聚乙烯亚胺载体介导的基因转移

目的:探讨以聚乙烯亚胺为骨架的非病毒载体在基因转染中的影响因素.方法:利用聚乙烯亚胺分别结合含β半乳糖甙酶报告基因的pSVβ表达质粒,含绿色荧光蛋白报告基因的pEGFP质粒转染Cos-7细胞,通过组织化学法测定细胞抽提产物中βgal的表达量和流式细胞仪法测定绿色荧光蛋白阳性细胞的表达比例,来测定影响转基因效率的各种参数.结果:在培养液中,6 mg/L聚乙烯亚胺作用NIH 3T3细胞24 h,细胞生存率为64.2%,7 mg/L时细胞生存率为54.4%.聚乙烯亚胺在N/P比3.0以上方可完全结合DNA.溶酶体抑制剂氯喹可增加聚乙烯亚胺的转染效率;培养液中的白蛋白、血清可降低转染效率.作为配制聚乙烯亚胺/DNA复合物的溶媒,HEPES缓冲液和生理盐水优于278 mmol/L葡萄糖.在配制聚乙烯亚胺/DNA复合物的溶媒中加入Mg2 可降低转染效率.结论:通过体外细胞试验证明,聚乙烯亚胺是一种有效的真核细胞转染剂和人工合成基因载体的骨架.     

聚乙烯亚胺介导NIH-3T3细胞体外转染pEGFP-N1系统优化

目的 优化聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)介导的细胞转染以提高目的 基因在细胞中的表达强度.方法 根据PEI/DNA不同的质量比(0:1、0.5:1、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1)利用凝胶阻滞分析结合的情况;不同质量比PEI/DNA形成的复合物对NIH-3T3细胞的转染通过细胞表达强度获得最佳PEb/DNA质量比;比较实验组l(PEI/DNA质量比2:1)、实验组2(重复PEL/DNA质量比2:1)及实验组3(PEI/DNA质茸比4:2)3种转染方案,探讨重复转染的方法是否提高细胞表达强度.结果 ①通过凝胶阻滞分析PEI/DNA能够稳定结合的质量比是1:1～10:1;②PEI/DNA复合物对NIH-3T3细胞进行转染,其荧光表达强度当PEI/DNA(质量比)≤2时随着PEI的增加而提高,当PEI/DNA(质量比)>2时,荧光表达强度反而降低;③采用重复转染的方法实验组2细胞荧光表达强度(24.08±0.28)%明显高于实验组1(8.97±4.02)%和实验组3(14.24±2.68)%(P<0.05).结论 在PEI/DNA(质量比)=2的条件下,PEI/DNA复合物转化NIH-3T3细胞的效果比较理想,重复转染可以提高细胞转染后荧光表达强度.     

多聚乙烯亚胺介导基因转染的试验研究

目的确定多聚乙烯亚胺最佳的转染条件，评价PEI替代其它转染试剂的可能性。方法以MTT法检测PEI的细胞毒性。以PEI为载体，在不同的N／P比值的条件下，将绿色荧光蛋白基因和荧光素酶基因分别导入小鼠骨肉瘤细胞，以荧光显微镜酶检测系统检测其转染效率。结果PEI的细胞毒性较低。当N／P比值为8时，PEI的转染效率最高。结论PEI是一种价格低廉、低毒性、高效率的基因转染载体，可以广泛应用于体内外基因治疗。     

聚乙烯亚胺介导BMP-7基因体内转染促进老年大鼠骨折愈合

目的:观察聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)作为基因载体介导BMP-7基因体内转染促进骨折愈合的效果.方法:20月龄雄性SD大鼠随机分为3组:BMP-7 PEI治疗组、生理盐水对照组及BMP-7对照组(n=20).所有大鼠建立右股骨干骨折模型,BMP-7 PEI治疗组于骨折断端经皮注射pcDNA3.1-BMP-7/PEI混合试剂,生理盐水及BMP-7对照组分别注射等量生理盐水及pcDNA3.1-BMP-7.治疗后2、4、8周观察X线片、H-E染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色、生物力学和骨密度检测结果,判断骨折愈合情况.结果:X线及H-E染色结果表明,3组老年大鼠骨折后第8周均未获得愈合,但BMP-7 PEI治疗组骨痂生长情况优于生理盐水及BMP-7对照组,断端间出现部分骨性连接.Ⅰ型胶原染色表明,与生理盐水及BMP-7对照组相比,BMP-7 PEI治疗组Ⅰ型胶原染色深、分布范围较大.抗弯曲强度和骨密度检测结果表明,BMP-7 PEI治疗组各项指标均优于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05或0.01).结论:PEI介导BMP-7基因体内转染可有效促进老年大鼠骨折愈合.     

