全人源抗PSMA单链抗体的筛选及免疫活性鉴定

目的 从全人源单链噬菌体抗体库中筛选出抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)特异性单链抗体并进行免疫活性鉴定.方法 以合成的PSMA多肽为抗原,经过五轮吸附-洗脱-扩增,从单链噬菌体抗体库中筛选出特异性抗PSMA噬菌体抗体,ELISA检测其抗原结合能力,并对特异性较强的克隆提取质粒,表达可溶性抗体.Western Blott...     

大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞,提取mRNA后用RT-PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段,两者分别与Linker连接后,采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH-Linker-VL片段）,继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中,连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1,构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接,经电转化E.coliTG1和噬菌体的超感染,构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库,可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

抗乳铁蛋白单链抗体制备及鉴定

目的制备特异性的可溶性抗乳铁蛋白单链抗体。方法铁蛋白的单链抗体克隆,转化至大肠杆菌HB2151中进行可溶性表达。用固相化的乳铁蛋白从天然噬菌体抗体库筛选出抗乳表达产物以镍离子亲和层析法纯化,并进一步鉴定其纯度、活性等。结果成功筛选并表达了抗乳铁蛋白的单链抗体,该抗体能与乳铁蛋白特异性结合,而与转铁蛋白、溶菌酶、小牛血清白蛋白无交叉反应。结论建立了一种抗乳铁蛋白单链抗体的有效制备途径,为其进一步临床应用的研究奠定了基础。     

大容量人天然噬菌体单链抗体库的构建

目的：构建大容量和具有良好多样性的人天然噬菌体单链抗体库。方法：从人外周血分离淋巴细胞，提取mRNA后用RT—PCR技术采用新设计的引物扩增VH和VL基因片段，两者分别与Linker连接后，采用改进的重叠延伸PCR法将VH基因和VL基因连接成人单链抗体（scFv）基因（VH—Linker—VL片段），继而连接到噬菌粒载体pCANTAB5E中，连接产物通过电转化方法转入大肠杆菌TG1，构建噬菌体scFv抗体库。结果：所有VH、VL亚类基因都得到了扩增和有效的连接．经电转化E.coli TG1和噬菌体的超感染，构建了总库容达到了6×10^8的单链抗体库。结论：成功地构建了一个多样性良好的人源天然噬菌体抗体库，可用于制备具有应用前景的人源抗体。     

全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体的制备及活性分析

目的:制备全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体,并分析其结合活性?方法:构建全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体原核表达载体,优化表达并纯化全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc融合抗体?以纯化的灭活狂犬病病毒包板,对纯化的抗体进行结合活性分析?结果:构建全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc-pColdⅡ原核表达载体,经测序分析正确后,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行表达,在加入浓度为0.5 mmol/L IPTG时,scFv-Fc融合抗体的表达较高,其分子量大小为57 000?纯化后的scFv-Fc融合抗体在1∶512的条件下仍可以较好地结合狂犬病病毒?结论:构建全人源抗狂犬病病毒scFv-Fc-pColdⅡ原核表达载体,表达并纯化了scFv-Fc融合抗体,为研发狂犬病暴露后预防治疗性抗体药物奠定了基础?     

抗肝癌单链抗体基因库的制备

目的构建抗肝癌噬菌体单链抗体(Single-chainvariblefragments,ScFv)库并加以鉴定。方法从经肝癌细胞免疫小鼠脾淋巴细胞中提取mRNA,RT-PCR扩增轻、重链可变区基因片段,连接成ScFv基因并扩增,克隆到pCANTAB5E,导入大肠杆菌TG1培养并计数。PCR检测ScFv基因插入情况并对ScFv进行基因序列分析和ELASA检测。结果抗体库库容为2.14×106;90%的噬菌体基因中有ScFv基因的插入;核酸序列分析显示抗体库基因结构正确;ELASA检测证实ScFv的表达。结论所建抗肝癌噬菌体ScFv库库容大,质量良好,对肝癌的基础研究和临床有潜在的应用价值。     

