诊断超声提高脂质体介导血管内皮生长因子基因转染的体外实验

目的 研究超声破坏微泡造影剂的方法提高脂质体介导的血管内皮生长因子(VEGF)基因在内皮细胞中转染率的可行性。方法 脂质体介导VEGF基因转染1h后，将6孔板中的内皮细胞每孔加入造影剂10μl或100μl或500μl，然后置于水槽中，暴露在超声下30s、60s、90s。2d后，用荧光显微镜观察标记基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达。结果 超声照射细胞30s和60s，EGFP基因表达显著提高，照射90s时杀死了大多数细胞。每孔加入微泡造影剂100μl时，其在超声作用下产生的空化作用提高了基因转染效率，造影剂为500μl时，细胞死亡率较高。结论 超声破坏微泡造影剂可以提高脂质体介导的基因细胞转染效率，为今后治疗基因的体内转染提供了经验。     

PEI与脂质体介导基因转染的比较研究

目的：比较新型转染试剂阳离子聚合物聚乙烯亚胺（PEI）与脂质体2000介导的血管内皮细胞生长因子 VEGF165基因转染人胚肾细胞293T 的转染效率,为基因转染提供新的方法。方法分别采用脂质体和不同 N／P 比值的 PEI 将合成的含有绿色荧光蛋白（GFP）和 VEGF165的质粒转入293T 细胞。转染24 h 后,采用 CCK-8试剂盒检测细胞活性;转染48 h 后在荧光显微镜下观察比较两种转染方法的转染效率,并通过 ELISA 方法检测细胞上清液中 VEGF165浓度,比较两种方法的转染效果。结果当 N／P＝9时,PEI 转染的细胞活性与脂质体转染相近,对细胞的毒性较小;此时,PEI 转染效率与脂质体也相似,均可达到约70％;同样,转染后细胞上清中 VEGF165浓度较未转染组提高（P ＜0．05）,但两种方法转染组间比较差异无统计学意义（P ＞0．05）。结论PEI 作为一种新型的转染试剂,与脂质体相比,在一定比例范围内,具有转染效率高,对细胞毒性小且价格低廉的优势,有望成为基因转染的有效载体。     

超声波介导微泡破裂促EGFP基因转染大鼠脑组织的实验研究

目的 探讨超声波介导微泡造影剂破裂促外源基因在中枢神经系统转染的可行性.方法 15只大鼠分3组,1组经股静脉输入含绿色荧光蛋白质粒(pEGFP)的造影剂0.8 ml,立即用超声波照射大鼠颅骨3 min;第2组输入相同的造影剂0.8 ml,不采用超声波照射;第3组输入不含造影剂的pEGFP 0.2 ml,立即超声波照射3 min.48 h后处死大鼠,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达.结果 只在股静脉输入含pEGFP的造影剂,并经超声波照射的大鼠微血管壁上观察到绿色荧光蛋白表达.结论 以微泡造影剂为基因载体,通过超声波靶向破坏微泡,有可能在脑血管内皮细胞中获得基因转染.     

纳米载体介导人胰岛素样生长因子1基因转染兔骨髓间充质干细胞及其表达

目的:构建增强型绿色荧光蛋白基因(enhanced-green fluorescent protein,EGFP)标记的人胰岛素样生长因子(human insulin-like growth factor, hIGF-1)真核表达载体,转染至兔骨髓间充质干细胞,为组织工程关节软骨的构建提供基因改良的种子细胞.方法:实验于2005-03/2006-01在重庆医科大学儿科研究所完成.根据GeneBank公布的hIGF-1序列设计PCR引物,从质粒pcDNA3.1-hIGF-1中扩增出截短型hIGF-1,亚克隆至pMD-T18载体,测序鉴定后酶切出目的基因片段并插入pIRES2-EGFP中,构建成真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1,经PCR及双酶切鉴定正确后用非病毒类纳米材料基因转移载体PAMAM-D介导转入兔骨髓间充质干细胞,通过荧光观察、流式细胞仪、RT-PCR等方法从各个水平检测hIGF-1在细胞的表达.结果:成功构建了增强型绿色荧光蛋白基因标记的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hIGF-1,并检测到目的基因hIGF-1在兔骨髓间充质干细胞的理想表达.结论:新型纳米材料PAMAM-D是高效、简便、表达持久的基因转染方法,经IGF-1基因修饰的骨髓间充质干细胞是软骨组织工程种子细胞的理想选择.     

