甲基CpG结合域四聚体蛋白的原核表达、纯化及鉴定

目的 在大肠埃希菌中表达甲基CpG结合域四聚体蛋白,并对其进行纯化和鉴定。方法 将重组表达质粒4×MBD-pET30b+转化大肠埃希菌DH5a克隆扩增并测序鉴定后,转化大肠埃希菌BL21（DE3）后接种于LB 培养基中,异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导重组蛋白的表达, 表达产物经Ni-NTA亲和层析纯化,通过SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白表达,用此蛋白免疫染色人胚肾细胞后用荧光显微镜观察。结果 克隆质粒测序结果与理论预期完全一致,SDS-PAGE显示在大肠埃希菌中表达出相对分子量为46 000的目标蛋白,Western blot显示目标蛋白带有His融合标签（氨基端）和HA标签（羧基端）。荧光显微镜观察显示MBD蛋白能与细胞内的甲基化CpG基序特异性结合。结论 成功表达并纯化了具有免疫原性的甲基CpG结合域四聚体蛋白,为今后进一步研究DNA甲基化奠定了基础。     

甲基化CpG结合结构蛋白2在胃癌的表达及靶向抑制

目的：研究甲基化CpG 结合结构蛋白2（methyl-CpG-binding domain protein 2,MBD2）在胃癌的表达及靶向抑制。方法：免疫组化法对40例胃癌及配对胃黏膜组织,免疫荧光法对胃癌细胞SGC-7901行MBD2表达研究。构建3个靶向抑制MBD2的siRNA（MBD2-siRNA-1、MBD2-siRNA-2、MBD2-siRNA-3）。转染MBD2-siRNA入SGC-7901,RT-PCR及Western blot验证MBD2的抑制效果。噻唑蓝比色法检测SGC-7901增殖率。结果：胃癌组织MBD2表达较对照胃黏膜组织增强（χ2=6.646,P=0.010）;且低分化胃癌与伴幽门螺杆菌感染的胃癌中MBD2表达更强（ χ2值分别为9.730、8.700,P值分别为0.01和0.04）。MBD2蛋白在胃癌胞核分布。MBD2-siRNA可成功转染SGC-7901,并成功筛选靶向抑制MBD2的siRNA（MBD2-siRNA-2）。发现转染MBD2-siRNA-2后96 h,SGC-7901增值率被抑制。结论：MBD2在胃癌表达增强,抑制MBD2可能抑制胃癌增殖。     

人HMGB1基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达和纯化

目的  构建人高迁移率族蛋白B1（HMGB1）基因的原核表达载体,观察表达水平并纯化重组蛋白。方法  根据GenBank中人HMGB1基因序列,用OptimumGeneTM行密码子优化并合成目的基因,经PCR扩增,NdeⅠ和XhoⅠ双酶切,插入原核表达载体pQE-T7-2的相应位点,构建原核表达质粒pQE-T7-2/HMGB1。经菌落PCR、酶谱分析及序列分析鉴定重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot印迹法鉴定重组蛋白,Ni NTA树脂亲和纯化目的蛋白。结果  成功构建人HMGB1克隆载体和表达载体;表达的目的蛋白约占菌体总蛋白的20%以上,Western blot法显示,重组蛋白能与抗HMGB1抗体和抗His抗体特异结合,亲和层析纯化后纯度达90%以上。结论  成功构建高效稳定的重组人HMGB1原核表达载体,获得纯化人HMGB1蛋白,为进一步研究HMGB1的功能奠定基础。     

人可溶性CD83基因的克隆、原核表达和纯化

目的:构建人可溶性CD83基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达和纯化.方法:利用反转录PCR方法从正常人外周血单个核细胞中获得可溶性CD83基因,克隆到表达载体pET-32a载体,构成重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达6×His融合蛋白,并经SDS-PAGE及Western blot检测和鉴定.表达产物包涵体经Ni-NTA亲和层析纯化.结果:经酶切鉴定及测序证实可溶性CD83蛋白基因的原核表达载体构建正确.经SDS-PAGE及Western blot显示在M,约32 000处出现融合表达条带.融合蛋白的表达量约占菌体蛋白总量的45%.重组蛋白经Ni-NTA亲和层析进行纯化后,得到了高纯度的融合蛋白.结论:成功克隆人外周血单个核细胞来源的可溶性CD83基因片段,并在大肠杆菌B121(DE3)中高效表达,亲和层析纯化后获得高纯度融合蛋白.     

