NRSE/RE-1序列与小鼠胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的关系

目的 探索神经限制性沉默元件(NRSE/RE-1)序列与小鼠胚胎干细胞向神经细胞诱导分化的关系.方法 应用序贯诱导法定向诱导鼠胚胎干细胞分化为神经细胞,基因芯片筛选出的11种含NRSE/RE-1序列的神经相关基因,实时定量PCR测定其在分化过程中的表达.结果 诱导分化后的胚胎干细胞表达多种成熟神经元标志,11种含NRSE/RE-1序列基因随诱导分化的进程表达量升高.结论 鼠胚胎干细胞可通过序贯诱导分化为神经细胞,NRSE/RE-1序列可能是胚胎干细胞向神经元诱导分化的主要调控位点.     

褪黑激素体外定向诱导骨髓间充质干细胞的研究

目的:探讨褪黑激素(melatonin,MT)体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)不同时段向神经细胞分化的情况。方法:采用细胞培养技术分离培养和纯化大鼠MSCs,以MT为诱导剂诱导大鼠MSCs向神经细胞分化。分别在诱导后3,7,10,14 d以免疫荧光法测定神经干细胞特异性标志(nestin)、神经元细胞特异性标志(neurofilament,NF)和星形胶质细胞特异性标志(GFAP)的表达。结果:MT诱导分化3 d,部分细胞胞体收缩成三角形,有些成为简单的双极或多极细胞。诱导3 d细胞开始表达nestin,7~14 d表达nestin和NF,细胞不表达GFAP。结论:MT可诱导大鼠MSCs分化为神经细胞。     

小鼠孤雌胚胎干细胞直接向神经细胞诱导分化的实验研究

目的探讨小鼠孤雌胚胎干细胞在体外不经过拟胚体(EB）阶段,直接诱导分化为神经细胞的可行性。方法采用阶段诱导的方法,首先由孤雌胚胎干细胞向神经前体细胞定向分化,通过巢蛋白(nestin)免疫荧光细胞化学染色对神经前体细胞进行鉴定。在此基础上,撤除丝裂原,加入5%胎牛血清,观察已分化的神经前体细胞能否进一步分化为神经细胞,并对分化出的细胞进行免疫荧光细胞化学鉴定。结果经选择培养基培养3?d后的孤雌干细胞绝大多数可诱导为神经前体细胞,nestin呈阳性。加入血清进一步诱导,可分化出β-Ⅲ-tubline阳性的神经细胞。结论小鼠孤雌胚胎干细胞在体外不经EB培养阶段,可直接诱导分化为神经细胞,并且前期可得到大量的神经前体细胞。     

乳鼠海马神经干细胞向神经细胞分化过程中Notch1 mRNA的表达

目的建立神经干细胞(NSC)向神经细胞分化的培养体系,探讨Notch1mRNA在NSC分化过程中的表达情况。方法无菌分离新生(24h)SD大鼠海马NSC,体外扩增、纯化,并诱导NSC向神经细胞分化。细胞诱导前、后,采用免疫荧光化学法鉴定巢蛋白(Nestin)和神经元特异性烯醇酶(NSE)的表达;用逆转录-PCR检测NSC中Notch1mRNA的表达情况。结果从乳鼠海马分离的NSC在体外能克隆增殖,并表达Nestin。诱导分化后,细胞NSE阳性表达;Notch1mRNA在NSC诱导分化前、后均有表达。与诱导前相比,NSC诱导分化后各阶段Notch1mRNA表达水平均明显降低(P<0.05),而NSC分化各阶段Notch1mRNA表达的差异无统计学意义(P>0.05)。结论诱导NSC向神经细胞分化能抑制其Notch1mRNA的表达,低水平的Notch信号可能有利于神经细胞的分化。     

骨髓间充质干细胞向神经细胞分化过程中Tau蛋白表达量的变化

目的:观察体外诱导新生豚鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经细胞过程中神经细胞Tau蛋白表达量的改变.方法:用H-DMEM培养基加胎牛血清(H-DMEM/FBS)体外培养新生豚鼠MSCs并传代扩增;分为实验组和对照组,实验组使用含细胞因子的培养基诱导MSCs向神经细胞分化,对照组加入不含细胞因子的培养基;用倒置显微镜观察2组细胞形态学改变;用ELISA法定量分析诱导分化第1、4、7、10天和第14天Tau蛋白含量的变化;免疫细胞化学法检测第14天神经元特异性烯醇化酶(NSE)和Tau蛋白的表达.结果:在细胞因子作用下豚鼠骨髓MSCs逐渐向神经细胞分化,在诱导第10天时形态上有典型神经细胞样改变;ELISA法检测发现Tau蛋白在诱导分化早期含量很低,随着诱导分化时间的延长,Tau蛋白含量逐渐升高,第10天趋于稳定,至第14天时Tau蛋白含量无明显增加;免疫细胞化学法可检测到NSE和Tau蛋白抗体阳性细胞.结论:间充质干细胞向神经细胞分化过程中Tau蛋白表达量逐渐升高,其稳定表达可能是神经细胞分化完成或成熟的标志之一.     