大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞的体外培养与鉴定

目的:目前内皮祖细胞主要从骨髓、脐带血和外周血获取,但其分离培养方法尚不成熟,外周血来源因损伤小、易获取而被普遍使用,但得到的内皮祖细胞纯度较低.实验拟探讨大鼠骨髓来源内皮祖细胞体外培养、诱导扩增和生物学特性鉴定方法.方法:实验于2006-08/2007-08 在南昌大学第一附属医院泌外研究所完成.①实验材料:2周龄SD大鼠由南昌大学医学院动科部提供,雌雄不拘,清洁级,实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:应用梯度离心法采集大鼠骨髓单个核细胞,贴壁筛选法分离内皮祖细胞,置于添加了血管内皮细胞生长因子、人碱性成纤维细胞生长因子、白血病抑制因子、表皮生长因子的M199培养液中扩增培养,对培养2周的细胞采用免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、血管内皮生长因子受体-2、CD34、CD133, 采用RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因表达.结果:①培养4 d,光电显微镜下可见细胞集落形成,梭形贴壁细胞从集落中央以放射状向外周生长.培养7～10 d,细胞集落相互连接,呈典型的"鹅卵石"样外观.2周左右可见细胞排列成条索状结构并可呈"微血管样"排列生长.②贴壁细胞免疫荧光染色鉴定细胞标志物血管性血友病因子、FLK-1、CD34、CD133阳性,RT-PCR法检测内皮细胞特异性分子标志血管性血友病因子、FLK-1、Tie-2、CD34、CD133、eNOS基因阳性表达.结论:采用梯度离心法从骨髓中分离单个核细胞,经诱导培养可实现内皮祖细胞的分离培养和体外扩增.     

增强型绿色荧光蛋白基因与人血管内皮生长因子受体KDR基因胞外1-3区域融合表达载体的构建

目的构建增强型绿色荧光蛋白（EGFP）与人血管内皮生长因子受体KDR基因胞外1—3区域（KDRn3）的融合基因真核表达载体，为研究KDRn3在抑制视网膜新生血管性疾病中的作用奠定基础。方法以质粒pcDNA3．1／KDRn3为模板，PCR扩增KDRn3基因，将目的片段克隆至pMD18-T载体，其产物双酶切后连接到质粒pEGFP-N1。结果酶切及琼脂糖电泳分析表明提取及纯化的重组质粒含有目的基因片段，大小正确。结论成功构建了EGFP与人KDRn3的融合基因真核表达载体pEGFP-N1／KDRn3。     

多药耐药基因MDR1转染胎盘源间充质干细胞的研究

目的 将全长外源多药耐药基因转入间充质干细胞使其外源基因得以表达。方法 从胎盘组织中分离培养间充质干细胞，构建携带全长外源多药耐药基因的逆转录病毒，将此逆转录病毒转染间充质干细胞，绿色荧光显微镜检测外源基因的表达，westem blot检测MDR1基因表达产物。结果 绿色荧光显微镜可观测到转染后间充质干细胞有绿色荧光蛋白的表达，westem blot检测到全长多药耐药基因编码的p-糖蛋白的表达。结论 mdr1逆转录病毒载体可有效转染人胎盘源MSC，转染的外源基因可充分表达。     

内皮祖细胞内皮修复的影响因素

内皮祖细胞（EPC）来源于骨髓,能够定向分化为成熟有功能的血管内皮细胞,是血管内皮细胞的前体细胞,又称血管母细胞。内皮祖细胞在组织缺血和血管损伤时动员入血,促进微血管的生成和血管内皮的修复,不仅参与胚胎血管生成,也参与出生后的血管发生过程,具有保护血管内皮、减少心血管疾病的发生率和死亡率的作用。许多试验证实冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）和心力衰竭患者EPC数量减少,外周循环内皮细胞功能受损。研究发现,EPC的生物学特性受到诸多冠心病危险因素的影响,致使其功能异常。     

血管内皮祖细胞生物学活性与血管内皮祖细胞捕获支架的研究进展

血管内皮祖细胞（EPCs）作为内皮细胞的前体细胞,具有"持续"的自我更新及定向分化的能力。EPCs捕获支架,如表面包被CD34^＋抗体的支架,能够识别循环血液中EPCs表面特异性性结合位点,捕获并促使EPCs归巢、分化为内皮细胞,参与病变血管内皮修复、促进血管新生、改善冠脉血流。EPCs的生物学活性是决定EPCs捕获支架临床应用的关键,本文从EPCs生物学特性、功能、冠状动脉微环境对EPCs的调控机制、EPCs捕获支架的研究进展等方面进行综述,探讨EPCs捕获支架的治疗价值。     

