汉坦病毒G2膜蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达

目的：研究汉坦病毒G2膜蛋白基因在甲醇营养型巴斯德毕赤酵母中的克隆表达。方法：采用RT-PCR扩增G2基因，转化感受态大肠杆菌DH5α，DNA序列分析后，SnaBI、NotI两次酶切下G2，再连接到经同样酶切的pPIC9K表达载体上，构建表达载体pPIC9K-G2，SalI线形化后电转化导入毕赤酵母宿主菌GS115，G418筛选转化子，1％甲醇诱导、摇瓶培养。结果：序列分析表明，克隆序列与设计相符，12％SDS-PAGE显示重组蛋白为50KD，Western-Blot证实其生物学活性。结论：成功地在巴斯德毕赤酵母GS115中表达了汉坦病毒G2膜蛋白基因。     

人白介素-2/人血清白蛋白融合蛋白在毕赤酵母中的表达

目的：构建编码人白介素-2／人清白蛋白的重组表达质粒pPIH，在毕赤酵母（Pichia pastria）中进行表达，获得具有白介素-2（IL-2）活性的融合蛋白。方法：通过逆转录方法从人外周血单核细胞得到人IL-2的cDNA，再通过重叠PCR方法，将编码人IL-2的cDNA和编码人白蛋白的cDNA拼接起来，克隆至T载体获得含有融合基因IH的质粒pMD19／IH。用Eco RI和NotI双酶切pMD19／IH和pPIC9K两种质粒，通过琼脂糖凝胶电泳分离，试剂盒纯化，将IH片段和pPIC9K连接获得表达型pPIH的重组质粒，利用电转化方法转化毕赤酵母KM71获得重组表达质粒pPIH；CTLL-2／MTT法测定融合蛋白中人IL-2活性。结果：成功构建了人白介素-2，人血清白蛋白的重组表达质粒pPIH，融合蛋白得到了较理想的表达；重组菌经甲醇诱导表达后含有融合蛋白IL-2-HSA发酵上清液表现100U／mL的生物学活性。结论：成功获得具有人IL-2生物活性的重组人白介素-2，血清白蛋白融合蛋白，该研究结果未见文献报道。     

阿尔茨海默病Aβ40人单链抗体在毕赤酵母的表达

目的 重组表达抗Aβ40的人单链抗体,为被动免疫治疗阿尔茨海默疾病提供研究材料。方法 将从人噬菌体单链抗体文库中筛选获得的抗Aβ40人单链抗体基因,突变BamHI酶切位点,克隆连接到T载体,经过PCR和酶切鉴定。EcoRI和NotI双酶切pT-scFvAβ40质粒,连接到经过同样酶切的pPIC9K载体构建pPIC9K-scFvAβ40质粒,经过基因测序验证。线性化pPIC9K-scFvAβ40,转化GS115毕赤酵母,经0．5％甲醇诱导表达抗Aβ40的人单链抗体。结果 基因测序证实pPIC9K-scFvAβ40序列正确,转化GS115获得重组菌株。经过0．5％甲醇诱导,重组菌株分泌表达分子质量大小约为33kD的蛋白质。结论 成功构建pPIC9K-scFvAβ40质粒,Aβ40的人单链抗体在毕赤酵母系统得以重组表达。     

SARS病毒S蛋白N端片段真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的：构建SARS冠状病毒S蛋白N端1～501bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况.方法： 用PCR方法从质粒pGEX-6P-1＋SARS-S上扩增出S编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9＋SARS-S.重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组S蛋白片段表达.结果： 酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组真核表达质粒的构建完全正确.对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为41 000处有重组蛋白的表达.结论： SARS冠状病毒S蛋白N端1～167aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达.     

辣根过氧化物酶同功酶C3基因在毕赤酵母中的克隆与分析

目的克隆辣根过氧化物酶同功酶C3(HRPC3)基因,为此基因的表达做准备。方法用PCR方法从辣根的基因组DNA中扩增得到一种辣根过氧化物酶同功酶C3基因,将PCR产物连接到pMD18-T载体上。测序证明正确后,再以带有EcoRI和NotI酶切位点的引物进行PCR,然后将目的基因切下,插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建成重组pPIC9K质粒,用电转化转入毕赤酵母。提取转化子的基因组DNA,用PCR进行鉴定是否含有HRPC3基因。结果重组pPIC9K质粒转化毕赤酵母后,经PCR鉴定,证明形成了目的基因的克隆。结论应用毕赤酵母作为受体菌,pPIC9K为载体,成功克隆了HRPC3。     