Notch1基因在神经干细胞分化过程中的表达

目的　研究Notch1基因在全反式维甲酸 (all trans retinoic acid ,ATRA)诱导人胚胎神经干细胞分化为神经元过程中的表达及其发挥的作用。方法　用 1 μmol/L的ATRA在体外诱导人胚胎神经干细胞 ,诱导 7d后 ,做神经元特异性烯醇化酶 (neuronspecificendase,NSE)免疫荧光染色 ,计数分化为神经元的比例。于诱导前、诱导 3d和诱导 7d ,提取细胞的总RNA。用半定量RT PCR法检测Notch1基因的表达。结果　与对照组相比 ,ATRA能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例 (P <0 .0 1 )。Notch1基因在ATRA诱导后明显下调 (P <0 .0 0 1 )。结论　ATRA能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例 ,Notch1基因在人胚胎神经干细胞分化为神经元的过程中起负调控作用。     

大鼠胚胎神经干细胞的分离培养及鉴定

目的:探索大鼠胚胎神经干细胞的体外分离培养条件,并观察神经干细胞增殖、分化的特点.方法:从孕14 d SD胎鼠前脑组织分离神经干细胞,用DMEM/F12无血清培养液,加入表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF),进行体外扩增、培养和传代.传3～4代的神经细胞球在含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液中贴壁诱导分化培养.采用免疫荧光法鉴定神经干细胞和分化的神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞.结果:从孕14 d SD胎鼠前脑分离的细胞在含有EGF和bFGF的无血清培养液中能形成大量的神经细胞球,这些神经细胞球可在体外增殖及传代培养,经nestin染色鉴定,大部分为阳性细胞.神经细胞球在血清培养液贴壁培养后可分化出神经纤维细丝(NF)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、半乳糖脑苷脂(Gal-C)表达阳性的细胞.结论:从孕14 d SD胎鼠前脑分离的细胞具有自我更新能力和多向分化潜能,属于神经干细胞;在含有EGF和bFGF的无血清培养液中,神经干细胞能在体外大量扩增.     

Notch-1在骨髓间质干细胞分化为神经细胞中的作用

目的观察Notch-1信号在骨髓间质干细胞(MSC)分化为神经细胞中的作用。方法采用RNA干扰技术,构建小鼠Notch-1shRNA,转染小鼠MSC后诱导其分化为神经细胞;同时以未转染MSC和转染甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)shRNA为对照。采用免疫细胞化学染色和Western印迹检测巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经微丝蛋白200(NF200)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和Notch-1蛋白表达;原位末端标记染色评价细胞凋亡率。结果诱导6d后,转染Notch-1shRNA诱导后细胞形成较典型的神经细胞形态,同时高效表达巢蛋白、NSE和NF200等,不表达GFAP,对照组无此现象。但是转染mNotch-1shRNA后细胞凋亡率(13·3%±2·3%)显著高于对照组。结论MSC的横向分化过程可能与神经干细胞类似,阻断Notch信号通路,会增加MSC向神经细胞分化的效果。     

Ephrin B2基因在维甲酸诱导神经干细胞分化过程中的表达

目的　研究EphrinB2基因在全反式维甲酸诱导人胚胎神经干细胞的分化为神经元过程中的表达及其发挥的作用。方法　用 1μmol/L的维甲酸诱导人胚胎神经干细胞 ,诱导 7d后 ,做NSE免疫荧光染色 ,计数分化为神经元的比例。于ATRA诱导前、诱导 3d和诱导 7d ,提取细胞的总RNA。用半定量RT PCR法检测EphrinB2基因的表达情况。结果　与对照组相比 ,全反式维甲酸能显著提高人胚胎神经干细胞分化为神经元的比例 (P <0 .0 1)。EphrinB 2基因在维甲酸诱导后明显上调 (P <0 .0 0 1)。结论　EphrinB2基因在全反式维甲酸诱导人胚胎神经干细胞分化为神经元的过程中起正调控作用 ,EphrinB2基因与神经元的分化关系密切。     

