九节龙皂苷Ⅰ对口腔黏液表皮样癌Mc3细胞的增殖抑制作用

目的:研究九节龙皂苷Ⅰ(ardipusilloside Ⅰ)对口腔黏液表皮样癌Mc3细胞的增殖抑制与促细胞凋亡作用,以探讨九节龙皂苷Ⅰ的抗肿瘤作用机制。方法:利用MTT法检测九节龙皂苷Ⅰ对Mc3细胞生长抑制率的影响;采用FCM观察细胞周期并检测细胞凋亡率。结果:九节龙皂苷Ⅰ作用于Mc3细胞,在小剂量情况下对细胞杀伤作用较轻,随着药物浓度的增加,细胞生长抑制,其作用特点表现为明显的浓度依赖性,九节龙皂苷Ⅰ对Mc3细胞作用的IC50值为9.98μg/ml。10μg/ml和20μg/ml的九节龙皂苷Ⅰ组的凋亡率分别为24.83%±0.08%和42.63%±0.07%,与对照组7.63%±0.14%相比,凋亡率明显增高。结论:九节龙皂苷Ⅰ可抑制口腔黏液表皮样癌Mc3细胞的增殖并诱导细胞凋亡。     

外源性PTEN基因诱导黏液表皮样癌细胞系凋亡的研究

目的：探讨转染外源性PTEN抑癌基因对黏液表皮样癌细胞系M3SP2的诱导凋亡作用。方法：用含野生型PTEN抑癌基因逆转录病毒载体转染高转移性涎腺黏液表皮样癌细胞系M3SP2,转染空载体亲本细胞为对照细胞。体外细胞凋亡采用苏木精-伊红染色、电镜、TUNEL染色和流式细胞仪检测,裸鼠移植瘤细胞凋亡应用苏木精-伊红染色形态学判定。Bc l-2、P53和H-ras蛋白表达用免疫组化染色检测。结果：试验细胞M3SP2-PTEN与对照细胞M3SP2-pBp比较,出现较多的典型的凋亡细胞特征。试验细胞和对照细胞凋亡率分别为7.5%-13.6%和1.2%-2.3%;裸鼠移植瘤M3SP2-PTEN组和M3SP2-pBp组的凋亡指数分别为17.4%和3.5%。免疫组化染色显示M3SP2-PTEN细胞与对照细胞比较,P53蛋白表达增强,Bc l-2和H-ras蛋白表达减弱。结论：外源性PTEN抑癌基因能显著诱导高转移性涎腺黏液表皮样癌细胞凋亡,并且与P53、Bc l-2和H-ras蛋白表达有一定关系。     

survivin反义寡核苷酸对人涎腺腺样囊性癌细胞凋亡的影响

目的:探讨survivin反义寡核苷酸(ASODN)对人腺样囊性癌细胞(ACC-M) 凋亡及survivin基因表达的影响.方法:设计合成针对survivin基因的反义寡核苷酸片段,脂质体介导survivin反义寡核苷酸转染SACC-M细胞,通过RT-PCR,Western-blotting检测survivin表达的改变,MTT测定细胞增殖抑制,流式细胞术测定细胞凋亡率.结果:转染ASODN组survivin表达下降,细胞凋亡率明显提高,细胞增殖明显受抑制,且与浓度有一定依赖性;SODN组、空白组与对照组无明显差异.结论:survivin ASODN能下调SACC-M细胞系中survivin的表达,在促进凋亡,抑制增殖中发挥重要作用.     

PTEN基因联合多西环素对黏液表皮样癌细胞侵袭的抑制作用

目的：探讨PTEN抑癌基因联合多西环素对高转移性涎腺黏液表皮样癌细胞系体外粘附、迁移和侵袭的影响。方法：用脂质体将野生型PTEN基因导入人黏液表皮样癌细胞系,再用10mg/L多西环素处理细胞3d,采用MTT比色法测定细胞粘附,划伤愈合实验测定细胞迁移,趋化Transwell法测定细胞侵袭。结果：PTEN基因转染和Dox分别处理黏液表皮样癌细胞导致癌细胞粘附、迁移和侵袭受到不同程度的抑制。PTEN基因转染联合多西环素对癌细胞的抑制作用更强,癌细胞在Metrigel和Fn基质上的粘附抑制率分别为37.4%和70.6%;癌细胞迁移抑制率为60.9%;癌细胞侵袭抑制率为65.1%。结论：PTEN抑癌基因联合多西环素对黏液表皮样癌细胞系体外粘附、迁移和侵袭具有显著的协同抑制效应。     

趋化因子受体CXCR4 shRNA真核表达载体的构建

目的：构建趋化因子受体（CXCR4）特异的RNA干扰质粒载体。方法：根据GenBank数据库提供的CXCR4基因核苷酸序列,选择设计能转录短发夹状RNA（short hairpin RNAs,shRNA）的DNA序列,并与pWH1质粒载体连接,用酶切的方法进行鉴定;将构建成功的特异性表达载体（pWH1-CXCR4）稳定转染至人涎腺黏液表皮样癌Mc3细胞系,并应用RT-PCR和流式细胞术对细胞CXCR4的表达进行检测。结果：与Mc3细胞和转染空白质粒pWH1 Mc3细胞相比,转染pWH1-CXCR4表达载体的Mc3细胞CXCR4 mRNA和蛋白的表达明显降低。结论：构建的CXCR4特异性shRNA表达载体可有效的沉默CXCR4基因,为进一步研究CX-CR4表达对涎腺黏液表皮样癌增殖和转移的意义及治疗涎腺黏液表皮样癌奠定了基础。     