聚乙烯亚胺介导水通道蛋白5基因表达载体体外转染的研究

目的 探讨新型阳离子载体聚乙烯亚胺(PEI)介导水通道蛋白5(AQP5)体外转染人肺腺癌细胞系A549的效果。方法 将含绿色荧光蛋白的真核表达载体pEGFP-N1,以lipofectamine2000为阳性对照,流式细胞仪检测转染效率,根据不同N/P比(5、10、15、20、25)与PEI组成转染复合物转染A549细胞,优化最适 N/P比;将AQP5全长cDNA插入pEGFP-N1载体,构建pEGFP-N-AQP5,转染A549细胞,采用PCR与Western blot法检测被转染细胞中AQP5的表达。结果 流式细胞仪检测GFP发光率,N/P比为15时PEI/pEGFP-N1复合物转染效率最高,可达到89.72%,与脂质体91.44%相近;应用PEI与lipofectamine2000将 pEGFP-N-AQP5成功转染A549,与空白组比较,AQP5的基因及蛋白表达均增高。结论 新型阳离子载体PEI 可成功介导pEGFP-N-AQP5转染A549细胞。     

分枝状聚乙烯亚胺对不同细胞系的转染效率和细胞毒性作用

目的探讨分支状聚乙烯亚胺(PEI)作为载体对不同细胞株的转染效率和细胞毒性。方法培养人类胚胎肾细胞293T、人上皮癌细胞Hela、小鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)和大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC12。悬浮转染p EGFP质粒与PEI的复合物,利用荧光细胞计数法分析转染效率;悬浮转染p Luc(luciferase基因来自Renilla)质粒与PEI的复合物,利用分光光度计分析各细胞的荧光素酶活性;采用3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)比色法分析PEI对293T、Hela、BMSC和PC12细胞的毒性,分析转染效率和细胞毒性之间的相关性。结果293T、Hela、BMSC和PC12细胞的转染效率分别为(92.1±4.5)%、(29.2±3.4)%、(21.5±2.1)%和(17.0±3.2)%。293T、Hela、BMSC和PC12细胞的荧光素酶活性分别是2.87×108、3.35×107、1.94×107和1.08×107RLU·mg protein-1。293T、Hela、BMSC和PC12细胞转染效率排序:293T>Hela>BMSC>PC12细胞。同时,MTT比色法结果表明细胞毒性排序:293T>Hela>BMSC>PC12细胞。转染效率与细胞毒性呈正相关(r=0.865,P<0.05)。结论 PEI对不同细胞株的转染效率和细胞毒性存在一定的正相关性。     

聚乙烯亚胺介导的报告基因在体外转染效率的研究

目的　探讨阳离子聚合体载体PEI2 5 (分枝状 ,2 5KDa)在体外的转染效率。方法　PEI2 5和LipofectamineTM2 0 0 0作为转染试剂 ,瞬时转染CHO细胞系 ,通过检测荧光素酶来评估PEI和LipofectamineTM2 0 0 0的转染效率。结果　当N P =5 ,6 ,7时 ,PEI2 5的转染效率与LipofectamineTM2 0 0 0相比无显著性差异 (P >0 .0 5 )。结论　经济实用的PEI适用于体外的瞬时转染。     

聚乙烯亚胺/DNA复合物处方工艺优化及体外转染效率

目的： 考察聚乙烯亚胺（PEI）相对分子质量、氮磷比（N/P比）、溶剂、离子强度等对PEI/DNA复合物形成、表面性质以及细胞转染效率的影响。 方法： 制备不同相对分子质量PEI/DNA复合物,通过凝胶电泳和紫外吸收检测确定PEI与DNA的复合能力（N/P比）,测定不同溶剂、离子强度下的粒径和Zeta电位,考察复合物在HepG2细胞中的转染情况。 结果： PEI与DNA的复合能力与PEI的相对分子质量呈正相关,不同溶剂、离子强度会影响复合物的表面性质,以磷酸盐缓冲液（PBS）为溶剂、PEI（25 kD）为载体、N/P比为12～15时,PEI/DNA复合物细胞转染效率明显优于质粒DNA,仅略低于阳性对照组。 结论： 经优化的PEI/DNA复合物可显著提高DNA在细胞中的转染效率。     

多聚乙烯亚胺——一种标记组织细胞中阴离子的探针

细胞及组织中阴离子分布的变化在疾病发生发展中所起的作用已经受到重视，现有研究表明细胞表面及基底膜中的阴离子是“电荷屏障”，对带有不同电荷的物质有选择性通透作用，在维持细胞的正常生理功能方面也有重要作用。本文介绍一种敏感性强并能较精确定位细胞及组织中阴...     