全人源抗狂犬病病毒糖蛋白抗体的制备及鉴定

目的:利用重组狂犬病病毒糖蛋白(RVG)免疫人源IgM转基因小鼠,制备全人源抗重组RVG蛋白单克隆抗体,并对其免疫学特性进行初步鉴定?方法:以重组RVG蛋白作为抗原免疫人源IgM转基因小鼠,采用杂交瘤技术制备筛选全人源抗重组RVG蛋白杂交瘤细胞株,双抗体夹心ELISA实验鉴定单抗的人源性及抗体类型,并对其特异性及与灭活狂犬病病毒CVS-11株的结合能力进行鉴定?结果:建立了5株稳定分泌抗重组RVG的全人源单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为5D1?6H11?9A3?15D6?19E6,均为人源IgM免疫球蛋白,5株单抗均能特异性识别重组RVG蛋白,其中3株能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合?结论:筛选制备了特异性全人源抗重组RVG蛋白的单克隆抗体,能与灭活狂犬病病毒CVS-11株特异性结合,为进一步研制用于狂犬病防治的抗体药物奠定了基础?     

尘肺病噬菌体单链抗体库的构建及鉴定

目的:构建具有良好多样性的人尘肺病噬菌体单链抗体( ScFv)库.方法:收集25例尘肺病患者外周血标本共50 mL,密度梯度离心法分离淋巴细胞,Trizol法提取总RNA,逆转录后参考文献设计并合成半巢式PCR引物,扩增抗体重链(VH)和轻链(VL)可变区基因,Linker连接VH和VL,继而连接到噬菌体载体pCANT...     

抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白Ⅱ单链抗体库的构建及筛选

目的：构建抗恶性疟原虫富含组氨酸蛋白Ⅱ（Histidine-rich protein Ⅱ,HRP-Ⅱ）单链抗体库,并筛选出阳性克隆。方法：用噬菌体抗体库技术构建抗恶性疟原虫HRP-Ⅱ单链抗体库,并以HRP-Ⅱ为靶抗原对该库进行了三轮“亲和吸附-援救-感染扩增”的富集,挑聚单菌落筛选并鉴定阳性克隆。结果：获得目的基因并成功构建抗恶性疟原虫HRP-Ⅱ的单链抗体库,库容为10^6,并从中筛出8株阳性克隆。结论：噬菌体抗体库技术具有高效的筛选能,抗HRP-Ⅱ单链抗体的制备为其在恶性疟的免疫快速诊断方法中的应用奠定了基础。     

Screening for a human single chain Fv antibody against epitope on amyloid-beta 1-40 from a human phage display library

Amyloid-beta peptides （Aβ） are believed to be .responsible for the mental decline in patients with Alzheimer＇s reported that pathology in vaccination disease （AD）. In 1999, Schenk et all immunization with Aβ attenuated AD-like the PDAPP mouse, and developed a new approach to AD. Such vaccines were successfully tested in mouse models of AD for the reduction of Aβ plaque burden and the improvement of cognitive performance. However, 6% of AD patients developed symptoms of brain inflammation after vaccination that resembled enceohalitis or meningitis.     

一种大容量天然人源核糖体展示单链抗体文库的构建

目的 构建大容量天然人源核糖体展示单链抗体(single chain Fv,scFv)文库,为抗体研究提供方便有效的技术平台.方法 收集健康献血志愿者的白细胞悬液,离心分离单个核细胞,抽提其总RNA,逆转录成cDNA、PCR及重叠延伸PCR法构建scFv文库,并通过第2次重叠延伸PCR在scFv DNA序列5'端添加T7启动子、茎环结构、核糖体结合位点,其3'端添加6×His标签、间隔序列(基因Ⅲ)、茎环结构等改造成核糖体展示天然人源scFv文库.结果 成功构建了可用于筛选抗体的核糖体展示文库容量达1013以上.结论 成功构建了大容量天然人源核糖体展示scFv文库,为筛选到高亲和力和特异性抗体提供了技术平台.     

