Fas介导瘢痕疙瘩周围皮肤成纤维细胞凋亡及其基因检测研究

目的　探讨瘢痕疙瘩周围皮肤中是否有生物学活性异常成纤维细胞 ,以期进一步了解瘢痕疙瘩的发展机制。方法　所取新鲜组织标本进行细胞培养 ,通过碘化丙啶 (PI)染色、激光流式细胞仪比较不同浓度Fas单克隆抗体 (FasMcAb ,0～ 10 0 0 μg/L)作用后各组成纤维细胞凋亡率。采用聚合酶链反应 (PCR)技术对Fas基因外显子 8进行DNA扩增并测序。结果　FasMcAb作用2 4h后 ,瘢痕疙瘩成纤维细胞在各浓度段均不能凋亡 ,瘢痕疙瘩周围皮肤成纤维细胞随FasMcAb作用浓度的增加凋亡率虽有所增加 ,但总体比较与瘢痕疙瘩差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,而与正常皮肤差异有显著性 (P <0 .0 1)。瘢痕疙瘩周围皮肤 6例标本中有 4例 (4 /6)Fas基因外显子 8及其下游序列存在点突变及移码突变 ,均与同患者瘢痕疙瘩细胞基因序列分析结果一致 ,而两组正常皮肤成纤维细胞则未发现有任何形式的基因突变。结论　瘢痕疙瘩周围 0 .5cm皮肤内存在生物学活性异常细胞 ,这可能为瘢痕疙瘩浸润性生长的结果及其治疗后易复发的原因之一。     

Fas和Bcl-2在膀胱癌中的表达及意义

目的：探讨Fas和Bcl-2在膀胱移行细胞癌的表达及其与膀胱癌生物学行为的关系。胱癌的病理分级、临床分期及随结果相比较。结果31例（73．8％）Fas表达阳性,23例（56．1％）Bcl-2表达阳性,低分化和晚期膀胱移行细胞癌中二者表达均增加。结论Fas和Bcl-2表达可以作为监测膀胱胱移行细胞癌恶性程度、预测复发的重要指标。在低分化和晚期膀胱移行细胞癌中,Fas所介导的细胞凋亡可能被Bcl-2的过度表达所抑制。     

瘢痕成纤维细胞凋亡及p5 3基因的表达

目的探讨瘢痕成纤维细胞凋亡及p53基因表达及其意义.方法取正常皮肤和增生性瘢痕各8例、瘢痕疙瘩9例行成纤维细胞培养,应用流式细胞仪检测成纤维细胞凋亡,用p53cDNA探针对抽提的DNA点迹印迹杂交观察p53基因表达情况.结果 3组成纤维细胞凋亡细胞分别为(10.8±1.2)%,(10.6±1.8)%,(5.5±0.8)%,瘢痕疙瘩较正常皮肤和增生性瘢痕成纤维细胞凋亡少,差异具有显著性意义(P＜0.05),且p53基因有明显的表达.结论瘢痕疙瘩成纤维细胞是具有肿瘤性质的一类细胞.     

Fas介导下瘢痕成纤维细胞中死亡信号传导的研究

目的　研究和比较增生性瘢痕和瘢痕疙瘩成纤维细胞经Fas单抗 (FasMcab)诱导产生凋亡的能力 ,同时探讨Ca2 、氢过氧化物 (LPO)在其相应死亡信号通道中的作用。方法　取手术切除的增生性瘢痕和瘢痕疙瘩患者的瘢痕及瘢痕疙者组织各 6例 ,通过细胞培养 6～ 8代后 ,以FasMcab为处理因素作用于增生性瘢痕及瘢痕疙瘩成纤维细胞 2 4h ,应用透射电镜证实凋亡现象的发生 ;应用流式细胞仪检测及比较两者凋亡率。同时 ,应用粘附式细胞仪检测FasMcab作用下胞内Ca 2 、LPO的变化。结果　增生性瘢痕成纤维细胞在工作浓度以上的FasMcab作用下 ,发生明显的凋亡现象 ,其凋亡率随着单抗浓度的增高不断增高。瘢痕疙瘩成纤维细胞在各浓度梯度下 ,均未发现明显的凋亡 ,且各组间差异无显著意义。在FasM cab作用下 ,增生性瘢痕成纤维细胞内Ca2 、LPO显著增高 ,而瘢痕疙瘩成纤维细胞内Ca2 、LPO的变化差异无显著意义。结论　Fas介导凋亡的异常可能是瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖～凋亡调控异常的细胞生物学机理之一。在FasMcab作用下 ,细胞内Ca2 、LPO产生的障碍可能直接导致瘢痕疙瘩的凋亡异常。     

