大劣按蚊血淋巴酚氧化酶与约氏疟原虫卵囊黑化关系的研究

目的：探讨大劣按蚊血淋巴酚氧化酶（PO）与约氏疟原虫卵囊黑化的关系。方法：以大劣按蚊/约氏疟原虫模型，利用聚丙酰凝胶电泳后的酶底物显色法，比较、分析血餐后5、7、11、15d时不吸血组、吸正常血组和感染组3组的雌大劣按蚊血淋巴酚氧化酶的单酚氧化酶（MPO）和双酚氧化酶（o-DPO)活性；同时观察感染组约氏疟原虫的感染度及其卵囊黑化比率。结果：感染组的血淋巴MPO和o-DPO酶活性明显高于不吸血组和吸正常血组（P＜0.05)；但是随着约氏疟原虫卵囊黑化比率的增高，感染组血淋巴MPO和o-DPO活性逐渐下降。另外，吸正常血组的MPO和o-DPO酶活性明显高于不吸血组（P＜0.05)。结论：吸血和约氏疟原虫的感染均能激活大劣按蚊前酚氧化酶级联反应，而大劣按蚊血淋巴酚氧化酶可能在大劣按蚊对黑化约氏疟原虫卵囊中发挥重要作用。     

约氏疟原虫卵囊黑化期间大劣按蚊血淋巴蛋白的分析

目的　初步探讨大劣按蚊 (Anophelesdirus)黑化包被约氏疟原虫 (Plasmodiumyoelii)卵囊相关蛋白。方法　挤压法分别收集血餐后第 1、3、4、5天时不吸血组、吸正常血组和感染组的雌大劣按蚊血淋巴 ,经SDS PAGE分离后 ,银染显色。同时 ,用烟草天蛾 (ManducaSexta)前酚氧化酶 (Prophenoloxidase ,PPO)亚基 1IgG检测正常雌大劣按蚊血淋巴中的PPO。结果　SDS PAGE发现感染约氏疟原虫后 ,部分大劣按蚊的血淋巴蛋白带增强 ,而部分血淋巴蛋白带却减弱 ,免疫印迹发现大劣按蚊血淋巴PPO有 87× 10 3 、6 7× 10 3 、6 3× 10 53条蛋白带 ,而相应分子量的 3条蛋白带在约氏疟原虫感染后第 4、5天开始增强 ,其中尤以 87× 10 3 的增强最为明显。结论　大劣按蚊在对约氏疟原虫卵囊黑化包被期间诱导合成的某些血淋巴蛋白与前酚氧化酶级联反应主要成分有关联     

海南省大劣按蚊感染约氏疟原虫试验观察

由于斯氏按氏(ArophelesStephensi)对人疟原虫很敏感,可传播人疟,用此蚊种作疟疾研究,具有一定的危险,因此在国内蚊种中找出对约氏疟原虫敏感的实验媒介,即摸索建立约氏疟原虫——大劣按蚊系统的研究具有重要实用价值。我们从1990年5月起开始用大劣按蚊感染约氏疟原虫进行了试验观察。现将结果报告如下:     

感染约氏疟原虫前后大劣按蚊血淋巴的差异表达蛋白分析

目的获得并分析感染约氏疟原虫前后大劣按蚊血淋巴的差异表达蛋白.方法利用二维电泳方法分别分离感染约氏疟原虫前后的大劣按蚊血淋巴蛋白,进行考马斯亮蓝染色,并利用PDQuest 2D Elite软件分析和比较凝胶结果;对感染约氏疟原虫前后的差异表达蛋白进行质谱分析,获得肽质量指纹图谱;利用Mascot软件系统,在Swiss-Prot等数据库中检索和分析所获得的肽质量指纹图谱.预测差异表达蛋白的生物学特性和在卵囊黑化中的功能.结果获得了分辨率和重复性均较好的二维电泳图,感染组凝胶可见120个蛋白点,正常组凝胶可见95个蛋白点,二者比较分析后发现有37个差异蛋白点;质谱分析获得3个肽质量指纹图谱,于蛋白数据库检索后未发现匹配分值很高的相关蛋白,其中差异蛋白点1与冈比亚按蚊一蛋白具有较高的同源性.结论获得了感染约氏疟原虫前后大劣按蚊血淋巴的差异蛋白和部分差异蛋白的相关信息,这为从蛋白水平认识蚊媒和疟原虫的相互关系和更深入地利用大劣按蚊-约氏疟原虫模型开展卵囊黑化的相关研究奠定了基础.     