人源脂多糖结合蛋白单克隆抗体的筛选及初步鉴定

目的制备人源抗脂多糖结合蛋白(LBP)单克隆抗体,并对该抗体的效价进行初步鉴定。方法以人脂多糖结合蛋白(human lipopolysaccharide binding protein,hLBP)为抗原,以人源噬菌体抗体库进行筛选,经5轮“吸附洗脱扩增”的富集反应后,筛选出3株抗人LBP阳性克隆株,抽提其质粒、切除geneⅢ、自身环化并电转入XL1blue后,以IPTG诱导分泌表达可溶性抗体,通过ELISA法测定抗体效价。结果抗体库被浓缩8.16×104倍,获得3个与LBP结合能力较强的单克隆菌株,其中结合力最强者产生抗体活性为106。结论成功获得针对人LBP的Fab抗体,经初步鉴定具有较高效价,为下一步研究该抗体功能奠定基础。     

人源肺腺癌噬菌体抗体库的构建及筛选

目的:构建人源噬菌体单链抗体ScFv基因文库,并从中筛选出抗肺癌抗体。方法:提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH 和VL连接得到单链抗体ScFv。将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库。以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行“吸附-洗脱-扩增”筛选富集,共进行4轮筛选,鉴定抗体库性能。结果:成功构建噬菌体单链抗体库。在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第4轮为第1轮的115倍。随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与肺癌细胞呈阳性反应,阳性率为70%。结论:通过噬菌体展示技术得到肺癌相关人源单链抗体,筛选后的单链抗体能与肺腺癌细胞A549特异性结合。     

人源日本血吸虫Fab抗体库的构建及抗独特型抗体的筛选、鉴定

目的:构建人源日本血吸虫Fab抗体库,筛选出日本血吸虫抗独特型抗体并进行初步鉴定。方法:以3名晚期血吸虫患者切除的脾脏为源,构建人源日本血吸虫Fab抗体库。并以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)及成虫抗原(SWAP)免疫鼠血清IgG包板进行筛选,经ELISA鉴定后,对阳性克隆进行可溶性表达。结果:构建了人源日本血吸虫Fab抗体库,库容为4.3×106,经核苷酸序列分析,证实插入片段为Fab基因片断。经过5轮筛选后,从富集的次级抗体库中随机挑取60个克隆,用ELISA法鉴定得到4个可与免疫鼠血清(Ab1)特异性结合,而不与SEA及SWAP结合的单克隆抗体(A3、B6、C4、C17),其中B6经SDS-PAGE电泳显示插入片断正确。结论:成功构建了人源日本血吸虫Fab抗体库,并从中获得人源日本血吸虫抗独特型抗体B6,为研制用于人体血吸虫病免疫预防的抗独特型抗体疫苗奠定了基础。     

Schistosoma japonicum: construction of phage display antibody library and its application in the immunodiagnosis of infection

Background A monoclonal antibody would be an effective tool for the detection of circulating antigens in the serum of patients with schistosomiasis, but the traditional way of producing monoclonal antibodies is not cost-effective. The objective of this study was to find a new method for the large-scale production of monoclonal antibodies against Schistosoma japonicum (Sj).Methods A phage display antibody library for Sj was constructed. To obtain a single-chain variable fragment antibody (scFv) against Sj, the library was screened with metabolic antigens from adult Sj worms (Sj-MAg) using enzyme-linked immunosorbent assay. The soluble scFvs selected were used to detect Sj antigens in the serum of acute and chronic schistosomiasis patients.Results Six positive clones with good reactivity to Sj-MAg were obtained from the phage display antibody library of about 1.07 x 106 individual clones. Only two of these six clones bound specifically to Sj-MAg and were chosen for further analysis. Specific soluble anti-Sj-MAg scFvs were produced by inducing the 2 clones with isopropyI-D-thiogalactopyranoside. The characteristics of the scFvs were then determined. The results of Western blot showed that these scFvs could bind to Sj-MAg specifically and had a molecular weight of about 31 kD. When testing serum from schistosomiasis patients with one of the two specific scFvs, its sensitivity was found to be 60% and 37% in acute and chronic patients, respectively, with a specificity of 90%. When the two specific scFvs were combined,their sensitivity was found to be 75% and 57% in acute and chronic patients, respectively, with a specificity of 85%.Conclusions The results indicate that the scFvs are potentially useful for the diagnosis of schistosomiasis. The library construction also provides a useful tool for the further screening of other antibodies for both diagnostic and immunotherapeutic applications and for epitope analysis and vaccine design.     