脓毒症患者外周血祖细胞和内皮祖细胞数量的变化

目的 检测脓毒症患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuelear cell,PBMC)中祖细胞和血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPC)相对数量的变化,探讨感染性休克和非休克患者外周血EPC变化的特点.方法 收集2007年8月至2008年2月复大学附属中山医院急诊科收治的脓毒症患者27例进行前瞻性研究,其中感染性休克患者12例、非休克患者15例,另选10例健康成年人作为正常对照,ICU非脓毒症患者10例作为ICU对照.Ficoll梯度离心法分离外周血PBMC,通过流式细胞仪检测外周血PBMC标记的CDl33,CIY34和血管内皮牛长因子受体-2(vascular endothelialgrowth factor receptor-2.VEGFR-2)的表达情况,计算祖细胞以及内皮祖细胞的相对数量.组间比较采用单因素方差分析.结果 健康成年人外周血祖细胞、EPC数量较少,分别占PBMC的0.25%.4-0.14%和0.09%.4-0.02%;ICU非脓毒症患者祖细胞和EPC数量分别占PBMC的0.38%.4-0.29%和0.12%.4-O.02%,与正常对照组相比无明显的变化(P>0.05);脓毒症非休克组患者外周血祖细胞、EPC的数量明显增加,分别占PBMC的0.57%±0.12%和0.22%±0.10%,与正常对照组相比差异具有统计学意义(P<0.05);感染性休克患者外周血祖细胞和EPE的数量明显减少,分别占PBMC的0.20%.4-0.12%和0.04%±O.01%,与非休克组、ICU对照组和正常对照组相比差异均具有统计学意义(P相似文献   

肺动脉高压模型大鼠循环内皮祖细胞与血浆一氧化氮水平相关性的实验研究

目的 探讨肺动脉高压(PH)模型大鼠循环内皮祖细胞(EPC)水平的变化及其与血浆一氧化氮(NO)浓度的关系.方法 利用野百合碱诱导大鼠发生肺动脉高压,使用流式细胞仪对其外周血CD45 阴性、CD34/Flk-1 双阳性的单个核细胞计数,以表示循环EPC,采用Greiss 法对其血浆NO 浓度进行检测.利用简单线性回归分析二者之间的关系.同时,对体外培养条件下循环EPC 的产量,CD34、Flk-1 的表达情况进行检测.结果 PH 模型组循环EPC 水平明显低于对照组[(0.016 ±0.007)% vs.(0.031 ±0.011)%,t ＝3.144,P ＜0.01].血浆NO 浓度亦显著下降[(19.66 ±2.78)μmol/L vs.(54.31 ±3.81)μmol/L,t ＝20.784,P ＜0.01].二者之间呈正相关(r ＝0.792,P ＜0.05).在体外培养条件下,PH 模型组EPC 的数量以及CD34、Flk-1 的表达亦较对照组明显下调.结论 PH 的发生可能与血浆NO 浓度降低导致循环EPC 水平下调有关.     

CM-Dil标记肝纤维化大鼠骨髓源性内皮祖细胞实验研究

目的 探讨建立CM-Dil荧光标记的肝纤维化大鼠骨髓源性内皮祖细胞的方法.方法 Wistar大鼠16只,四氯化碳皮下注射建立肝纤维化大鼠模型,分离培养肝纤维化大鼠骨髓源性内皮祖细胞,分为实验组和对照组,实验组采用CM-Dil荧光进行标记内皮组细胞,对照组未进行标记.采用激光共聚焦显微镜、流式细胞分析仪检测CM-Dil荧光标记率,观察2组细胞生长状态和细胞动力学.结果 实验组CM-Dil标记的细胞呈红色荧光,标记阳性率为96.95％;实验组细胞生长状态良好,与对照组比较,生长曲线无明显改变.结论 CM-Dil可在体外成功标记肝纤维化大鼠骨髓源性内皮祖细胞.     

Reduced circulating endothelial progenitor cells in reversible cerebral vasoconstriction syndrome

Background

The pathophysiology of reversible cerebral vasoconstriction syndrome (RCVS) remains elusive. Endothelial dysfunction might play a role, but direct evidence is lacking. This study aimed to explore whether patients with RCVS have a reduced level of circulating circulating endothelial progenitor cells (EPCs) to repair the dysfunctional endothelial vasomotor control.

Methods

We prospectively recruited 24 patients with RCVS within one month of disease onset and 24 healthy age- and sex-matched controls. Flow cytometry was used to quantify the numbers of circulating EPCs, defined as KDR⁺CD133⁺, CD34⁺CD133⁺, and CD34⁺KDR⁺ double-positive mononuclear cells. The Lindegaard index, an index of vasoconstriction, was calculated by measuring the mean flow velocity of middle cerebral arteries and distal extracranial internal carotid arteries via color-coded sonography on the same day as blood drawing. A Lindegaard index of 2 was chosen as the cutoff value for significant vasoconstriction of middle cerebral arteries based on our previous study.