α—平滑肌肌动蛋白在瘢痕成纤维细胞中的表达

目的 研究转化生长因子-β1(TGF-β1)对瘢痕成纤维细胞中α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的诱导作用。方法 以5例增生性瘢痕为实验组,3例正常瘢痕为对照组,采用成纤维细胞二维培养和三维培养体系及LSAB免疫组织化学染色技术,观察在不同TGF-β1浓度作用下,来源于实验组和对照组的成纤维细胞表达α-SMA的情况。结果 实验组的成纤维细胞,三维培养体系中α-SMA含量明显低于二维培养体系,不同浓度TGF-β1诱导瘢痕成纤维细胞表达α-SMA的作用不同,以5ng/ml的TGF-β1作用最有效;与对照组的成纤维细胞相比,实验组的成纤维细胞在表达α-SMA方面,对TGF-β1的反应更为敏感。结论 在体外,TGF-β1诱导α-SMA在瘢痕成纤维细胞中的表达作用存在着浓度差异;实验组与对照组中的成纤维细胞在细胞性状方面存在差异,对TGF-β1敏感性不同;细胞外基质成分可能会降低TGF-β1的诱导作用,使α-SMA的表达减少。     

凋亡相关基因Bcl—2、Bax在相对静息期增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中的表达及分布

目的 了解相对静息期增生性瘢痕、瘢痕疙瘩中凋亡特性和凋亡蛋白的表达分布。方法 利用免疫组化的方法，检测静息期增生性瘢痕、瘢痕疙瘩凋亡相关蛋白的表达分布和强弱。结果 发现两者的表达均处于瘢痕上皮的基底细胞层、小血管、及皮肤附件周围细胞。增生性瘢痕中，Bax在上述区域的表达更强，瘢痕疙瘩中Bax表达，Bcl—2弱，在瘢痕疙瘩中发现2例在瘢痕中心区的Bcl—2弱表达。结论 静息期增生性瘢痕、瘢痕疙瘩，有着与增殖期不同的凋亡特性，凋亡上皮的基底层细胞、小血管、残存的皮肤附件周围的细胞，可能在瘢痕日后的凋亡中发挥重要的作用。     

血小板源性生长因子受体-β在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达

目的 从细胞及组织水平检测血小板源性生长因子受体－β（ＰＤＧＦＲ－β）在正常皮肤及瘢痕疙瘩中的表达及分布,探讨ＰＤＧＦＲ－β在瘢痕疙瘩形成中的生物学作用。方法①应用免疫组织化学技术检测ＰＤＧＦＲ－β在正常和瘢痕疙瘩组织中的分布;②应用免疫荧光、流式细胞仪检测正常皮肤和瘢痕疙瘩成纤维细胞群体的ＰＤＧＦＲ－β的表达;③应用免疫荧光、激光共聚焦显微镜检测ＰＤＧＦＲ－β的亚细胞分布。结果 ①免疫组织化学正     

α-促黑素细胞激素在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达和作用

目的检测α－MSH在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达和作用,为研究瘢痕疙瘩的形成机理提供新的理论依据.方法将取自患者躯干部位的瘢痕疙瘩皮肤,用组织块培养法进行成纤维细胞原代培养,DMEM培养液传代、扩增培养,以细胞形态学鉴定成纤维细胞.应用免疫组织化学染色方法检测α－MSH在瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达,并应用流式细胞仪从细胞生长及增殖特性方面分析α－MSH对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长和增殖的影响.结果α－MSH能够在瘢痕疙瘩成纤维细胞中得到高表达,浓度为10－6 mmol/L的α－MSH可明显促进瘢痕疙瘩成纤维细胞生长、增殖.结论α－MSH能够在瘢痕疙瘩成纤维细胞中得到高表达,瘢痕疙瘩成纤维细胞对α－MSH的反应性增强表明α－MSH可能在促进瘢痕疙瘩的形成中起着重要的作用.     