大劣按蚊对约氏疟原虫卵囊黑化相关血细胞类型的初步鉴定

目的鉴定与抗疟黑化反应相关的大劣按蚊血细胞.方法采用姬氏染色法初步鉴定大劣按蚊血细胞类型,继而利用免疫细胞化学技术检测大劣按蚊血细胞内前酚氧化酶和丝氨酸蛋白酶.结果颗粒细胞和浆细胞为大劣按蚊主要血细胞,前酚氧化酶和丝氨酸蛋白酶也主要分布于颗粒细胞和浆细胞内,其中颗粒细胞最常见.结论抗疟黑化相关性血细胞可能主要为颗粒细胞和浆细胞.     

斯氏按蚊血淋巴在约氏疟原虫卵囊黑化时差异表达蛋白的SDS-PAGE分析

目的　初步了解约氏疟原虫感染后的雌斯氏按蚊成蚊吸饲硝喹蔗糖水和蔗糖水后不同时间的血淋巴蛋白差异表达。方法　挤压法分别收集两组雌斯氏按蚊成蚊 1～ 5d的血淋巴 ,经SDS PAGE ,考马斯亮蓝和银染显色 ,Bio Rad10 0 0凝胶图像分析系统进行扫描和差异蛋白条带的自动化分析。结果　用药第 2天少数蚊卵囊开始部分黑化 ,第 5～9天黑化蚊及其黑化卵囊逐渐增多。用药后第 3天处理组蚊血淋巴蛋白条带数明显多于对照组 ,两组间存在较多差异蛋白带 ,主要集中在 ( 2 0～ 40 )× 10 3、( 60～ 80 )× 10 3和 13 0× 10 3处。银染比考马斯亮蓝染色出现的蛋白条带数多。结论　约氏疟原虫感染的雌斯氏按蚊成蚊吸饲硝喹糖水后其血淋巴蛋白表达有差异 ,其差异蛋白很可能就是黑化相关蛋白     

约氏疟原虫感染诱导大劣按蚊AdSP1 和AdSP3的转录

目的观察丝氨酸蛋白酶AdSP1 和AdSP3在大劣按蚊主要组织中的表达,分析血餐和约氏疟原虫感染对大劣按蚊血细胞AdSP1 和AdSP3转录的影响.方法离心收集血细胞,解剖分离大劣按蚊蚊胃和唾液腺,提取相应的总RNA,RT-PCR扩增;然后将同批3～5 d龄大劣按蚊分为正常组(N)、吸正常血组(B)和感染约氏疟原虫组(I),分别在血餐后1、2、3、4、7 d和11 d,收集3组各50只雌大劣按蚊血细胞和提取总RNA,以Ads7为内参照,进行半定量RT-PCR分析.结果丝氨酸蛋白酶AdSP1 和AdSP3在大劣按蚊血细胞和唾液腺中表达,不在蚊胃表达;吸血和约氏疟原虫感染后,大劣按蚊血细胞中AdSP1 和AdSP3的转录上调,尤以约氏疟原虫黑化期间明显.结论 AdSP1和AdSP3可能参与大劣按蚊对约氏疟原虫的黑化反应,并可能是大劣按蚊的PPAE.     