抗HEV ORF2单链可变区抗体的筛选和鉴定

目的：筛选和鉴定抗戊型肝炎病毒（ＨＥＶ）开放读码框架２（ＯＲＦ２）的人源化噬菌体单链可变区抗体。方法：以大肠杆菌表达的重组ＨＥＶ ＯＲＦ２多肽做为固相包被抗原,从半合成的人源化噬菌体抗体库中经过４轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选过程及酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）、ＤＮＡ序列分析鉴定,获得抗原结合活性较强的抗－ＨＥＶ ＯＲＦ２单链可变区抗体,并以间接酶标法用该抗体对戊型肝炎患者石蜡包埋肝组织中的ＨＥＶ ＯＲＦ２抗原进行免疫组织化学鉴定。结果：筛选到的抗－ＨＥＶ ＯＲＦ２的单链可变区抗体基因。酶切和序列分析表明,该抗体基因由７９５ｂｐ组成：ＥＬＩＳＡ和免疫组织化学结果显示,抗－ＨＥＶ ＯＲＦ２人源化噬菌体单链可变区抗体能与重组ＨＥＶ ＯＲＦ２抗原特异性结合,并能够特异性识别戊型肝炎患者肝组织中的ＨＥＶ抗原。结论：此法     

噬菌体抗体库中筛选特异结合新甲型H1N1病毒scFv分子的研究

目的 从人源化噬菌体抗体库中筛选到能高亲和性、特异结合新甲型H1N1流感病毒的单链抗体,为分析H1N1病毒抗原中和表位的活性位点和人源化治疗单抗奠定基础.方法 将细胞培养的新型H1N1病毒毒株,经超速离心浓缩纯化后,获得纯的新甲型H1N1病毒,以新甲型HIN1病毒为靶蛋白,以亲和结合为原理,筛选噬菌体scFv抗体文库,经过3轮筛选富集后,随机挑选了96个噬菌体克隆扩增培养,ELISA法挑选能特异性、高亲和性结合目的蛋白的噬菌体克隆.结果 经过3轮富集性的亲和筛选,分别从96个噬菌体克隆中挑选到了4株能特异结合新甲型H1N1病毒,而不结合季节性H1N1病毒的单链抗体分子,且PCR扩增都得到了长为368、527和935 bp的轻链、重链和轻链-连接片段-重链的基因片段.结论 从噬菌体抗体库中筛选到的特异结合新甲型H1N1病毒的单链抗体片段,可为进一步研发新甲流的H1N1快速筛选试剂和人源性治疗抗体奠定基础,也可为鉴定新甲型H1N1病毒中的抗原决定簇提供结构信息.     

大容量天然人源Fab抗体库的构建及日本血吸虫抗独特型抗体的筛选、鉴定

目的:构建大容量天然人源Fab抗体库,筛选全人源日本血吸虫抗独特型抗体并进行初步鉴定。方法:采集15位健康成人的骨髓淋巴细胞,构建天然人源Fab抗体库。并以日本血吸虫可溶性虫卵抗原(SEA)及成虫抗原(SWAP)免疫鼠血清IgG包板进行筛选,经ELISA鉴定后,对阳性克隆进行可溶性表达。结果:构建了2×109大容量天然人源Fab抗体库,经核苷酸序列分析,证实插入片段为Fab基因片断。经过6轮筛选后,从富集的次级抗体库中随机挑取80个克隆,用ELISA法鉴定得到4个可与免疫鼠血清(Ab1)特异性结合,而不与SEA及SWAP结合的单克隆抗体(C12、C19、D1、D2),其中C12经SDS-PAGE电泳显示插入片断正确。结论:成功构建了大容量天然人源Fab抗体库,并从中获得人源日本血吸虫抗独特型抗体C12,为研制用于人体血吸虫病免疫预防的抗独特型抗体疫苗奠定了基础。