蛋白糖基化抑制剂对病理性瘢痕成纤维细胞Fas蛋白的表达与功能的影响

目的 研究N-糖链合成抑制剂衣霉素对病理性瘢痕成纤维细胞Fas蛋白的表达与诱导凋亡功能的影响.方法 瘢痕疙瘩及增生性瘢痕各5例,以健康皮肤为对照,免疫组织化学法检测组织中成纤维细胞Fas蛋白表达;组织块贴壁法培养成纤维细胞;Western Blot法及流式细胞术检测衣霉素处理及未处理各组成纤维细胞Fas蛋白水平的表达及凋亡率的变化.结果 病理性瘢痕及健康皮肤成纤维细胞胞质及胞膜中均可见Fas蛋白表达;增生性瘢痕、瘢痕疙瘩及健康皮肤成纤维细胞Fas蛋白糖基化水平依次降低,3组成纤维细胞在Fas单克隆抗体(Fas monoelonal antibody,FasMcAb)作用后凋亡率与Fas蛋白糖基化成正相关,衣霉素可明显降低病理性瘢痕成纤维细胞Fas蛋白糖基化水平,但对健康皮肤成纤维细胞Fas蛋白糖基化水平抑制作用不明显.结论 FasMcAb诱导病理性瘢痕成纤维细胞凋亡与成纤维细胞Fas蛋白糖基化水平成正相关,而衣霉素可显著降低成纤维细胞Fas蛋白糖基化水平.     

增生性瘢痕组织中成纤维细胞活性功能研究

为全面系统了解瘢痕增生过程中成纤维细胞的活性功能状况，实验通过４０例不同时期的瘢痕增生组织进行成纤维细胞核内增殖抗原（ＰＣＮＡ）、核仁组成区嗜银蛋白（ＡｇＮＯＲｓ）和氨基酸分析检测。结果发现：ＰＣＮＡ的蛋白表达主要在１和３个月时期的瘢痕成纤维细胞核内，细胞内ＡｇＮＯＲｓ在１个月～９个月瘢痕增生组织中明显高于１２个月以后的瘢痕组织及正常皮肤内水平；组织总氨基酸量随瘢痕增生发展逐渐递增，但以瘢痕增生１个月时期为最快（２０６．７４μｇ／ｍｇ组织），代表胶原含量的羟脯氨酸则在瘢痕发展３个月～６个月之间提高最快（１７．０５μｇ／ｍｇ组织），６个月～９个月之间下降为５．１１μｇ／ｍｇ组织，９个月～１２个月为１．３１μｇ／ｍｇ组织。由此提示：在瘢痕发展整个过程中，成纤维细胞的增殖旺盛阶段在瘢痕形成早期，胶原蛋白沉积在６个月时期左右也基本完成，但其它细胞外间质如胶原蛋白，蛋白多糖纤维结合蛋白等在１２个月以后的瘢痕组织中仍有聚集。     

肌肉转录调节因子和连接蛋白43基因表达对大鼠成纤维细胞分化的生长特性及生物学功能影响

目的通过观察转染肌肉转录调节因子(myoblast determining,MyoD)基因和连接蛋白43(connexin43,Cx43)基因的大鼠成纤维细胞(fibroblast,FB)分化生长及生物学功能的改变,初步探讨MyoD和Cx43基因转染FB治疗缺血性心脏病(ischemic heart disease,IHD)的可能机制和途径。方法构建真核表达的质粒载体pLenti6/V5-DEST-MyoD和pLenti6/V5-DEST-Cx43,利用慢病毒表达系统,将MyoD和Cx43基因转入大鼠RFL-6FB;经终浓度为50μg/ml的Blasticidin进行筛选培养后,通过RT-PCR、Western blot等分子生物学手段确定MyoD和Cx43的转录和表达情况;借助免疫细胞化学、显微镜观察等手段对MyoD的肌肉特异性蛋白和Cx43连接蛋白进行检测,并观察转染后FB的生长情况。结果RT-PCR和Western blot检测出MyoD和Cx43基因转染后FB表达了相应mRNA及其蛋白,免疫细胞化学检测转染的FB细胞中Desmin、α-actin呈阳性表达。经分化培养基诱导,培养1周后,FB出现多细胞融合及肌管形成。结论MyoD及Cx43基因转染可改变FB的生物学特性,转向分化为成肌细胞,并能形成多核肌管及连接蛋白,形态学也得以证实,为进一步研究MyoD和Cx43基因转染FB治疗IHD提供了实验基础。     

