结晶型硫化镍及反式-BPDE恶性转化16HBE细胞hMSH2基因甲基化的研究

背景与目的： 对结晶型硫化镍(Nickel sulfide,NiS)及反式二氢二醇环氧苯并芘(anti-7,8,-dihydrodiol-9,10-epoxide benzo[a] pyrene,BPDE)恶性转化及成瘤的人支气管上皮细胞(Human bronchial epithelial,16HBE)hMSH2基因启动子甲基化状况及其mRNA表达进行研究,探讨镍及反式-BPDE的表遗传致癌机制。材料与方法： 采用甲基化特异性PCR(Methylation-specific PCR,MSP)法和RT-PCR法检测结晶型NiS及反式-BPDE恶性转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因启动子甲基化状况及其mRNA表达,与非转化的16HBE细胞进行比较;并用去甲基化因子5-Azac(5-Aza-2′-deoxycytidine)处理有异常甲基化的细胞。 结果： 发现结晶型NiS及反式-BPDE恶性转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因启动子区存在CpG岛的高甲基化;与非转化16HBE细胞比较,转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因mRNA表达下降;有异常甲基化的细胞经去甲基化处理后甲基化消失。结论： 结晶型NiS及反式-BPDE恶性转化及成瘤的16HBE细胞hMSH2基因启动子区CpG岛的高甲基化使其mRNA表达下降,并可能导致hMSH2基因表达抑制,这可能是结晶型NiS及反式-BPDE诱导16HBE细胞转化和成瘤的一种表遗传致癌机制。甲基化的可逆性对今后研究其表型逆转以及药物治疗提供了重要依据。     

乙酸镍对人支气管上皮细胞系的恶性转化研究

目的：建立乙酸镍(niekel acetate)对永生化人支气管上皮细胞系(16BHE)的恶性转化模型，为下一步关于镍化合物致癌的分子机制的研究提供相应的恶性转化细胞。方法：通过克隆形成率实验确定乙酸镍对16HBEK细胞转化浓度后，对16HBE细胞进行分阶段多次染毒：每隔20d染毒1次，每次染毒24h。染毒12次后，通过软琼脂集落形成试验和鼠体内致瘤试验鉴定细胞恶性转化程度。结果：经乙酸镍多次处理16HBE细胞至75代时，细胞生长速度加快，排列紊乱，失去接触抑制，出现复层生长，并可在软琼脂上生长，且呈剂量反应关系，但在第75代之前的细胞则不能在软琼脂上生长。转化细胞在裸鼠体内成瘤，病理组织学证实为低分化鳞状细胞癌。结论：乙酸镍具有使16HBE细胞发生恶性转化的能力。     

结晶型NiS诱发恶性转化细胞中的p16基因和FHIT基因的变化

目的 检测结晶型NiS诱发永生化人支气管上皮细胞系(16HBE)恶性转化过程中脆性组氨酸三联体基因(FHIT)和p16基因的变化,探讨镍化合物致癌的分子机制。方法 采用RT-PCR、DNA序列分析、银染PCR—SSCP方法检测恶性转化细胞、成瘤细胞中FHIT基因和p16基因的变化。结果 与对照组16HBE相比,转化细胞、成瘤细胞p16基因第2外显子、第2-3外显子末见突变,mRNA表达末见异常;FHIT基因第5,6,7,8外显子及第1-4外显子、第5-9外显子末见突变,但发现转化细胞、成瘤细胞FHIT基因的mRNA失表达或出现异常转录本;对其中FHIT基因第5-9外显子的一异常转录本测序分析显示,FHIT第6,7,8外显子缺失,第5,9外显子异常拼接,且中间插入一个36bp的小片段。结论 在结晶型NiS诱发16HBE恶性转化过程中,p16基因在DNA和mRNA水平末见异常改变,提示p16基因在镍致癌过程中可能不发挥作用;FHIT基因在mRNA水平出现缺失或异常转录本,表明FHIT基因在镍致癌过程中可能发挥一定作用;镍诱导的FHIT基因异常,可能是将外源致癌物、染色体脆性部位不稳定性和细胞恶变相联系起来的一个分子事件,FHIT基因可能是镍等外源致癌物作用的主要靶基因之一。     

