EBP β)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,确定C/EBP β对IL-6基因的启动作用?另用生物信息学软件预测IL-6基因启动子上C/EBP β潜在的结合位点,并构建IL-6基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即pGL3-IL-6-2~5)?将上述IL-6基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒和C/EBP β过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,筛选出C/EBP β的结合位点?结果:菌液PCR及核酸测序证实,上述荧光素酶报告质粒均构建成功?将pGL3-IL-6-1和pIRES2-EGFP-C/EBP β共转染HEK293细胞发现,IL-6基因启动子活性显著增加?另将pGL3-IL-6-1?pGL3-IL-6-2~5和pIRES2-EGFP-C/EBP β共转染HEK293细胞后发现,pGL3-IL-6-5的启动活性显著低于其他组?提示C/EBP β可能结合在IL-6基因启动子的-618 bp~ -126 bp区域?结论:成功构建了大鼠IL-6基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,并初步筛查出了C/EBP β在IL-6基因启动子上的结合部位?     

含mdr1启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建

目的克隆编码mdr1基因的启动子并插入荧光素酶报告基因载体.方法用PCR技术扩增出人类mdr1基因启动子片段,通过亚克隆将启动子分别插入到pGEM-T载体和荧光素酶报告基因pGL3-enhancer载体中,并确定扩增DNA的序列.结果测序结果显示扩增mdr1启动子序列正确.结论成功克隆了mdr1启动子,为下一步对多耐药性卵巢癌进行靶向基因治疗提供了重要基础.     

大鼠野生型IRF-1基因和IRF-1 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建大鼠野生型干扰素调节因子1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)基因及其特异性短发夹状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察IRF-1在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达及沉默IRF-1基因的情况。方法:用DNA重组技术将针对大鼠IRF-1基因的CDS区序列和针对其不同位点所设计的3种shRNA序列分别克隆到pcDNA3.1及pGCsi.U6.neo.GFP真核表达质粒中。在酶切鉴定及序列测定正确后,用GenEscortTMⅢ转染试剂将上述两种质粒分别转染入培养的大鼠GMC中,然后用Western blot检查IRF-1融合蛋白的表达,同时筛选最佳沉默效率的shRNA。结果:限制性酶切及核酸序列分析证明,两种重组质粒均构建成功。Western blot证实构建的pcDNA3.1/IRF-1质粒在大鼠GMC中能正确表达,且IRF-1shRNA-2具有最佳沉默效率。结论:本实验成功构建了大鼠野生型IRF-1及其特异性的shRNA真核表达质粒,为进一步研究IRF-1基因的生物学功能提供了必要的实验材料。     

人SMYD3基因启动子荧光素酶报告载体的构建与分析

目的:克隆5′长度不同的SMYD3基因启动子序列并进行活性鉴定。方法:采用PCR方法克隆出SMYD3基因转录起始位点上游不同长度的基因片段,构建T载体并利用酶切与测序进行鉴定;将该基因亚克隆至pGL3-Basic荧光报告基因载体上;瞬时转染Hep3B细胞后用双荧光报告检测系统检测不同片段的荧光活性。结果:T载体酶切与测序结果正确,成功构建了pGL3-Basic+370～1400bp荧光报告载体并利用双荧光素酶报告基因检测系统分析了重组质粒的荧光活性。结论:pGL3-Basic+370～1400bp重组质粒转染组与阳性对照组相比并未表现出显著的荧光活性,本研究认为SMYD3基因的启动子核心区域位于-1334bp的上游。     

人源DNMT1基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及其活性检测

目的:利用PCR扩增人源DNA甲基转移酶1(DNMT1)基因启动子,构建其荧光素酶报告基因载体并对其活性进行检测。方法:运用PCR技术以人非小细胞肺癌细胞A549基因组DNA为模版扩增出目的片段,将PCR产物用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic上,然后进行转化、菌落PCR及测序验证等。将构建成功的pGL3-proDNMT1-luc重组质粒和内参质粒pRL-CMV-luc共转入H1299细胞中检测DNMT1启动子活性。结果:成功扩增出长度为1634 bp的目的片段,并成功构建出DNMT1启动子荧光素酶报告基因载体,启动子具有活性。结论:DNMT1启动子的成功克隆为进一步研究其分子调控机制和生物学意义奠定了基础。     

含人SOD_2基因启动子的荧光素酶报告基因质粒的构建和鉴定

目的:从人基因组中克隆SOD2基因的启动子并插入到荧光素酶报告基因载体中并进行基因测序鉴定。方法:以人基因组DNA为模板,用PCR的方法扩增出人SOD2基因启动子片段后,将其插入到pGL3-basic载体的荧光素酶报告基因上游,将构建的重组质粒通过双酶切片段的凝胶电泳分析和DNA测序以确定插入位置和序列的正确性。结果:双酶切反应和测序结果显示SOD2基因启动子插入的位置和序列是正确的。结论:成功克隆了SOD2基因启动子,为后续SOD2转录调控机制的研究提供重要的实验基础。     