A549细胞转染esp1基因后生物学行为的变化

目的:观察A549细胞转染esp1基因后细胞生物学行为的改变.方法:将IRE-EGFP-esp1质粒用FuGENE 6脂质体转染到肺腺癌细胞A549,经G418筛选获得转染阳性的细胞系(esp1-A549).采用DNA荧光染色流式细胞仪分析转染后细胞DNA含量、倍性及细胞周期,计算S期细胞比率(SPF)和DNA指数(DI);采用细胞表面磷脂酰丝氨酸检测法和闪烁计数法分别检测细胞凋亡和增殖情况,同时检测软琼脂集落形成能力.以未转染(A549)、转染空载体(neo-A549)的细胞作对照.结果:与其他2组比较,esp1-A549细胞的DI、SPF及细胞增殖率降低,细胞凋亡率升高.esp1-A549细胞软琼脂集落形成数为3.5±0.6,克隆形成率为12.5%,低于A549细胞的23.3±0.2(t=4.93,P=0.004)和46%.结论:esp1基因的上调表达对A549细胞部分恶性生物学表型具有一定的抑制作用.     

FasL基因转染Hela细胞体外诱导淋巴细胞凋亡的作用

目的 应用FasL基因转染具有上皮细胞特性的Hela细胞，探讨FasL基因的表达对诱导同种异体淋巴细胞凋亡的作用，为解决同种异体组织工程化皮肤的免疫排斥问题提供一条研究途径。方法 PLNCX2-FasL质粒转化大肠杆菌，抽提纯化的PLNCX2-FasL质粒用限制性内切酶xho Ⅰ，Not Ⅰ酶切，琼脂糖凝胶电泳得到755bp大小的目的条带。紫外灯下切割回收目的条带并抽提纯化得到FasL基因，用xhoⅠ，Not Ⅰ酶切PCDNA3．1质粒载体并在相同位点插入FasL基因，T4酶连接，构建PCDNA3．1-FasL重组质粒。脂质体转染法将PCDNA3．1-FasL基因转染Hela细胞，G418筛选；经过免疫细胞化学法，RT-PCR鉴定后，进行单项淋巴细胞混合试验，检测FasL基因对诱导淋巴细胞凋亡的作用。结果 表达FasL基因的Hela细胞的淋巴细胞刺激指数较对照组转染空白质粒的Hela细胞下调，仅达到对照组刺激指数的17．0l％。结论 FasL基因转染上皮细胞可诱导淋巴细胞凋亡，为研究避免同种异体组织工程化皮肤的免疫排斥提供了一种可行的方法和设想。     

稳定表达猪α1,3-半乳糖苷基转移酶基因的人肺腺癌细胞系的建立和鉴定

目的 建立稳定表达中国近交系版纳微型猪(BMI)α1,3-半乳糖苷基转移酶基因(α1,3-GT)和α-半乳糖基(Gala1-3Galb1-4GlcNAc-R,α-gal)的人肺癌细胞株,为进一步研究人体血清经补体依赖的细胞毒性作用杀伤表达异种移植抗原的肿瘤细胞提供细胞模型.方法 将含有版纳微型猪α1,3-GT基因的pEGFP-CMV-GT质粒经脂质体法体外转染人肺腺癌细胞A549,G418筛选稳定表达的细胞克隆并扩增,命名为A549-GT.用RT-PCR检测A549-GT中α1,3-GT基因的mRNA表达,荧光显微镜和流式细胞仪检测α1,3-GT在细胞膜表面合成α-gal表位的能力以及A549-GT与人血清中IgM和补体C3结合情况.检测转染细胞形态学、生长增殖能力以及裸鼠成瘤性等生物学特征.结果 经G418反复筛选获得了稳定转染α1,3-GT基因的A549-GT的细胞系,该细胞中检测到α1,3-GT mRNA和α-gal表达.A549-GT传代至今已2年,α-gal表达的阳性细胞达80.1%±3.2%.A549-GT细胞能与人血清中的IgM结合并有补体C3沉积.其生物学特性与亲代A549细胞相比未发生变化.结论 成功获得持续稳定表达猪α1,3-GT和α-gal的细胞系A549-GT,为该基因在后续肿瘤免疫治疗中的研究提供有用的细胞研究模型.     