人精脒/精胺N1乙酰基转移酶基因的克隆、表达和纯化

目的构建人精脒/精胺N1乙酰基转移酶基因的原核表达载体，诱导该质粒在大肠杆菌中表达并纯化其表达的重组蛋白。方法从大肠癌组织中提取总RNA，采用RT-PCR法扩增人SSAT基因的cDNA片段，经TA克隆及亚克隆方法构建原核表达载体pTriEx-4-SSAT。将重组表达质粒转化入E.coli JM109 (DE3)中，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定表达蛋白，并通过6His-tag，利用亲和层析法纯化表达的融合蛋白。结果酶切鉴定和DNA测序显示，人SSAT的cDNA片段成功插入表达载体pTriEx-4中，而且方向正确，SDS-PAGE电泳显示表达出20?kD的外源蛋白。Western blot检测结果显示，表达出的蛋白为6His-tag的融合蛋白，而且用Ni-NTA亲和层析法纯化了该重组蛋白。结论成功构建、表达和纯化了重组SSAT蛋白，为制备其抗体及研究该基因与结直肠肿瘤的关系提供了有力的工具。     

麦芽糖结合蛋白-微管驱动蛋白11删除型融合基因表达载体的构建及其蛋白表达

目的:构建删除型微管驱动蛋白(KIF)11与麦芽糖结合蛋白(MBP)的融合蛋白的原核表达载体,并纯化得到高纯度的MBP-删除型KIF11融合蛋白。方法:PCR法从全长的KIF11基因组中扩增KIF11的相关删除型基因并连接到原核表达载体pMal中,此载体包含一个表达MBP的基因,删除型KIF11片段插入后与其融合,筛选和测序鉴定阳性克隆。将重组质粒转化到Rosseta大肠杆菌中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达和亲和层析分离纯化表达产物,对纯化的蛋白进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹杂交(Western blot)鉴定。结果:成功扩增删除型KIF11基因,构建MBP-KIF11-head,-stalk和-tail重组质粒并在Rosseta中诱导表达出MBP-KIF11-head,-stalk,-tail融合蛋白。经SDS-PAGE和Western blot法验证了高纯度纯化的融合蛋白。结论:建立了高效稳定的MBP-KIF11表达体系,为进一步研究KIF11与mRNA调控蛋白锌指结合蛋白1相互作用的区域打下基础。     

肺炎链球菌毒力因子PspA的原核表达、纯化及鉴定

目的:通过构建原核表达载体,获得肺炎链球菌毒力因子PspA重组蛋白.方法:分离培养肺炎链球菌TIGR4,获取其染色体DNA,采用基因体外重组法将PspA序列克隆到原核表达载体PET-32(a)上,用酶切及测序鉴定.将重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,进行蛋白纯化,获得的重组蛋白用SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果:克隆的DNA序列与GenBank中的数据相符,获得的重组蛋白PspA纯度达到90%.结论:成功表达和纯化了PspA,为肺炎链球菌多肽联合疫苗研制和该蛋白的结构生物学分析奠定了基础.     