约氏疟原虫感染斯氏按蚊与大劣按蚊前后中肠前酚氧化酶的变化

目的比较分析约氏疟原虫感染斯氏按蚊与大劣按蚊前后中肠前酚氧化酶(prophenoloxidase,PPO)的分布及其变化,探讨中肠PPO与按蚊抗疟原虫感染免疫防御反应的关系.方法解剖分离约氏疟原虫感染前和感染后3、5、7、11和15 d斯氏按蚊与大劣按蚊的中肠.利用烟草天蛾PPO抗体分别进行免疫组化染色和免疫印迹分析.结果斯氏按蚊与大劣按蚊在未感染约氏疟原虫前的中肠循环管道内均已存在PPO,而感染后循环管道内的PPO扩散到中肠组织间隙并聚集成片状、块状或条索状,大劣按蚊中肠PPO的聚集程度大于斯氏按蚊;在感染前和感染后不同时期免疫印迹均可检测到斯氏按蚊与大劣按蚊中肠PPO蛋白带,分子量约为67×103,感染后的PPO蛋白带型比感染前明显增强,而且大劣按蚊中肠PPO蛋白带型比斯氏按蚊尤为明显.结论约氏疟原虫感染前按蚊中肠循环管道内存在的PPO可能是经与血淋巴相通的循环管道扩散而来,感染后导致的中肠内PPO不同分布及其变化可能与疟原虫感染按蚊密切相关,并可能具有重要的生理学意义以及与激活按蚊抗疟原虫感染的免疫防御反应相关.     

斯氏按蚊黑化包被约氏疟原虫卵囊时血淋巴蛋白的二维电泳分析

目的以斯氏按蚊-约氏疟原虫为模型,用二维电泳技术分析比较约氏疟原虫感染后雌性斯氏按蚊吸饲硝喹蔗糖水和蔗糖水蚊血淋巴蛋白差异.方法用挤压法分别收集吸硝喹糖水3 d、吸感染血和吸蔗糖水雌斯氏按蚊成蚊血淋巴,Bradford法检测血淋巴蛋白浓度,继而对血淋巴进行双向电泳,凝胶考马斯亮蓝染色,ImageMaster VDS-CL对二维电泳凝胶蛋白斑点扫描和用ImageMaster 2D Elite软件进行蛋白质斑点自动分析.结果用药组血淋巴蛋白浓度总是低于吸感染血组和吸糖水组,用药组蚊血淋巴蛋白点有101个,对照组有115个,有51个蛋白点相同.50个仅在用药组中检测到,64个仅在对照组中检测到;蛋白点的分子量和等电点主要位于(40～60)×103和碱性端.结论二维电泳技术可直接反映蛋白质的差异,其蛋白浓度和白点的差异与硝喹诱导疟原虫卵囊黑化有关.     

吸血和约氏疟原虫感染对大劣按蚊血细胞中rpS7转录的影响

目的　观察血餐和约氏疟原虫感染对大劣按蚊血细胞中核糖体蛋白S7(Ribosomalprotein ,rpS7)转录的影响。方法　同批 3～ 5d龄大劣按蚊分为正常组 (N)、吸正常血组 (B)和感染约氏疟原虫组 (I) ,分别在血餐后 1、2、3、7d ,离心法同时收集 3组各 5 0只雌大劣按蚊血细胞总RNA ,所有样品进行RT PCR后 ,各吸取 10ulPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳 ,凝胶图像分析系统扫描并读取数据 ,并对所得数据进行统计学分析。结果　 3组大劣按蚊血细胞rpS7mRNA的RT PCR扩增产物量无显著差异 (P >0 0 5 )。结论　类似于人类和小鼠 β actin ,以及冈比亚按蚊rpS7,大劣按蚊血细胞rpS7可作为从分子水平研究大劣按蚊抗约氏疟原虫感染防御相关因子的内参照     