体外刺激对培养成纤维细胞功能与表达c—fos基因的影响

目的 研究采用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)刺激对体外培养成纤维细胞形态、功能以及表达原癌基因c-fos的影响,探讨成纤维细胞生长因子与原癌基因之间在调控创面愈合中可能的网络机制。方法 将处于对数生长期的乳鼠成纤维细胞分成bFGF刺激组织和对照组,在分别采用bFGF和对照物刺激后继续培养,于刺激后1小时和3、5及7天采集细胞用于形态学和细胞活力检测。同时用SP法对原位培养法和甩片法收集的成纤维细胞检测c-fos基因表达。结果 培养的成纤维细胞经bFGF刺激后其形态较对照明显增大,MTT检测活性明显增设,在刺激后表达c-fos基因显著增加,其中以刺激后1小时最为明显。结论 bFGF刺激可以使培养的成纤维细胞形态与功能发生明显改变,使c-fos基因表达显著增加。结合既往研究表明,c-fos不仅可以直接上调bFGF基因表达,同时bFGF本身也可以诱导c-fos基因表达,表明二者之间可能存在相互作用的网络机制。其可能的调控途径涉及ras以及酪氨酸激酶等。     

兔肌腱细胞与成纤维细胞生物学特性研究

为了研究在体外培养条件下，肌腱细胞与成纤维细胞的生物特性，按Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ方法作兔肌腱细胞与皮肤成纤维细胞体外培养，观察细胞形态、贴壁时间及延展时间。采用免疫组织化学的方法对细胞合成胶原的类型进行了测定。结果表明：两种细胞未贴壁前均呈圆形，贴壁后呈梭形或多角形。成纤维细胞的贴壁时间、延展时间较肌腱细胞快；贴壁后细胞群体的排列方向，肌腱细胞群体排列趋于一致、规则，成纤维细胞排列呈不规则。肌腱细胞合成Ⅰ型胶原，成纤维细胞合成Ⅰ和Ⅲ型胶原。根据细胞的贴壁时间、延展时间、排列方向及合成胶原类型，可以区分肌腱细胞及成纤维细胞。     

青蒿琥酯诱导瘢痕成纤维细胞凋亡的实验研究

目的探讨青蒿琥酯（artesunate，Art）诱导皮肤瘢痕成纤维细胞凋亡的作用及机制。方法取自愿捐献的人耳垂增生性瘢痕，采用组织块贴壁法进行细胞培养。经免疫组织化学染色鉴定后，取第3～5代成纤维细胞，采用含60、120和240mg／LArt培养液各5ml培养作为实验组，仅加入等量的培养液作为对照组。于倒置显微镜及透射电镜观察，采用流式细胞仪观察细胞凋亡及细胞周期。另取第3～5代成纤维细胞，实验组采用30、60和120mg／LArt培养液，对照组仅加入等量的培养液，观察细胞内钙离子的变化。结果原代成纤维细胞呈典型的梭形贴壁生长，免疫组织化学鉴定细胞波形蛋白呈阳性表达；倒置显微镜下观察Art在60～240mg／L浓度范围内抑制成纤维细胞生长且呈剂量及时间依赖性，细胞出现凋亡征象；透射电镜观察，各实验组出现染色质浓缩，沿着核膜排列，甚至核碎裂现象。细胞周期分析显示各实验组与对照组比较，凋亡细胞比例、处于G0～G1、S、G2～M期细胞数差异均有统计学意义（P〈0．05），实验组均出现典型的凋亡峰，且随药物浓度增加，峰值越大。Art在30～120mg／L作用成纤维细胞24h可引起细胞内钙离子浓度持续增加，与对照组比较，差异有统计学意义（P〈0．05）。结论Art通过作用于成纤维细胞周期诱导细胞凋亡，细胞内钙离子浓度升高可能是其诱导成纤维细胞凋亡的机制之一。     

碱性成纤维细胞生长因子真核表达载体的构建及表达

目的构建人碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)真核表达质粒,研究其在体内外的表达.方法通过基因克隆技术,构建并大量制备pcDNA3.1/myc-His(-)-bFGF真核表达体系,RT-PCR和细胞免疫组织化学方法检测体外瞬时表达情况;直流电脉冲介导重组质粒pcDNA3.1/myc-His(-)-bFGF和pCD2-血管内皮细胞生长因子121(vascular endothelial growth factor,VEGF121)在兔颈部肌肉瓣内转移并表达,测定其促血管生成的生物学效应.结果构建的pcDNA3.1/myc-His(-)-bFGF真核表达体系成功转染体外培养HeLa细胞,目的基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达.pcDNA3.1/myc-His(-)-bFGF和pCD2-VEGF121重组质粒分别转染在体肌瓣,获得外源基因高水平表达.转基因肌肉发生血管增生、血流增强的生物学效应.结论构建了人bFGF真核表达质粒,并可在体内外顺利表达,为进一步组织移植或组织工程基因治疗研究奠定了基础.     