变形链球菌唾液结合区段(SBR)在大肠杆菌中的表达

目的构建含变形链球菌唾液结合区段(SBR)基因的原核表达载体,并在大肠杆菌JM109(DE3)中诱导表达。方法采用定向克隆方法将变形链球菌唾液结合区段(SBR)基因插入表达载体pcMVT 7,构建重组原核表达质粒pcMVT 7-SBR,转化大肠杆菌JM109(DE3),IPTG诱导表达,亲和层析纯化SBR目的蛋白。结果经酶切鉴定及DNA序列测定,重组质粒pcMVT 7-SBR序列及阅读框架正确,亲和层析纯化得到SBR融合蛋白。结论成功构建了含变形链球菌唾液结合区段(SBR)基因的原核表达载体,为防龋疫苗的动物实验研究奠定基础。     

人肿瘤蛋白D52重组融合蛋白的原核表达及特性鉴定

目的:表达人肿瘤蛋白D52(human tumor protein D52,hTPD52)的重组融合蛋白,并对该蛋白的生物学特性进行鉴定?方法:RT-PCR扩增乳腺癌MCF-7细胞中的hTPD52基因并克隆于pMD18-T载体中,测序鉴定序列正确后,分别插入pET-32a?pGEX-4T-2和pET-28a 3种表达载体中?重组质粒经酶切鉴定?序列分析正确后转化大肠杆菌BL21(DE3),选择最佳表达载体和表达条件进行大量表达,表达产物经His柱亲和纯化和超滤浓缩后,应用Dot blot?Western blot鉴定纯化蛋白的特性?结果:正确扩增出了hTPD52基因,鉴定其为isoform 3型?用pET-32a-hTPD52重组表达载体能够大量表达可溶性的hTPD52-Trx融合蛋白,Dot blot显示表达的融合蛋白能和抗hTPD52的抗体结合,SDS-PAGE和Western blot显示表达的融合蛋白分子质量约为44 ku,去除Trx后仍能够与特异性抗体结合?结论:成功制备hTPD52重组融合蛋白,并证明原核表达的hTPD52保留了原有的抗原结合活性?     

人源抗EGFR抗体-鱼精蛋白融合蛋白的制备及活性分析

目的:构建人抗EGFR单链抗体(scFv)/鱼精蛋白截短体(truncated protamine,tP)融合蛋白基因,在大肠杆菌中表达并纯化,分析该融合蛋白的生物学活性?方法:设计引物扩增人抗EGFR单链抗体编码序列,将其克隆于原核表达载体pBAD-A;人工合成tP序列,将其克隆于原核表达载体pBAD-AscFv上,构建成scFv/tP融合基因,在大肠杆菌TOP10F′中诱导表达,表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定后,用His-trap镍亲和层析柱纯化?ELISA分析scFv/tP融合蛋白抗原亲合活性,凝胶迁移阻滞实验检测scFv/tP融合蛋白与DNA的结合活性?结果:成功构建了人源抗EGFR抗体/tP融合基因,经L-Ara诱导后在大肠杆菌中实现了可溶性表达?表达的scFv/tP融合蛋白保持了与抗原的结合活性,同时具有结合DNA的能力?结论:scFv与tP融合后,同时具有与抗原和DNA结合的活性,该scfv/tP融合蛋白为EGFR表达阳性肿瘤的靶向基因治疗奠定了基础?     

小鼠白介素17受体A胞外段的表达、纯化及鉴定

目的:分别克隆小鼠白介素17受体A胞外段(mIL-17RAaa32-322)及小鼠IgG2AFc(mIgG2AFc)基因,构建mIL-17RAaa32-322-mIgG2AFc融合蛋白原核表达载体,并在体外表达、纯化及鉴定。方法:利用基因重组技术构建pET32a(+)-mIL-17RAaa32-322-mIgG2AFc原核表达载体,并在E.coli Rosetta中表达mIL-17RAaa32-322-mIgG2AFc融合蛋白,经镍离子螯合层析分离纯化后,用SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹法进行鉴定。结果:成功构建pET32a(+)-mIL-17RAaa32-322-mIgG2AFc原核表达载体,获得高效表达的融合蛋白,且蛋白质印迹证实为目的蛋白。结论:获得mIL-17RAaa32-322-mIgG2AFc融合蛋白,为进一步研究其生物学功能奠定基础。     