Results

Patients with RCVS had a reduced number of CD34⁺KDR⁺ cells (0.009 ± 0.006% vs. 0.014 ± 0.010%, p = 0.031) but not KDR⁺CD133⁺ cells or CD34⁺CD133⁺ EPCs, in comparison with controls. The number of CD34⁺KDR⁺ cells was inversely correlated with the Lindegaard index (rs = -0.418, p = 0.047). Of note, compared to controls, patients with a Lindegaard index > 2 (n = 13) had a reduced number of CD34⁺KDR⁺ cells (0.007 ± 0.005% vs. 0.014 ± 0.010%, p = 0.010), but those with a Lindegaard index ≤ 2 did not.

Conclusions

Patients with RCVS had reduced circulating CD34⁺KDR⁺ EPCs, which were correlated with the severity of vasoconstriction. Endothelial dysfunction might contribute to the pathogenesis of RCVS.     

脉冲电磁场对原代大鼠骨髓来源内皮前体细胞生长及分化的影响

目的探讨脉冲电磁场对内皮前体细胞增殖及分化的影响。方法采用密度梯度离心法分离SD大鼠骨髓内皮前体细胞，将细胞分为对照组及磁场组。磁场组细胞于培养第5天后给予低频脉冲电磁场干预，直至培养终点。细胞增殖活性采用MTT法测定，用流式细胞仪检测Ⅷ因子相关抗原、NOS，表达阳性细胞。结果从磁场作用第5天开始，磁场组细胞增殖活性明显高于对照组；磁场作用第3天时，磁场组细胞Ⅷ因子相关抗原、NOS，表达阳性细胞数量均明显高于对照组，这种增高趋势持续至培养终点。结论低频脉冲电磁场可促进大鼠骨髓来源内皮前体细胞的增殖及分化。     

低体重早产儿内皮祖细胞体外血管生成能力研究

目的：探讨低体重早产儿的内皮祖细胞（endothelial progenitor cells, EPCs）血管生成能力及调控机制。方法：收集15例低体重早产儿（胎龄小于37周且体重小于 2.5 kg）和19例对照足月儿（胎龄大于37周且体重大于等于2.5 kg）的脐带血,于诱导分化前用流式细胞仪检测EPCs（CD34⁺/CD133⁺/VEGFR2⁺）的数量。分离培养后,检测EPCs克隆形成时间、克隆形成能力、细胞增殖能力和小管形成能力。用蛋白印迹法检测EPCs中血管内皮钙粘蛋白（vascular endothelial cadherin,VE-cadherin）和血管内皮生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptors 2,VEGFR2）的表达情况。结果：与足月儿相比（0.003%±0.002%）,低体重早产儿脐带血中的EPCs百分比（0.0026%±0.0025%）并无变化,但EPCs克隆形成时间推迟（18 d比12 d）,克隆形成能力、细胞增殖能力及小管形成能力均较足月儿下降（P均<0.05）。蛋白印迹法检测结果显示,低体重早产儿脐带血EPCs中的VE-cadherin和VEGFR2表达降低。结论：低体重早产儿的EPCs血管生成能力受损,可能与EPCs中血管内皮特异性标志物VE-cadherin、VEGFR2表达降低有关。     

内皮祖细胞对兔急性肺损伤血管通透性的影响

目的 观察并分析内皮祖细胞对急性肺损伤兔肺血管通透性的影响。方法 将96只雄性新西兰兔分为4组：空白对照组（BC组,16只）、空白对照＋内皮祖细胞治疗组（BC＋EPC组,16只）、急性肺损伤组（ALI组,32只）、急性肺损伤＋内皮祖细胞治疗组（ALI＋EPC组,32只）。ALI组和ALI＋EPC组兔注射乳化油酸建立模型,造模成功后0．5h,ALI-EPC组和BC＋EPC组各注射约10^6个内皮祖细胞的PBS液。所有实验动物予注射乳化油酸前（哪及建立急性肺损伤模型后0．5h（T。）、6h（T2）、12h（T3）、24h（T4）、48h（T5）分别监测氧分压（PaO2）。ALI组和ALI＋EPC组兔在T2至T5,BC组和BC＋EPC组在T4至T5时间点分别处死8只兔,比较各组兔的肺湿干重比值、肺泡灌洗液（BALF）蛋白含量、肺毛细血管通透指数（LPI）、肺泡病理评分（DAD）及组织病理检查在实验前、后的变化。结果ALI＋EPC组BALF蛋白含量在T2至T5时均较ALI组显著降低,氧分压、肺湿干重比值与LPI在T3至T5时与ALI组比较差异有统计学意义,而DAD评分仅在T4和L时较ALI组显著降低（P均〈0．05）。而BC组与BC＋EPC组各指标在各时间段之间比较差异均无统计学意义（P均〉0．05）。T5时,ALI＋EPC组病理图中炎症细胞及蛋白质渗出较Au组明显好转。结论 内皮祖细胞可以改善急性肺损伤兔肺的血管通透性。