人骨髓间充质干细胞原代提取及成神经诱导分化

目的对人骨髓间充质干细胞进行原代提取、细胞性质鉴定及成神经细胞分化诱导,探讨人骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的可能性,为自体细胞移植提供种子。方法使用试剂盒进行骨髓有核细胞混悬液的制备,纯化培养后对细胞进行流式细胞术鉴定,对成神经分化诱后细胞进行染色形态学观察。结果原代提取细胞培养至10天时可呈漩涡性生长,类细胞克隆样。细胞存在稳定的干性表达,70%骨髓间充质干细胞可实现成神经细胞诱导分化。结论原代人骨髓间充质干细胞可实现向成神经细胞的诱导分化。     

腺病毒介导转录因子X盒结合蛋白1转染对神经干细胞增殖及在缺氧环境下凋亡的影响

目的:以重组腺病毒为载体,将X盒结合蛋白1基因转染胚鼠海马神经干细胞,观察其是否可以促进干细胞增殖以及在缺氧环境下的抗凋亡能力。方法:取孕16dSD大鼠胚鼠的海马组织进行神经干细胞的分离、克隆、nestin免疫荧光检测,以及传代和扩增;将重组腺病毒Ad-XBP1-EGFP质粒转染胚鼠海马神经干细胞,得到基因修饰后的胚鼠海马神经干细胞,选取普通神经干细胞标记为对照组,转染后的神经干细胞标记为转染组。通过细胞计数和MTT比色法检测对照组和转染组的增殖情况,连续检测7d,绘制生长曲线;取两组神经干细胞用CoCl2诱导缺氧,流式细胞术检测对照组和转染组的凋亡情况。结果:转染组的胚鼠海马神经干细胞增殖能力明显增强(P<0.05);在缺氧条件下,转染组神经干细胞凋亡程度较缺氧对照组减轻(P<0.05)。结论:利用重组腺病毒作为载体成功可以将X盒结合蛋白1基因导入胚鼠海马神经干细胞中;转染后的神经干细胞增殖能力和在缺血、缺氧条件下抗凋亡能力较普通神经干细胞明显增加。     

Human neural stem cells promote corticospinal axons regeneration and synapse reformation in injured spinal cord of rats

Background Axonal regeneration in lesioned mammalian central nervous system is abortive, and this causes permanent disabilities in individuals with spinal cord injuries. This paper studied the action of neural stem cell （NSC） in promoting corticospinal axons regeneration and synapse reformation in rats with injured spinal cord. Methods NSCs were isolated from the cortical tissue of spontaneous aborted human fetuses in accordance with the ethical request. The cells were discarded from the NSC culture to acquire NSC-conditioned medium. Sixty adult Wistar rats were randomly divided into four groups （n=15 in each）： NSC graft, NSC medium, graft control and medium control groups. Microsurgical transection of the spinal cord was performed in all the rats at the T11. The NSC graft group received stereotaxic injections of NSCs suspension into both the spinal cord stumps immediately after transection; graft control group received DMEM injection. In NSC medium group, NSC-conditioned medium was administered into the spinal cord every week; NSC culture medium was administered to the medium control group. Hindlimb motor function was assessed using the BBB Locomotor Rating Scale. Regeneration of biotin dextran amine （BDA） labeled corticospinal tract was assessed. Differentiation of NSCs and the expression of synaptophysin at the distal end of the injured spinal cord were observed under a confocal microscope. Group comparisons of behavioral data were analyzed with ANOVA. Results NSCs transplantation resulted in extensive growth of corticospinal axons and locomotor recovery in adult rats after complete spinal cord transection, the mean BBB scores reached 12.5 in NSC graft group and 2.5 in graft control group （P〈 0.05）. There was also significant difference in BBB score between the NSC medium （11.7） and medium control groups （3.7, P〈 0.05）. BDA traces regenerated fibers sprouted across the lesion site and entered the caudal part of the spinal cord. Synaptophysin expression colocalized with BDA positive axons and neurons distal to the injury site. Transplanted cells were found to migrate into the lesion, but not scatter along the route of axon grows. The cells differentiated into astrocytes or oligodendrocytes, but not into the neurons after transplantation. Furthermore, NSC medium administration did not limit the degree of axon sprouting and functional recovery of the injured rats compared to the NSC graft group. Conclusions Human embryonic neural stem cells can promote functional corticospinal axons regeneration and synapse reformation in the injured spinal cord of rats. The action is mainly through the nutritional effect of the stem cells on the spinal cord.     