结核分枝杆菌耐药性相关膜蛋白MmpL6的表达与纯化

目的 构建结核分枝杆菌外排泵蛋白MmpL6(Rv1557)表达载体,在大肠杆菌E. coli中诱导MmpL6蛋白高表达并进行纯化.方法 以结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组DNA为模板,采用聚合酶链反应扩增目的基因片段,构建pET21b-MmpL6表达载体将表达载体转化至大肠杆菌中,加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,并针对不同表达菌株、温度进行优化,获取最优表达条件.采用Ni-NTA亲和层析以及凝胶过滤色谱纯化目标蛋白.结果 成功构建pET21b-MmpL6重组表达质粒,经 IPTG诱导后,在Rosetta菌株中25 ℃条件下获得最高表达量.结论 成功表达并纯化了 MmpL6蛋白,为该蛋白后续的结构与功能研究奠定了基础.     

人解痉多肽原核表达载体的构建及诱导表达

目的:构建人解痉多肽(hSP)原核表达载体,表达重组hSP,为功能研究奠定基础。方法:通过RT-PCR获得hSPcDNA片段,将目的基因插入原核表达载体pET32a,得到重组载体pET32a-hSP。IPTG诱导表达后行SDS-PAGE分析及WesternBlot检测。结果:经测序及PCR证实,hSPcDNA准确插入原核表达载体pET32a中,诱导表达后SDS-PAGE分析证明hSP的分子量约为32kD,Western-blot分析表明,表达蛋白具有良好的抗原性和特异性。结论:上述结果表明成功构建出原核表达载体pET32a-hSP,获得重组hSP,并为深入研究hSP奠定了基础。     

人可溶性TRAIL原核表达载体的构建和蛋白表达、纯化及活性鉴定

目的建立高效表达可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）蛋白的原核表达载体,获得高生物学活性的TRAIL蛋白。方法取健康人外周血提取总RNA,RT-PCR扩增TRAIL基因的胞外区片段,克隆入原核表达载体pET30a中,经双酶切、PCR及测序鉴定阳性克隆。重组载体转化感受态细胞BL21,优化蛋白表达条件;亲和层析法纯化重组蛋白;SDS-PAGE蛋白电泳、Western blot鉴定。重组蛋白与TRAIL蛋白标准品分别作用Huh-7细胞,CCK8、流式细胞术检测蛋白生物学作用。结果 DNA测序结果证实成功构建重组质粒pET30a/TRAIL,SDS-PAGE蛋白电泳、Western blot显示pET30a/TRAIL诱导的为可溶性的His-rTRAIL。CCK8、流式细胞术检测结果显示,与TRAIL蛋白标准品相比,His-rTRAIL对Huh-7细胞具有良好的促凋亡作用。结论成功构建高效表达可溶性TRAIL蛋白的原核表达载体pET30a/TRAIL,表达的可溶性蛋白His-rTRAIL具有高度的生物学作用,为肿瘤的生物学治疗提供新的实验依据。     

重组非洲爪蟾和小鼠血管内皮细胞生长因子的原核表达、纯化及鉴定

目的构建非洲爪蟾和小鼠血管内皮细胞生长因子重组表达载体，进行蛋白质原核表达，并对表达产物进行分离、纯化和鉴定。方法首先通过限制性核酸内切酶酶切及连接反应，构建非洲爪蟾和小鼠血管内皮细胞生长因子的原核表达载体pET—xVEGF和pET—mVEGF。筛选的重组质粒经酶切和DNA序列测定等证实正确性后，再转染感受态大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导蛋白质表达。表达产物经Ni—NTA亲合层析及肠激酶特异性酶切进行分离纯化，最后用SDS—PAGE和蛋白免疫印迹法进行鉴定。结果限制性核酸内切酶酶切和DNA序列测定等显示目的基因片段和阅读框架正确无误，表明非洲爪蟾和小鼠血管内皮细胞生长因子的原核表达载体pET—xVEGF和pET—mVEGF、构建成功。重组蛋白质在大肠杆菌中获得稳定表达，分离纯化的表达产物xVEGF和mVEGF的纯度达到95％以上，其相对分子质量与预期值一致。抗小鼠VEGF抗体可特异性识别xVEGF和mVEGF。结论重组非洲爪蟾和小鼠血管内皮细胞生长因子的原核表达、分离纯化及鉴定成功，为进一步研究异种VEGF蛋白质疫苗抗小鼠肿瘤模型奠定了基础。     