潜在抑癌基因TXNIP对胃癌MKN-45细胞生物学特性的影响

目的:探讨硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)基因对胃癌MKN-45细胞生物学特性的影响,阐明TXNIP与胃癌发生发展的关系。方法:将TXNIP基因插入载体pcDNA3.1构建PC-TXNIP真核表达载体,并将其转染胃癌MKN-45细胞建立稳定转染细胞系(MKN-TXNIP),利用RT-RCR法、免疫细胞化学法检测转染细胞中的TXNIP基因及细胞原位蛋白表达。每种检测实验均分为MKN-TXNIP组、MKN-PC组和MKN-45组(空白对照组)。采用生长曲线法、平板克隆形成实验法、流式细胞术和Transwell小室实验法等检测稳定表达TXNIP胃癌细胞株生长、增殖状态、细胞周期和侵袭能力等生物学特性。结果:与MKN-PC组和MKN-45组比较,MKN-TXNIP组中TXNIP基因可稳定表达。与MKN-PC组和MKN-45组比较,MKN-TXNIP组稳定表达的细胞株生长速度明显减慢(P<0.05)。平板克隆形成实验,MKN-TXNIP组细胞平均克隆形成率明显低于其他2组(P<0.05)。细胞周期检测,与MKN-45组比较,MKN-TXNIP组处于G₀/G₁期的细胞百分比明显升高(P<0.05),而处于G₂/M期的细胞百分比明显降低(P<0.05)。流式细胞术,各组细胞的凋亡率均约为2.0%,各组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。Transwell小室实验,MKN-TXNIP组MKN-45细胞穿膜率低于其他2组(P<0.05)。结论:TXNIP基因对胃癌细胞增殖、分裂及侵袭转移能力可能具有抑制作用,并可同时影响胃癌细胞的细胞周期,但其对细胞凋亡的影响作用较小。     

原代绒毛滋养层细胞的培养及转染研究

目的 探索绒毛组织滋养层细胞原代培养、纯化的有效方法及最佳转染方法.方法 分离妊娠7周内的人工流产胚胎的绒毛组织进行滋养层细胞的培养和纯化.用细胞免疫化学方法对培养细胞进行鉴定;用MTT实验方法绘制滋养层细胞的生长曲线;用细胞贴壁率找到最适pH;用细胞存活分数评价转染的最佳脂质体用量.结果 成功寻找到滋养层细胞原代培养和纯化的有效方法;细胞消化传代后的12～48 h滋养层细胞处于对数生长期,pH 6.8～7.0为培养液最适pH范围;并找到质粒转染滋养层细胞的最佳脂质体用量.结论 成功培养和纯化滋养层细胞,并找到滋养层细胞的最佳转染方法.     

蛇床子素诱导人肺腺癌细胞进入G2/M阻滞并引起凋亡性死亡

目的 探讨蛇床子素(osthole)对人肺癌细胞A549的杀伤作用及其机制。方法 将人肺癌细胞A549用不同浓度的蛇床子素治疗后,采用MTT法检测蛇床子素对A549细胞增殖的抑制作用;通过流式细胞术检测A549细胞内DNA的含量测定蛇床子素对A549细胞周期的影响、蛇床子素处理后A549细胞凋亡情况;Western blot检测蛇床子素处理后A549细胞周期相关蛋白p-Cdc2和Cyclin B1及凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的表达。结果 蛇床子素对A549细胞增殖的抑制效应呈剂量依赖性,50μM、100μM、150μM的蛇床子素组增殖抑制率分别为(25.4±3.2)%、(40.2±3.7)%、(63.7±4.5)%。蛇床子素对A549细胞的凋亡诱导效应也呈剂量依赖性,50μM、100μM、150μM的蛇床子素组凋亡率分别为(9.4±1.4)%、(17.3±2.5)%、(22.9±3.3)%。蛇床子素处理后A549细胞周期相关蛋白p-Cdc2、Cyclin B1及抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著下降,Bax表达显著增高。结论 蛇床子素可诱导人肺腺癌细胞进入G2/M阻滞,并引起肿瘤细胞凋亡性死亡。     

hR24L基因转染对MCF7细胞周期的影响

目的　通过观察人类DNA损伤修复基因hR2 4L转染对MCF7细胞增殖周期的影响 ,进一步了解其功能及作用机制。方法　分别用正义和反义hR2 4L逆转录病毒表达载体(pDor-neo)重组体转染MCF7细胞 ,观察细胞生长速度 ,用Northern印迹杂交检测hR2 4L基因的表达情况 ,并用流式细胞仪检测细胞周期。结果　与转染空载体的细胞相比 ,转染正义hR2 4L重组体的细胞生长较慢 ,其hR2 4LmRNA的表达增加 ;而转染反义hR2 4L重组体的细胞生长较快 ,其hR2 4LmRNA的表达则降低 ;转染后 6h流式细胞仪检测表明 ,转染正义hR2 4L重组体的细胞G2 +M期的比例 (18% )明显高于其它 3种细胞 (6 % )。结论　hR2 4L基因的表达抑制了细胞生长 ,其机制是引起细胞周期阻滞 ,参与细胞周期调控。     