胚胎大鼠海马源性神经干细胞的分离、培养、分化和鉴定

目的:探讨胚胎大鼠海马源性神经干细胞(N SC)的分离、培养、分化和鉴定的方法。方法:机械分离出胚胎大鼠海马区细胞,以无血清培养基培养,再以血清培养基诱导其分化;在显微镜下观察其形态学特征,逆转录PCR(RT-PCR)和免疫荧光化学法检测神经干细胞和其诱导后细胞的表面标志物。结果:无血清培养基条件下培养的细胞在光镜下可见呈悬浮生长,易聚集成神经球,RT-PCR和免疫荧光化学法可检测到N SC表面标志物N estin的表达;经血清培养基诱导分化后,光镜下可见细胞呈贴壁生长,可见胞体呈树突状突起或呈梭形,RT-PCR和免疫荧光化学法可检测到星形胶质细胞的表面标志物GFAP和神经元细胞的表面标志物N SE的表达。结论:胚胎大鼠海马区分离的细胞具有N SC的特性,并能在含特定生长因子的无血清培养基保持其分化潜能,为进一步针对N SC的研究奠定了基础。     

神经干细胞移植治疗损伤脊髓的实验研究

目的 探讨异体胚胎神经干细胞(neural stem cell，NSC：)移植修复治疗损伤脊髓的疗效。方法 由胚胎SD鼠大脑海马区脑组织培养出NSC，经传代、5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)标记后植入按Allen法制成的SD鼠的损伤脊髓内，术后观察鼠的行为改变、斜板试验及改良运动功能Tarlov评分评价功能恢复；体感诱发电位(SEP)和磁刺激运动诱发电位(MEP)监测脊髓感觉及运动电位传递；光镜及电镜观察植入区组织结构；以示踪剂麦胚凝集素。辣根过氧化物酶(WGA-HRP)显色观察轴突的生长及功能恢复；以免疫组化方法检测神经胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)和饱和硫蛋白(S100)阳性细胞。结果 NSC在损伤脊髓中能成活并分化为神经元及神经胶质细胞，有轴突形成，分化倾向于神经元，能迁移1cm距离。WGA—HRF，能被运输到挫伤以外区域，运动电位能传递到损伤区远端，行为学观察受试组优于对照组。结果 异体胚胎NSC能在损伤区替代受损的神经元及神经胶质细胞，形成神经轴突联系，使损伤的脊髓功能得到一定程度的恢复。     

大鼠胎脑神经干细胞的分离培养及电穿孔转染

目的 分离培养大鼠胎脑神经干细胞(NSC),研究电穿孔技术在NSC中的转染效率.方法 从sD胎鼠脑组织中分离、培养和扩增NSC,利用免疫荧光组织化学技术对NSC及其分化细胞进行鉴定.使用电穿孔技术将质粒pEGFP-N1转染入NSC,利用其表达的绿色荧光蛋白(GFP)作为转染成功的报告物或标记物,在荧光显微镜下根据发出绿色荧光的NSC数量,计算出转染效率.结果 从SD胎鼠脑组织中分离的细胞在体外可长时间自我增殖,原代及传代克隆细胞均表达NSC的特异性抗原巢蛋白,且诱导分化后可表达星形胶质细胞的特异性抗原-胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元的特异性抗原-神经元特异性烯醇化酶(NSE).用电穿孔技术转染神经干细胞,其效率为17.9%～69.1%,平均30.5%.结论 本实验成功分离出具有自我增殖和多向分化潜能的胎鼠NSC,并证实电穿孔技术可对其进行高效转染,为进一步研究NSC的转基因治疗提供实验基础.     