EB病毒编码的BARF1基因在人上皮细胞恶性转化中的作用

背景与目的:EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)的BamHⅠA区域的早期基因BARF1能使猴肾上皮细胞永生化,使人淋巴细胞和呲类动物的成纤维细胞发生恶性转化,但有关该基因在人上皮细胞肿瘤发生发展中的作用未见报道。本研究的目的是观察EBV-BARF1基因对人上皮细胞生长特性的影响及能否使之发生恶性转化。方法:构建真核重组表达载体pcDNA3-BARF1,转染人支气管上皮细胞(HBE),建立稳定表达BARF1基因的HBE细胞株;观察细胞生长状况、生长速度、在软琼脂中集落形成能力及对裸鼠的致瘤能力。结果:EBV-BARF1基因转染细胞生长旺盛,失去接触抑制能力,生长速度增快,并在裸鼠体内成瘤。结论:EBV的早期基因BARF1作为病毒的癌基因,在支气管上皮细胞的恶性转化中可能起着重要作用。     

60C0γ射线诱发人支气管上皮细胞恶性转化模型的建立

目的:建立γ射线辐射诱导支气管上皮细胞恶性转化模型。方法:永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B经总剂量22 Gy ~(60)Coγ射线分3次照射后进行传代培养,应用平板克隆实验、血清抗性实验、细胞软琼脂集落实验检测该细胞系恶性程度;裸鼠皮下种植辐射细胞检测其成瘤能力,成瘤组织H-E染色及免疫组化进行病理学观察。结果:(1)平板克隆实验表明照射细胞培养至35代后其增殖能力明显增加(P<0.05或P<0.01),血清抗性实验显示照射组细胞在第45代后克隆形成增加(P<0.01),而在照射后50代细胞软琼脂集落的形成能力明显增加(P<0.01),显示BEAS-2B细胞经辐射后出现了恶性转化。(2)皮下种植22 Gy 50代细胞的8只裸鼠50 d后1只成瘤,种植22 Gy 60代辐射细胞的8只裸鼠中有4只成瘤;成瘤组织病理检测及免疫组化证实为上皮细胞癌。结论:成功地建立了~(60)Coγ射线诱导的支气管上皮细胞恶性转化模型。     

结晶型硫化镍诱发细胞恶变过程中端锚聚合酶mRNA的表达

背景与目的:探讨结晶型硫化镍(NiS)诱发人支气管上皮细胞恶变过程中端锚聚合酶(tankyrase)mRNA的变化。材料与方法:用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测细胞tankyrasemRNA的表达。结果:Tankyrase在细胞恶变过程中不同阶段细胞的表达均高于正常细胞。结论:结晶型NiS诱发人支气管上皮细胞恶性转化涉及了tankyrase活性改变,tankyrase活性改变可能是结晶型NiS诱发肺癌的早期分子事件。     

硫化镍转化人支气管上皮细胞基因差异表达芯片的研究

背景与目的近年研究发现硫化镍(NiS)可引起人支气管上皮细胞(humanbronchialepithelialcell,16HBE)发生恶性转化及转化细胞致癌性,其机制可能与NiS引起基因突变、多种转录因子的异常表达有关。为此,本研究利用NiS恶性转化的体外培养细胞模型,用cDNA微阵列技术研究经NiS转化后的16HBE细胞基因的差异表达,从基因组水平探讨NiS所致细胞恶变的相关基因差异改变。方法分别提取16HBE和经NiS单独处理发生转化的NiS16HBE细胞的总RNA,逆转录合成cDNA并以Cy3dCTP和Cy5dCTP荧光素分别标记制作探针。探针混合后与含4000个人类基因的芯片杂交。以ScanArray4000扫描仪扫描芯片,以GenPixPro3.0软件分析荧光信号,然后对差异表达的基因进行生物学信息分析。结果NiS16HBE细胞样本与16HBE细胞样本比较,呈现差异表达的基因有151个(3.78%),其中81个(53.64%)上调,70个(46.36%)下调。结论NiS的转化作用与应激反应基因、免疫相关基因、DNA合成和修复基因、代谢相关基因、原癌基因和抑癌基因等多类基因的异常表达有关。     