吸血和约氏疟原虫感染对AdPPOs基因家族转录水平的影响

目的观察血餐和约氏疟原虫感染对AdPPO1、AdPPO2和AdPPO3基因转录水平的影响.方法同批3～5 d龄大劣按蚊分为不吸血组(N)、吸正常血组(NB)和吸感染血组(IB),在血餐后24 h分别制备各组蚊总RNA,所有样品进行RT-PCR后,各吸取10 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,凝胶图像分析系统扫描并读取数据,并对所得数据进行统计学处理.结果与不吸血组比较,吸血组和感染组AdPPO1的转录水平显著下降(P<0.05),但吸血组和感染组间没有显著性差异(P>0.05).吸血组AdPPO2的转录则明显上调(P<0.05),但与感染组间没有显著性差异(P>0.05);AdPPO3基因的转录水平在3组间均没有显著性差别(P>0.05).结论血餐明显抑制AdPPO1基因的转录,但明显上调AdPPO2基因的转录水平;约氏疟原虫感染后24 h,AdPPO1,AdPPO2和AdPPO3基因的转录水平均不受影响.     

Effects of mosquito hemocytes on normal and degenerated oocysts of Plasmodium yoelii and their role in oocyst melanization

ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｍｏｓｑｕｉｔｏｈｅｍｏｃｙｔｅｓｏｎｎｏｒｍａｌａｎｄｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｏｏｃｙｓｔｓｏｆＰｌａｓｍｏｄｉｕｍｙｏｅｌｉｉａｎｄｔｈｅｉｒｒｏｌｅｉｎｏｏｃｙｓｔｍｅｌａｎｉｚａｔｉｏｎ￥ＨｕａｎｇＦｕｓｈｅｎｇ（黄复生）；Ｗ...     

二维电泳-质谱分析斯氏按蚊中约氏疟原虫卵囊黑化相关的差异表达蛋白

目的　用 2 DE和PMF分离和鉴定约氏疟原虫卵囊黑化相关的斯氏按蚊中肠和血淋巴差异表达蛋白。方法　用固相pH梯度二维电泳分离中肠和血淋巴差异表达蛋白 ,考马斯亮蓝染色 ,ImageMasterVDS CL凝胶扫描和PDQuest2DElite软件分析 ,差异蛋白质点用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱测定其胶内酶解后的肽质指纹图谱 ,用PeptIdent软件查询SWISS PROT数据库。结果　获得了分辨率和重复性均较好的 2 DE考马斯亮蓝图谱 ,吸硝喹糖水组蚊血淋巴和中肠蛋白点分别有 10 1个和 10 4个 ,感染组分别有 115个和 162个 ,匹配点分别为 5 1个和 44个。斯氏按蚊血淋巴和中肠蛋白质组中蛋白点分别主要分布于酸性端和碱性端 ,血淋巴和中肠差异蛋白也分别主要分布于酸性端和碱性端。随机取2 5个差异蛋白点进行胶内原位酶解 肽质指纹图谱分析得到了 16个蛋白质肽质指纹图 ,查询数据库初步鉴定了 8个蛋白质 ,分别为与抗疟免疫、黑化、结构、糖代谢、细胞通讯等相关蛋白。结论　建立了一套重复性和分辨率较好的斯氏按蚊蛋白质分离和鉴定的二维凝胶电泳 肽质谱指纹分析法 ,约氏疟原虫卵囊黑化前后 ,斯氏按蚊血淋巴和中肠伴随大量差异表达蛋白 ,部分蛋白可能与黑化有关。     

大劣按蚊丝氨酸蛋白酶AdSP3的组织定位和定量研究

目的 对大劣按蚊丝氨酸蛋白酶3(AdSP3)的表达进行组织定位和定量研究.方法 首先利用RT-PCR方法对大劣按蚊血淋巴细胞、唾液腺和蚊胃进行AdSP3的扩增,然后利用Realtime PCR对大劣按蚊感染约氏疟原虫后不同时相点的血淋巴细胞AdSP3表达水平进行定量研究.结果 从血淋巴细胞和唾液腺均成功扩增出目的片段;...