SARS病毒M蛋白编码基因真核载体的构建及酵母表达菌株的建立

目的:构建SARS冠状病毒M蛋白N端编码基因1~129bp的真核表达载体,并分析其在毕赤酵母GS115中的表达情况。方法:用PCR方法从质粒pGEX-6P-1+SARS-M上扩增出M编码基因片段,克隆至真核表达载体pPIC9上,构建重组质粒pPIC9+SARS-M。重组质粒经酶切鉴定和核苷酸测序鉴定后,转化毕赤酵母GS115,用甲醇诱导重组M蛋白片段表达。结果:酶切鉴定及核苷酸序列测定表明重组质粒的构建完全正确。对甲醇诱导后重组毕赤酵母培养上清行SDS-PAGE电泳分析,在相对分子量约为10000处有重组蛋白的表达。结论:SARS冠状病毒M蛋白N端1~43aa在毕赤酵母中获得了高效、分泌性表达。     

EBV-LMP1 cDNA的克隆测序与原核表达质粒构建

目的：克隆EBV－LMP1 cDNA，构建EBV－LMP1基因的原核表达重组质粒。方法：通过RT－PCR技术从B95－8细胞中扩增EBV－LMP1 cDNA，克隆至pGEM-T easy载体上并测序；利用引物上的BamH I与HindⅢ酶切位点将LMP1基因插入载体pET-32a，转化JM109菌。提取质粒，限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果：扩增的LMP1 cDNA长度为1158bp，测序结果与已知序列吻合，重组原核表达质粒经酶切鉴定表明获得正确重组子。结论：成功克隆了EBV－LMP1 cDNA，并构建了pET-32a-LMP1原核表达载体，为研究LMP1在EBV致瘤中的作用及肿瘤疫苗奠定了基础。     

一种β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母中的克隆与鉴定

目的：克隆扣囊复膜孢酵母的β-葡萄糖苷酶基因(BGL1)，为β-葡萄糖苷酶基因的表达作准备。方法：用PCR方法从扣囊复膜孢酵母的总DNA中扩增得到β-葡萄糖苷酶基因连接到pGEM--T载体上，用限制性内切酶切下目的基因，插入到巴斯德毕赤酵母表达载体pPIC9K中，使之位于α-因子信号肽下游，且与之同框，构建成重组质粒pSHL9K。再将β-葡萄糖苷酶基因在大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母中进行克隆，并进行鉴定。结果：重组pPIC9K转化大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母后，进行酶切和PCR鉴定，证明形成了目的基因的克隆。结论：应用大肠杆菌和巴斯德毕赤酵母作为受体菌，pPIC9K为载体，成功克隆了β-葡萄糖苷酶基因。     

真核表达载体pcDNA3.1-MAGE-1的构建

目的：构建含MAGE—1基因的重组真核表达质粒。方法：用RT—PCR方法从人肝细胞肝癌组织中扩增出MAGE-1基因cDNA序列，克隆至pGEM—T载体，测序证实基因碱基序列无误后，再克隆至真核表达载体pcDNA3.1( )，构建了pcDNA3.1—MAGE—1重组质粒。结果与结论：RT—PCR获得长度为927bp的阳性产物，经T载体和pcDNA3.1( )真核表达载体克隆、酶切鉴定及序列分析后。证实真核表达质粒pcDNA3．1—MAGE—1构建成功。     

人甲状腺刺激激素受体cDNA的克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人甲状腺刺激激素受体(hTSHR)基因cDNA并构建其真核表达载体。方法以人甲状腺组织cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)扩增hTSHR基因编码区的全部序列,克隆入pGEM-T载体中,经限制性内切酶、DNA序列分析鉴定目的基因后,定向亚克隆到真核细胞表达载体pcDNA3.1中,并进行双酶切鉴定。结果PCR扩增的特异性片段长度为2 337 bp,以此构建的pGEM-T-hTSHR克隆载体,经限制性内切酶酶切及DNA序列分析证实载体中带有hTSHR基因编码区的目的片段,重组质粒pcDNA3.1-hTSHR经KpnⅠ和XbaⅠ双酶切后显示5 1000 bp和2 300 bp左右的2个条带,DNA序列分析显示与GenBank中的hTSHR基因cDNA序列一致,证明hTSHR基因已成功克隆入真核细胞表达载体pcDNA3.1中。结论成功构建了野生型pcDNA3.1-hTSHR重组真核表达载体。     

人核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及其体内外抗瘤效应研究(英文)