重组α2-HS糖蛋白的原核表达、纯化及免疫学活性分析

目的:原核表达并纯化具有生物学活性的重组α2-HS糖蛋白(AHSG)。方法:提取人肝癌细胞株HepG2细胞总RNA,逆转录得cDNA,PCR扩增出目的基因,与pMD18-T载体连接后,转化至大肠杆菌DH5α中,大量扩增后提取克隆质粒,连接至原核表达载体pEP-30a(+)中,转化BL21(DE3),经IPTG诱导蛋白表达,通过镍离子亲和层析的方法纯化重组蛋白,采用SDS-PAGE电泳、免疫印迹杂交法对纯化产物进行分析鉴定。结果:成功构建了AHSG原核表达系统BL21(pET30a-AHSG),最佳诱导条件为80μmol/LIPTG诱导3h;诱导表达的蛋白相对分子质量约54600,主要以不溶性的包涵体形式存在,纯化后的重组蛋白质量浓度最高达2.3g/L,经免疫印迹杂交鉴定有抗原性。结论:成功构建了AHSG原核表达系统,该系统可高效表达重组AHSG蛋白,该蛋白具有良好的抗原性。     

人成熟转化生长因子β1蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的构建人成熟转化生长因子β1（hmTGF-β1）的原核表达载体,表达并纯化hmTGF-β1蛋白。方法应用RT-PCR方法获得hmTGF-β1基因,连接至自带6His标签表达载体pET23b,构建原核表达质粒pET23b-hmTGF-β1,诱导表达hmTGF-β1融合蛋白,镍亲合层析法纯化融合蛋白,并对纯化产物进行纯度分析。结果成功构建了hmTGF-β1原核表达质粒pET23b-hmTGF-β1,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳分析,在约15kD处出现了一条新的蛋白条带,WesternBlot结果显示该条带能够与His抗体特异性结合。应用Ni-NTA亲和层析法纯化目的蛋白,分析纯度达95%。结论成功构建了hmTGF-β1蛋白的原核表达质粒,并成功表达与纯化hmTGF-β1蛋白,为进一步复性、获得有活性的hmTGF-β1打下基础。     

人宫颈癌致癌基因的原核表达与多克隆抗体制备

目的构建人宫颈癌致癌基因HCCR-1167-360片段的重组质粒,在原核细胞中表达并鉴定。方法从培养的人肝癌细胞株HepG2中提取总RNA,经RT-PCR扩增出HCCR-1167-360的cDNA片段,将其克隆到pGEM-T-Easy克隆载体中,将测序正确的HCCR-1167-360基因连接到pET30a(+)表达载体中,IPTG诱导在BL21中进行表达,用SDS-PAGE检测表达产物。采用初步纯化和割胶纯化方法,获得较纯的重组蛋白,采用弗氏佐剂方法免疫兔子,收获多克隆抗体,用Wastern blot鉴定重组蛋白的免疫原性。结果经测序证明获得了HCCR-1167-360基因片段。SDS-PAGE分析,HCCR-1167-360在BL21中获得表达,其相对分子质量为26kD左右,主要以包涵体形式存在。免疫兔子获得了HCCR-1167-360多克隆抗体,经Wastern blot检测结果表明获得了特异性的多克隆抗体。结论获得具有抗原性的HCCR-1167-360原核表达蛋白。