凋亡相关基因bcl-2和bax在胆管癌组织中表达的意义

目的　探讨细胞凋亡抑制基因ｂｃｌ－ ２ 和凋亡促进基因ｂａｘ 在胆管癌组织中的表达。方法　应用免疫组化方法对２０ 例胆管癌（ＣＨＣ）和７例先天性胆总管囊肿（ＣＣＣ）组织中ｂｃｌ－ ２和ｂａｘ 蛋白进行检测。结果　２０例ＣＨＣ中有１例ｂｃｌ－ ２ 蛋白表达阳性（５％ ）,７例ＣＣＣ中ｂｃｌ－ ２均表达阴性。２０例ＣＨＣ中有１１ 例ｂａｘ 蛋白表达阳性（５５％ ）,７例ＣＣＣ中仅１ 例表达阳性（１４．２９％ ）,两组间差异有显著意义（Ｐ＜ ０．０１）。结论　ｂｃｌ－ ２ 和ｂａｘ 蛋白的改变在胆管癌发生发展过程中不起重要作用。     

胰岛素及丹参对体外培养成纤维细胞影响的实验研究

为了探讨胰岛素、丹参在伤口愈合过程中对胶原合成与分解代谢的影响，应用人胚皮肤培养成纤维细胞，分设胰岛素组、丹参组及对照组，培养２，４和６天，观察细胞的生长情况。成纤维细胞生长曲线显示：胰岛素组高于对照组，对照组高于丹参组。细胞核分裂率三组分别为１９．６０‰，２．５０‰和３．７７‰。扫描电镜观察发现胰岛素组成纤维细胞周围及表面有大量纤维状物，丹参组成纤维细胞表面光滑，仅有少量纤维状物。认为，胰岛素对成纤维细胞增殖和胶原合成有促进作用，而丹参对成纤维细胞增殖和胶原合成则有抑制作用     

胆管癌的基因表达及其临床意义

目的 寻找对胆管癌早期诊断和判断其预后有意义的指标。方法 复习国内外文献有关胆管癌组织中各种基因的改变及其临床意义。结果 胆管癌组织中存在多种基因的点突变、缺失和过度表达,其中以Ｋ－ｒａｓ基因的研究最为深入。结论 Ｋ－ｒａｓ基因点突变的检测将有助胆管癌的早期发现和判断其预后。     

维甲酸调控IGF-2基因对软骨细胞促凋亡的作用

目的 探讨维甲酸对软骨细胞凋亡的影响及细胞内IGF-2的表达规律. 方法 1月龄雄性中国白兔1只,体重约500 g.取兔双膝关节股骨髁软骨,采用胰酶消化法体外培养白兔软骨细胞.取第2代软骨细胞,培养液内加入终浓度为1×10-6 mol/L的全反式维甲酸(all-trans-retinoic acid,ATRA)25μL(实验组),作用24 h;对照组加入25μL DMEM液作为对照.采用细胞免疫组织化学法观察软骨细胞中Ⅱ型胶原的分泌变化,流式细胞仪检测软骨细胞凋亡率,RT-PCR半定量分析软骨细胞中IGF-2 mRNA的表达,Western blot印迹杂交鉴定软骨细胞中IGF-2蛋白质表达. 结果 实验组ATRA抑制了软骨细胞中Ⅱ型胶原的表达.流式细胞仪检测实验组软骨细胞凋亡率为21%±2%,较对照组(5%±1%)增加了5倍;RT-PCR检测实验组IGF-2 mRNA的表达为0.2±0.1,较对照组(0.8±0.2)降低75%;Western blot印迹杂交分析发现,实验组软骨细胞IGF-2的表达为0.3±0.1,较对照组(0.7±0.2)降低了57%;各指标组间比较差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 维甲酸可能通过抑制软骨细胞靶基因IGF-2的表达,负性调节软骨细胞分泌和增殖功能,促进软骨细胞凋亡.