^60Coγ射线诱发人支气管上皮细胞恶性转化模型的建立

目的：建立γ射线辐射诱导支气管上皮细胞恶性转化模型。方法：永生化人支气管上皮细胞BEAS-2B经总剂量22Gy^60Coγ射线分3次照射后进行传代培养，应用平板克隆实验、血清抗性实验、细胞软琼脂集落实验检测该细胞系恶性程度；裸鼠皮下种植辐射细胞检测其成瘤能力，成瘤组织H-E染色及免疫组化进行病理学观察。结果：（1）平板克隆实验表明照射细胞培养至35代后其增殖能力明显增加（P〈0．05或P〈0.01），血清抗性实验显示照射组细胞在第45代后克隆形成增加（P〈0．01），而在照射后50代细胞软琼脂集落的形成能力明显增加（P〈0．01），显示BEAS-2B细胞经辐射后出现了恶性转化。（2）皮下种植22Gy 50代细胞的8只裸鼠50d后1只成瘤，种植22Gy 60代辐射细胞的8只裸鼠中有4只成瘤；成瘤组织病理检测及免疫组化证实为上皮细胞癌。结论：成功地建立了^60Coγ射线诱导的支气管上皮细胞恶性转化模型。     

EB病毒的BARF1基因在人支气管上皮细胞恶性转化和肿瘤形成中的作用

目的探讨EBV-BARF1基因对人支气管上皮细胞生长特性的影响,并初步探讨其作用机制。方法构建真核重组表达载体pcDNA3-BARF1,转染人支气管上皮细胞(HBEC),检测BARF1基因的表达,观察细胞生长状况、生长速度,在软琼脂中集落形成能力及对裸鼠的致瘤能力。结果EBV-BARF1基因转染细胞生长旺盛,失去接触抑制能力,生长速度增快,在软琼脂中形成多个集落,并在裸鼠体内成瘤。结论EBV的早期基因BARF1能明显地改变上皮细胞的生物学行为,使细胞发生恶性转化、获得肿瘤细胞的生长特性,该基因不仅与上皮细胞的早期永生化有关,在细胞的恶性转化及肿瘤形成过程中亦可能起重要的作用。     

胡麻油烟凝聚物诱导人胚肺二倍体细胞恶性转化作用

背景与目的:研究胡麻油烟对人体潜在的致癌危险性.材料与方法:以胡麻油烟凝聚物(SOFA)作为受试物染毒人胚肺二倍体细胞,建立体外恶性转化实验系统,对转化细胞进行ConA凝集实验、软琼脂培养实验以及裸鼠体内致瘤实验,观察并检测细胞是否发生恶性变.结果:实验剂量范围内的SOFA(25～400 μg/ml)能够诱导人胚肺二倍体细胞形成细胞恶性转化灶,转化灶细胞生长失去接触抑制性、饱和密度增大、ConA凝集能力增强、锚着依赖性丧失及裸鼠体内具有成瘤性等多种细胞发生恶性变的生物学特性改变.结论:SOFA具有诱导人胚肺二倍体细胞恶性转化的作用,对人体具有潜在致癌作用.     

Epigenetic silencing of O6-methylguanine DNA methyltransferase gene in NiS-transformed cells

Nickel (Ni) compounds are potent carcinogens and can induce malignant transformation of rodent and human cells. To uncover the molecular mechanisms of nickel sulfide (NiS)-induced cell transformation, we investigated epigenetic alterations in a set of DNA repair genes. The silencing of the O(6)-methylguanine DNA methyltransferase (MGMT) gene locus and upregulation of DNA methyltransferase 1 (DNMT1) expression was specifically detected in NiS-transformed human bronchial epithelial (16HBE) cells. In addition, we noted epigenetic alterations including DNA hypermethylation, reduced histone H4 acetylation and a decrease in the ratio of Lys-9 acetylated/methylated histone H3 at the MGMT CpG island in NiS-transformed 16HBE cells. Meanwhile, we identified concurrent binding of methyl-CpG-binding protein 2, methylated DNA-binding domain protein 2 and DNMT1 to the CpG island of the MGMT promoter, demonstrating that these components collaborate to maintain MGMT methylation in NiS-transformed cells. Moreover, depletion of DNMT1 by introduction of a small hairpin RNA construct into NiS-transformed cells resulted in a 30% inhibition of cell proliferation and led to increased MGMT gene expression by reversion of the epigenetic modifications at the MGMT promoter region. MGMT suppression and hypermethylation at the CpG island of the MGMT promoter occurred 6 days after NiS treatment, indicating that epigenetic modifications of MGMT might be an early event in tumorigenesis. Taken together, these observations demonstrate that epigenetic silencing of MGMT is associated with DNA hypermethylation, histone modifications and DNMT1 upregulation, which contribute to NiS-induced malignant transformation.     