抑癌基因BRCA1启动子荧光素酶报告基因的构建及活性测定

目的:克隆人BRCA1基因的启动子,构建荧光素酶报告基因载体,并在细胞内检其活性,为其后续基因凋控研究提供依据。方法:采用PCR技术,从人正常宫颈组织细胞中扩增出BRCA1启动子,插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,测序所扩增的DNA序列,将其转染入HCT 116细胞中并检测其活性。结果:酶切及基因测序方法证实所构建质粒含有pGL3-basic全序列及BRCA1启动子上游调控序列,扩增的BRCA1启动子序列正确;双报告基因实验检测荧光素酶活力表明,p53缺失的HCT116细胞中BRCA1启动子明显增加（P<0.05）,构建的报告基因具有启动子活性。结论:克隆BRCA1启动子及成功构建人BRCA1启动子报告基因,可实现快速、经济和准确地克隆已知基因启动子分子和构建启动子载体的目的。     

转录因子MZF1对大鼠RGC32基因启动活性的影响及可能的结合部位

目的 :构建大鼠补体应答基因32(response gene to complement,RGC32)启动子(全长和截短)荧光素酶报告质粒,并观察人胚肾细胞(HEK293)过表达髓锌指基因1(myeloid zinc finger gene1,MZF1)对大鼠RGC32基因启动活性的影响。同时,筛选其可能的MZF1结合位点。方法:将RGC32基因启动子全长(-686~-1 nt)插入到荧光素酶报告基因载体p GL3-basic中,获得RGC32基因启动子全长荧光素酶报告质粒(p GL3-RGC32-FL)后,再将p GL3-RGC32-FL与本课题组前期构建的大鼠野生型MZF1表达质粒(p IRES2-EGFP-MZF1)共转染HEK293细胞,检测其荧光素酶活性,以确定MZF1对RGC32基因的启动作用。另用生物信息学软件预测RGC32基因启动子上转录因子MZF1潜在的结合位点,并据此构建3个RGC32基因启动子截短的荧光素酶报告质粒(即p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3)。将上述RGC32基因启动子全长和各截短的荧光素酶报告质粒与MZF1过表达质粒共转染HEK293细胞,再行荧光素酶活性测定,以筛选MZF1的结合位点。结果:菌液PCR及核酸测序证实,大鼠RGC32基因启动子(全长和各截短)的荧光素酶报告质粒均构建成功。将p GL3-RGC32-FL和p IRES2-EGFPMZF1共转染HEK293细胞发现,RGC32基因启动子活性显著增加。而将p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1、p GL3-RGC32-2和p GL3-RGC32-3分别与p IRES2-EGFP-MZF1共转染HEK293细胞后显示,p GL3-RGC32-3的启动活性显著低于p GL3-RGC32-FL、p GL3-RGC32-1和p GL3-RGC32-2。提示MZF1可能结合在RGC32基因启动子的-286~-86 nt区域。结论 :成功构建了大鼠RGC32基因启动子全长及截短荧光素酶报告质粒,证实过表达MZF1可促进RGC32基因的启动,并初步筛查出转录因子MZF1在RGC32基因启动子上可能的结合区域。     

MDR1启动子的活性研究

目的:克隆编码多药耐药基因-1（MDR1）中不同长度的启动子片段并探讨和比较其在乳腺癌细胞中的转录活性。方法: 利用PCR扩增技术以MCF-7/ADR细胞基因组为模板克隆3种不同长度的启动子片段。pGL3-basic的启动区域中,构建一系列报告基因载体pGL3-MDR1Pn。以pGL3-control为阳性对照,分别将含不同长度的MDR1启动子的报告基因载体pGL3-MDR1Pn与pRL-TK以一定比例共转染到敏感的MCF-7细胞和耐阿霉素的MCF-7/ADR细胞,通过分析表达的荧光素酶的活性从而比较不同长度的启动子片段在这两种细胞中的转录活性。结果:通过酶切鉴定和测序验证了已将不同长度的MDR1启动子片段成功插入到荧光素酶报告基因载体pGL3-basic中,且克隆的片段中没有出现碱基突变。将表达载体转染细胞后活性检测结果显示pGL3-MDR1P1、pGL3-MDR1P2和pGL3-MDR1P3在MCF-7中活性分别为阳性对照的(13.03 2.35)%、(14.60 3.57)%和(10.27 1.89)%;而在MCF-7/ADR中活性分别为阳性对照的(105.26 6.84)%、(59.08 4.95)%和(62.39 5.76)%。结论:成功克隆了MDR1启动子片段,并成功构建了荧光素酶报告基因载体pGL3-MDR1P。启动子的活性分析结果初步表明长度约为2 000 bp的MDR1P1在MCF-7/ADR中具有相对较高的特异性。     