目的构建人核心蛋白聚糖(human decorin,hDCN)pcDNA3.1(+)真核表达载体,并探讨其对S180细胞在体内、体外的抗肿瘤效应及其作用机制。方法用PCR法从pPIC9K-DCN扩增hDCN核心蛋白分子编码序列的全长cDNA,与pcD-NA3.1(+)载体连接。将重组pcDNA3.1(+)-DCN质粒通过脂质体转染法转入小鼠肿瘤细胞S180中,用G418筛选出阳性克隆细胞,RT-PCR、双酶切及测序鉴定。流式细胞仪对转染了重组质粒pcDNA3.1(+)-DCN、空质粒pcDNA3.1(+)的S180细胞和未转染的S180细胞进行细胞凋亡检测和细胞周期分析。分别注射等量的pcDNA3.1(+)-DCN/S180、pcDNA3.1(+)/S180的细胞和未转染质粒的S180细胞到随机分组的小鼠腋部皮下,观察三组小鼠的肿瘤生长情况;处死三组小鼠后,分别剥离肿瘤组织做病理学检查。结果转染了DCN的S180细胞凋亡指数明显增高,G0/G1期细胞百分率明显高于其他两组,G2/M期、S期细胞百分率分别明显低于其他两组(P<0.01)。与注射pcDNA3.1(+)/S180和S180的小鼠相比,注射pcDNA3.1(+)-DCN/S180的小鼠肿瘤生长速度明显减慢,肿瘤体积小于其他两组(P<0.01)。结论成功构建了人核心蛋白聚糖真核表达载体。体外实验结果显示转染该表达载体的S180细胞凋亡指数明显增高,且凋亡多发生在G0/G1期;转染DCN表达载体的S180细胞在实验动物体内成瘤性降低,提示转染DCN在实验动物体内外都能表现抑瘤效应。     

重组融合蛋白rTMP-GH在巴斯德毕赤酵母中表达的研究

目的 实现TPO模拟肽(thrombopoietin mimetic peptide,TMP)与人生长激素(human growth hormone,hGH)的重组融合蛋白rTMP-GH在巴氏毕赤酵母中的高效表达.方法 以含有rTMP-GH核苷酸序列的原核质粒为模板,PCR方法获得rTMP-GH的编码序列,并亚克降至载体pPIC9K中,将所构建pPIC9K-rTMP-GH表达质粒转化酵母宿主细胞GS115,MD/MM平板及G418抗性筛选高表达株,然后进行试管补料分批表达,Western blot对表达产物进行鉴定,通过巨核细胞集落形成能力对其,圭物学活性进行初步检测.结果 成功构建pPIC9K-rTMP-GH表达质粒,筛选到高表达rTMP-GH重组融合蛋白的巴氏毕赤酵母细胞株,初步证实所表达产物具有刺激巨核细胞集落形成的能力.结论 成功实现了rTMP-GH融合蛋白在巴氏毕赤酵母中的高效表达.     

大鼠SLC7a8基因的克隆及真核表达载体的构建

目的：克隆大鼠左旋氨基酸转运体（SLC7a8）基因cDNA的读码框（CDS）,构建携带SLC7a8基因的重组真核表达载体,为进一步研究其在自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats,SHR）中的功能作准备。方法：从非高血压大鼠（wistar-kyoto,WKY）肾脏组织提取总RNA,通过RT-PCR得到总cDNA,PCR法扩增,产物连接pGEM-T Easy载体测序分析正确后,再以PCR方法扩增,将其连接入真核表达质粒pcDNA3.1（＋）。以PCR、双酶切和测序鉴定正确后,将重组载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8用脂质体包裹转染大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E）,RT-PCR法及Western blotting法分别检测转染后SLC7a8 mRNA及蛋白表达水平。结果：成功克隆了大鼠SLC7a8基因cDNA,重组真核表达载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8构建成功,且证实转染后肾小管上皮细胞的SLC7a8 mRNA及蛋白表达均明显高于空白对照组（P〈0.05）及空质粒组（P〈0.05）。结论：成功克隆了SLC7a8基因,并构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）-SLC7a8,能够在NRK-52E细胞中获得有效过表达,这为进一步探讨SLC7a8基因的生物学功能奠定了基础。     

人全长PLCr 1基因真核表达载体的构建及鉴定

目的构建人全长PLCr1基因真核表达载体，以便进一步研究PLCr1的作用及其机制。方法自行设计一对带有日砌Ⅲ和Not Ⅰ酶切位点的引物，采用RT-PCR技术从MG63细胞中扩增人全长PLCr1 cDNA(3878bp)，纯化后，经HindⅢ-NotⅠ酶切，插入真核表达载体pLNCX2中，构建重组质粒pLNCX2／PLCr1。通过PCR，限制性酶切分析及DNA直接测序对所构建的重组质粒进行鉴定。同时经瞬时转染后，利用RT-PCR及Western blotting转染后LoVo细胞中PLCr1的表达。结果RT-PCR产物经琼脂糖电泳分析所得片段大小与预期相符(3878bp)。重组质粒经日HindⅢ-NotⅠ酶切后，得到3878bp(PLCr1基因)及6100bp(载体pLNCX2)两个片段，同时重组质粒经HindⅢ-BglⅡ酶切后．得到约1300bp及约8500bp两个片段，与预期一致。DNA测序也证实了重组质粒的正确。经RT-PCR和Westem blot分析证实转染pLNCX2／PLCr1的LoVo细胞中PLCr1的表达均高于转染空质粒pLNCX2的LoVo细胞及未转染的LoVo细胞。结论成功构建了人全长PLCr1基因真核表达载体pLNCX2／PLCr1，为进一步研究PLCr1的作用奠定了基础。     