乙酸镍诱导的人支气管上皮细胞系转化细胞基因组不稳定性分析

背景与目的：检测乙酸镍对基因组不稳定性的影响，从而进一步探讨镍化合物致癌的分子机制。材料与方法：采用随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA，RAPD)技术来对经乙酸镍在诱导人支气管上皮细胞系(16HBE)的恶变细胞中的基因组不稳定性进行分析。结果：本实验所选用的7条随机引物均能扩增出清晰、明显的条带，条带数在1～6条之间。7条引物中第4、7两条引物扩增的片段在实验组和对照组之间无差异。其余五条引物均有差异，对于同一随机引物它们都具有特异的带型。结论：乙酸镍能诱发16HBE细胞基因组不稳定。     

MALIGNANT TRANSFORMATION IN BALB/c-3T3 CELLS INDUCED BY CRYSTALLINE NICKEL SULFIDE

采用细胞灶法测定结晶型硫化镍对ＢＡＬＢ／ｃ－３Ｔ３诱发细胞转化的活性,结果表明当硫化镍浓度≥０．２５μｇ／ｃｍ２时转化率增高（Ｐ＞０．０５）,且有剂量反应关系。各剂量组转化灶细胞共６份经软琼脂培养试验均获阳性结果,而对照细胞则为阴性,提示硫化镍诱发的转化细胞具有锚着不依赖性,即恶性特征。     

甲基丙烯酸环氧丙酯诱导16HBE细胞恶性转化过程中LncRNA表达特征分析及ceRNA调控网络预测

目的： 筛选甲基丙烯酸环氧丙酯（GMA）诱导人支气管上皮16HBE细胞恶性转化过程中不同时期差异表达的LncRNA并以此为基础构建ceRNA调控网络,分析相关信号通路和生物学功能。方法： 收集用GMA和溶剂DMSO分别处理的16HBE细胞。采用LncRNA芯片检测并分析两组细胞中LncRNA表达量的差异,运用TargetScan和MiRanda数据库筛选出关键的差异表达LncRNA,使用Cytoscape构建以差异表达LncRNA为核心的ceRNA调控网络,之后对差异表达LncRNA的靶基因和通路进行分析预测,通过实时荧光定量PCR （qPCR）对上述LncRNA相对表达量进行检测验证。结果： 芯片筛选结果发现,与DMSO对照组相比,GMA处理组共16个LncRNA在细胞恶性转化过程中表达上调。在此基础上筛选构建了由3个LncRNA,32个mRNA和204个miRNA组成的LncRNA相关ceRNA调控网络,其中有3个调控轴（LncRNA G013234-hsa-miR-378b-TMEM129、LncRNA CTA-384D8.35-hsa-miR-486-3p-LYPD、LncRNA G087116-miR-29b-3p-NAV1）与GMA诱导16HBE细胞恶性转化过程相关（P<0.05）,提示这3个调控轴是与此恶性转化过程关联较为密切的ceRNA三元组。qPCR验证结果表明在细胞恶性转化过程的不同时期LncRNA G013234,CTA-384D8.35和G087116的相对表达水平变化趋势与LncRNA芯片结果一致。结论： 在GMA诱导16HBE细胞发生恶性转化过程中,LncRNA G013234、CTA-384D8.35、G087116在恶性转化不同时期均发生上调,以此为基础构建的ceRNA调控网络及预测得到细胞恶性转化相关的关键mRNA,为GMA诱导16HBE细胞恶性转化机制研究提供了支持数据。     

镍化合物诱发恶性转化细胞的端粒酶活性表达

目的：探讨二种镍化合物诱发细胞恶变过程中端粒酶活性的变化。方法：二种镍化合物转化细胞接种BALB／c裸鼠，应用端粒重复序列扩增法(telomeric repeat amplification protocol，TRAP)检测转化细胞和肿瘤细胞的端粒酶活性。结果：结晶型硫化镍和氯化镍诱发的BALB／c-313恶性转化细胞的端粒酶活性均表现为阳性。结论：镍化合物诱发的细胞恶性转化涉及了端粒酶活性改变，提示了端粒酶表达与镍转化作用有关。