FATE/BJ-HCC-2基因转染对肿瘤细胞生物学行为的影响

目的:观察FATE/BJ-HCC-2基因对肿瘤细胞生物学行为的影响,探讨FATE/BJ-HCC-2与肿瘤进展之间的关系。方法:将FATE/BJ-HCC-2基因转染肝癌细胞系Bel-7402细胞,3H-TdR掺入法和Transwell实验对转染细胞的增殖和侵袭能力进行检测;PCR方法检测细胞内的骨桥蛋白(OPN)和整合素连接激酶(ILK)基因的表达水平。结果:细胞增殖实验结果显示FATE/BJ-HCC-2转染肿瘤细胞的3H-TdR掺入值显著高于Mock细胞的掺入值,统计学分析二者差别有显著性意义(P<0.01)。FATE/BJ-HCC-2基因表达促进肝癌细胞系Bel-7402细胞的增殖,并且这种增殖效应可被特异性抗-FATE/BJ-HCC-2抗体所阻断。Transwell实验显示,转染FATE/BJ-HCC-2的细胞,其穿膜数量明显比对照组多,差别有显著的统计学意义(P<0.01)。对肿瘤细胞转移相关的细胞信号分子进行检测发现,骨桥蛋白(OPN)和整合素连接激酶(ILK)基因的表达水平上调。结论:肿瘤细胞获得FATE/BJ-HCC-2基因表达后其增殖和侵袭能力增强,FATE/BJ-HCC-2基因表达可能与肿瘤细胞的转移有一定关系。提示CT抗原的表达不仅仅是肿瘤发生中的伴随产物,它可能在肿瘤的发生发展过程中起到一定作用。     

人血管内皮细胞生长因子165基因转染大鼠内皮祖细胞的实验研究

目的探讨人血管内皮细胞生长因子165（hVEGF165）基因转染骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）及对其影响。方法体外分离、培养、鉴定大鼠骨髓EPCs,ELISA检测转基因EPCs表达VEGF蛋白,MTT法检测对其增殖的影响。结果FITC-UEA-I和DiI-ac-LDL荧光双染证实分化的EPCs,脂质体介导pcDNA3-hVEGF165质粒转染组EPCs培养基上清中表达VEGF,hVEGF165基因转染促进EPCs增殖,注射转基因EPCs的大鼠皮下局部血管增加。结论hVEGF165基因可成功转染EPCs,并且具有血管内皮增殖刺激活性,为进一步研究hVEGF165基因修饰EPCs治疗血管内膜损伤性疾病提供实验依据。     

体外培养小脑浦肯野神经元转染及条件的优化

目的 探讨用化学转染试剂体外转染小脑浦肯野神经元的最佳转染条件.方法 体外分离培养E18 d的昆明小白鼠的小脑浦肯野神经元,用lipofectamineTM2000、磷酸钙沉淀试剂、Effectene转染试剂包被质粒分别转染体外培养7 d的浦肯野神经元.另外,用lipofectamineTM2000包被质粒,分别转染7、14、21 d以及28 d浦肯野神经元.每组分为5个样本.48 h后观察绿色荧光蛋白的表达情况,并用台盼兰检测细胞的存活率.结果 (1)3种转染试剂的最高转染率分别为lipofectamineTM2000(19.63±5.76)%、磷酸钙沉淀法(1.84±1.85)%、Effectene(1.48±1.38)%.lipofectamineTM2000与其他两种方法的转染率均有显著差异.(2)2 μl的lipofectamineTM2000的转染效率为(15.11±4.01)%,细胞存活率与对照组没有明显差异,为(92.98±2.10)%.(3)培养早期(7 d、14 d)的浦肯野神经元损伤小,与对照组没有明显差异.结论 该实验首次证实了lipofectamineTM2000能有效地转染体外培养的小脑浦肯野神经元.不同的发育阶段对转染效率也有较大的影响,lipofectamineTM2000比较适合早期的浦肯野神经元转染.