人内皮细胞高表达脂多糖相关因子1启动子荧光素酶报告基因重组体的构建

目的构建内皮细胞高表达脂多糖相关因子1(EOLA1)基因启动子的报告基因重组质粒,为EOLA1启动子的分析鉴定奠定基础。方法提取人内皮细胞基因组DNA,设计引物克隆EOLA1基因上游不同长度的基因片段,插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,经限制性内切酶酶切鉴定、测序。结果成功构建了3种含有不同长度EOLA1上游基因的pGL3-EOLA1-Luc荧光素表达质粒,形成了系列的EOLA1启动子重组体。结论建立的不同长度EOLA1上游基因的报告基因系统为EOLA1启动子的活性分析奠定了基础。     

p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体的构建及鉴定

目的 构建人p53RFP基因启动子序列不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,研究启动子的转录活性.方法 PCR扩增人p53RFP基因启动子区域不同长度的目的片段,克隆到pGL3-Basic中,构建启动子区域3个不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双酶切和基因测序鉴定正确后,转染HEK293细胞,双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶活性.结果 成功构建了p53RFP启动子不同截短片段的荧光素酶报告基因载体,经双荧光素酶报告基因检测分析,3个启动子片段均具有转录活性.结论 成功构建了人p53RFP基因启动子荧光素酶报告基因载体,为研究p53RFP基因的转录调控机制提供了实验基础.     

Id1启动子的荧光素酶报告基因载体的构建及其在肝癌HepG2细胞中的活性检测

目的:扩增Id1启动子基因,构建Id1启动子的报告基因载体. 方法:通过PCR及双酶切方法,从HepG2细胞基因组DNA中获得Id1基因编码序列上游包含不同长度碱基的两段Id1启动子序列;分别克隆到报告基因pGL3-enhancer载体上,构建包含两段不同长度Id1启动子的报告基因载体;用脂质体转染法将两报告基因载体分别转染至肝癌HepG2细胞系;采用双荧光素酶报告基因系统评估Id1启动子活性. 结果:经PCR方法扩增出大小分别为1096 bp和266 bp的两段不同长度的Id1启动子片段,序列测定其编码序列及读框正确,酶切鉴定亚克隆序列正确. 瞬时转染HepG2后经报告基因检测,两段启动子均具有转录活性. 结论:成功构建了Id1启动子的报告基因载体,为进一步研究Id1启动子和肝癌的关系奠定了实验基础.     

人BRD8启动子系列报告基因的构建和鉴定

目的: 构建具有相同3'末端而5'末端逐渐截短的人BRD8启动子系列报告基因,并进行鉴定。方法: 聚合酶链反应(PCR)从人基因组中扩增BRD8启动子片段并插入荧光素酶报告基因载体pGL3-Basic;以已构建的BRD8报告基因为模板,分别用PCR扩增具有相同3'末端而5'末端逐渐截短的BRD8启动子系列片段,并分别插入pGL3-Basic载体。对BRD8启动子系列报告基因进行酶切鉴定、测序。结果: 通过酶切鉴定、测序,证明构建的BRD8启动子系列报告基因序列和方向正确。结论: 成功构建了人BRD8启动子系列报告基因,为进一步研究调节BRD8基因表达的特异性转录因子和(或)沉默子奠定了基础。     

EOLA1基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.     

稳定表达人BACE1启动子及荧光素酶报告基因HEK293细胞株的建立

目的 对人β位点裂解酶-1(BACE1)基因核心启动子进行克隆,构建携带BACEI基因启动子的荧光素酶报告载体,筛选稳定表达细胞株并分析其转录活性.方法 提取人胚肾HEK293细胞基因组DNA,以其为模板,PCR扩增BACE1核心启动子(-691～+67)并克隆至荧光素酶报告载体pGL4.21中,构建BACE1基因启动子荧光素酶报告载体pGL4.21-BACE1,将其转染HEK293细胞(无启动子的pGL4.21载体作阴性对照),利用嘌呤霉素筛选稳定表达株后检测其转录活性.结果 成功扩增到758 bp的BACE1核心启动子,pGL4.21-BACE1载体经双酶切鉴定正确;HEK293细胞被该载体转染后经嘌呤霉素筛选得到6株稳定表达BACE1启动子的细胞株,其转录活性分别是对照组(HEK293/pGL4.21)的(134.7±22.3)、(634.0±13.9)、(437.6±6.1)、(805.5±5.5)、(492.8±59.1)、(1 021.1±46.6)倍(P=0.001).结论 成功构建了人BACE1基因启动子荧光素酶报告载体.