大鼠GPR17基因真核表达载体的构建及其功能鉴定

目的:构建大鼠GPR17(rGPR17)基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并对其功能进行初步研究.方法:从大鼠脑组织提取总RNA,通过RT-PCR扩增rGPR17 cDNA,与载体pcDNA3.1(+)连接,并转化到大肠杆菌DH5α以获得重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,以PCR、双酶切和测序鉴定;将重组载体pcDNA3.1(+)-rGPR17通过脂质体转染方法,转染HEK293细胞,RT-PCR、免疫荧光法检测rGPR17的表达,Fluo-4测定激动剂LTD_4处理后细胞内钙变化.结果:RT-PCR、双酶切和测序证明,重组的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17构建成功,并在HEK293细胞获得表达,加入外源性激动剂LTD_4可诱导细胞内钙的增加.结论:成功构建了rGPR17的真核表达载体pcDNA3.1(+)-rGPR17,并在HEK293细胞功能性表达,为GPR17受体及其拮抗剂的研究提供了基础.     

刚地弓形虫肌动蛋白profilin的原核表达和纯化

目的：探讨刚地弓形虫肌动蛋白profilin （TgPRF）的原核表达体系和纯化条件,为后续的抗肿瘤免疫佐剂研究提供依据。方法：以弓形虫RH株速殖子的cDNA为模板,采用一对特定的引物扩增TgPRF基因的编码区。PCR产物双酶切后克隆入pET28a （+）载体中。重组的pET28a （+）-TgPRF质粒转化E.coli DH5α感受态细胞。双酶切鉴定阳性克隆,并选取测序正确的质粒转化E.coli BL21（DE3）表达菌,经IPTG诱导表达4 h,SDS-PAGE法检测TgPRF蛋白的表达,Western blotting法检测重组蛋白His-prolilin的表达。结果：PCR扩增产物长度为492 bp。经双酶切和测序,重组质粒pET28a-TgPRF连接产物构建成功。SDS-PAGE检测,目的蛋白在超声菌液的上清中表达。经Ni-NTA琼脂糖凝胶柱纯化,获得纯化的TgPRF蛋白（纯度>90%）。Western blotting检测,重组TgPRF蛋白能被Anti-His抗体识别。结论：成功构建重组质粒pET28a-TgPRF,并实现可溶性原核表达。     

重组pEGFP-C2-FOXC1-C真核表达质粒的构建与表达

目的:将人FOXC1-C基因定向连入pEGFP-C2质粒,使FOXC1-C蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞内融合表达,为进一步研究FOXC1-C蛋白的功能及定位奠定实验基础。方法:采用EcoR I和NotI双酶切方法,从pcDNA3.1(+)-FOXC1-C质粒中获得FOXC1-C蛋白的cDNA羧基末端;连入pEGFP-C2质粒的C端。将构建成功的pEGFP-C2-FOXC1-C质粒转染入HeLa细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。结果:(1)将该质粒进行双酶切鉴定可见FOXC1-C片段;(2)转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:(1)FOXC1-C cDNA羧基末端成功连入pEGFP-C2质粒(;2)FOXC1-C蛋白可与绿色荧光蛋白在HeLa细胞中融合表达。     

人脂联素球型结构域原核表达重组质粒的构建及体外表达

目的 通过分子克隆表达人脂联素基因球型结构域(gAd),为进一步研究提供实验基础.方法 应用RT-PCR方法从人大网膜脂肪组织总RNA中扩增出gAd cDNA,克隆人载体pMD18-T,pET32a( )中,形成重组质粒gAd.pET32a( ).筛选出阳性克隆,通过限制性内切酶酶切、PCR和测序进行鉴定,并在体外进行小量表达.结果 从脂肪组织总RNA中扩增得到412 bp片段gAd基因,其cDNA序列与GenBank人gAd基因序列相同,并在体外表达得到相对分子质量为34000的重组蛋白.结论 成功构建了gAd基因原核表达质粒并实现体外的小量表达.