胚胎大鼠神经干细胞的分离培养及鉴定研究

目的建立胎鼠神经干细胞体外培养方法并鉴定神经干细胞,观察神经干细胞生长特点。方法采用含碱性成纤维细胞生长因子和表皮生长因子的无血清培养基对大鼠胚胎间脑组织细胞悬液进行培养。通过检测神经干细胞的特异性抗原、神经干细胞的自我增殖能力和分化能力来鉴定神经干细胞。结果分离培养出了大量具有不断增殖的能力、表达神经巢蛋白的神经干细胞,并能经过诱导分化为神经元和神经胶质细胞,并能稳定传代20代以上。结论无血清培养基分离培养的胎鼠脑组织神经干细胞具有自我更新和增殖能力,巢蛋白细胞免疫荧光鉴定为神经干细胞,成功建立了大鼠神经干细胞的分离培养方法。     

荧光蛋白转基因小鼠神经干细胞移植对脑损伤大鼠认知功能及神经生长因子表达的影响

目的 建立大鼠自由落体颅脑损伤动物模型,并探讨静脉内注射神经干细胞(NSC)对大鼠脑损伤后神经功能恢复及NGF表达的影响.方法 采用仿Feeney自由落体脑损伤装置,用50 g的击锤沿导引杆从30cm高处自由坠落冲击撞杆,造成大鼠右顶叶皮质运动感觉区脑挫裂伤,24h后通过大鼠尾静脉移植GFP转基因小鼠NSC,1周后行神经功能评分并行NGF免疫组织化学染色.结果 NSC移植后1周,移植细胞在损伤区域聚集;NSC移植组认知功能评分和NGF阳性细胞数[(226±27)分,(23±4)个]与单纯脑损伤组[(300±36)分,(15±3)个]比较差异有显著性(P＜0.05).结论 NSC移植明显促进脑损伤大鼠认知功能恢复,NGF可能是修复机制中的一个重要分子.     

益气活血化痰中药复方对大鼠胚胎神经干细胞生长分化增殖的影响机制研究?

目的研究益气活血化痰药物血清对体外培养的大鼠胚胎神经干细胞(NSC)生长分化增殖的影响。方法细胞分为空白血清组、含药血清组、阻滞剂组、含药血清+阻滞剂组和培养基对照组5组。采用细胞培养、血清药理学、免疫荧光等技术,观察中药复方血清对大鼠NSC生长分化的影响;相差显微镜进行形态学观察;免疫荧光染色技术,检测各组细胞nestin、神经元特异性烯醇化酶(NES)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)的表达,观察神经干细胞的分化。结果益气活血化痰中药对神经干细胞无毒性,并能够促进神经干细胞生长分化。nestin蛋白在诱导分化24 h内表达最强,诱导72 h后nestin表达明显减弱直至消失。益气活血化痰中药组NES和GFAP阳性细胞数明显增加。结论益气活血化痰药物血清有促进NSC生长分化增殖的作用。     

Combined Transplantation of Neural Stem Cells and Olfactory Ensheathing Cells Improves the Motor Function of Rats with Intracerebral Hemorrhage

Objective To investigate the effects of combined transplantation of neural stem cells （NSC） and olfactory ensheathing cells （OEC） on the motor function of rats with intracerebral hemorrhage. Methods In three days after a rat model of caudate nucleus hemorrhage was established, NSCs and OEC, NSC, OEC （from embryos of Wistar rats） or normal saline were injected into bematomas of rats in combined transplantation group, NSC group, OEC group, and control group, respectively. Damage of neural function was scored before and in 3, 7, 14, 30 days after operation. Tissue after transplantation was observed by immunocytochemistry staining. Results The scores for the NSC, OEC and co-transplantation groups were significantly lower in 14 and 30 days after operation than in 3 days after operation （P〈0.05）. The scores for the NSC and OEC groups were significantly lower than those for the control group only in 30 days after operation （P〈0.05）, while the difference for the NSC-OEC group was significant in 14 days after operation （P〈0.05）. Immunocytochemistry staining revealed that the transplanted OEC and NSC could survive, migrate and differentiate into neurons, astrocytes, and oligodendrocytes. The number of neural precursor cells was greater in the NSC and combined transplantation groups than in the control group. The number of neurons differentiated from NSC was significantly greater in the co-transplantation group than in the NSC group. Conclusion Co-transplantation of NSC and OEC can promote the repair of injured tissue and improve the motor fimction of rats with intracerebral hemorrhage.     

Isolation, Culture and Identification of Neural Stem Cells in New-born Rats

The cortexes were obtained from new-born rats and dissociated to single cells by triturating. The ceils were cultured in neural stem cell (NSC) culture medium (DMEM supplemented with bFGF, EGF and B27) and formed primary neurospheres after 7 days. Single ceils dissociated from neurosphere were cultured in 96-well plates and formed single-cell cloning neurosphere 7 days later.The primary and single-cell cloning neurospheres were both positive for the immunofluorescent staining of nestin and were identified as NSC. It was proved that NSC can be expanded in vitro and orovide seed cells for neural tissue engineering.