PTEN基因联合多西环素抑制黏液表皮样癌细胞系端粒酶活性的研究

目的探讨外源性PTEN抑癌基因联合多西环素对人黏液表皮样癌细胞系端粒酶活性的影响。方法用脂质体将野生型PTEN基因导入黏液表皮样癌细胞系,再用不同质量浓度的多西环素处理细胞,采用MTT比色法测定细胞存活,用端粒酶重复扩增法-酶联免疫吸附（TRAP-ELISA）测定细胞端粒酶活性。结果与对照细胞比较,野生型PTEN基因明显增加癌细胞对多西环素的敏感性,增敏比为1.65～4.75倍。PTEN基因转染或多西环素诱导癌细胞端粒酶活性明显下降（P＜0.05）,二者联合应用对癌细胞端粒酶活性抑制更为显著（P＜0.01）。结论PTEN抑癌基因联合多西环素对人黏液表皮样癌细胞系端粒酶活性具有显著的协同抑制效应。     

生存素基因沉默增强人舌鳞状细胞癌Tca8113对顺铂敏感性的实验

目的探讨靶向生存素短发夹状RNA（short hairpin RNA，shRNA）对人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞株生存素基因表达、凋亡及其对顺铂、5-氟尿嘧啶（5-Fu）敏感性的影响。方法脂质体介导的生存素shRNA表达载体转染Tea8113细胞，未转染、转染脂质体及错配shRNA载体的细胞作为对照。采用RT-PCR和Western blot分别检测生存素mRNA和蛋白的表达，流式细胞仪分析细胞的凋亡率，MTT法测定抗癌药物的敏感性。结果生存素shRNA表达质粒转染后，与3个对照组相比较，生存素mRNA和蛋白表达水平明显下降，细胞凋亡率的上升呈时间依赖性，48h可达37．9％。生存素shRNA能显著增加顺铂的敏感性，与未转染组比较其IC50值下降约4／5（P〈0．01），但对5-Fu的作用不明显。结论靶向生存素的shRNA可有效抑制Tea8113细胞生存素mRNA和蛋白的表达，同时增加了顺铂的化疗敏感性。     

Survivin 和 PDCD5在黏液表皮样癌组织中的表达及临床意义

目的：探讨存活素（Survivin）和细胞程序性死亡因子5（PDCD5）在黏液表皮样癌组织中的表达及临床意义。方法：采用免疫组化 Elivision 二步法检测20例正常腮腺组织（A 组）、40例多形性腺瘤（B 组）及45例黏液表皮样癌（C 组）组织中 Survivin 和 PDCD5蛋白的表达情况。结果：（1）Survivin 在 A、B、C 组中表达阳性率分别为10％、27．5％、55．6％（χ2＝14．556,P ＜0．01）,PDCD 表达阳性率分别为85％、65％、33．3％（χ2＝17．439,P ＜0．01）;（2）Survivin 和 PDCD5的表达与肿瘤的分化程度、有无淋巴结转移及 TNM分期有关（P ＜0．05）;（3）Survivin 和 PDCD5在黏液表皮样癌中的表达呈负相关（χ2＝4．500,P ＝0．034,γs ＝－0．316）。结论：Survivin 高表达,PDCD5低表达在在黏液表皮样癌发生发展中可能发挥作用。     

外源性PTEN抑癌基因对高转移性黏液表皮样癌细胞系形态的影响

目的 :观察外源野生型PTEN基因对高转移性黏液表皮样癌细胞系形态的影响。方法 :应用倒置显微镜观察法、HE染色观察、扫描电镜及透射电镜观察法 ,比较野生型PTEN抑癌基因转染的黏液表皮样癌细胞M 3SP2 PTEN与对照的黏液表皮样癌细胞M 3SP2 pBp的形态学差异。 结果 :M 3SP2 pBp细胞体外生长活跃 ,细胞数量多 ,核分裂相多 ,细胞表面微绒毛丰富 ,细胞核切迹明显 ,细胞质中线粒体丰富 ;M 3SP2 PTEN细胞生长缓慢 ,分裂相很少 ,细胞数量少 ,部分细胞空泡变性 ,染色质凝集 ,细胞膜彭出 ,线粒体数量少并发生肿胀 ,较多的溶酶体融合。结论 :外源野生型PTEN基因的转染能导致体外培养的高转移性黏液表皮样癌细胞变性、坏死或凋亡。     

紫杉醇联合肿瘤坏死因子α诱导粘液表皮样癌细胞凋亡的实验研究

目的探讨人肿瘤坏死因子α（TNF-α）联合紫杉醇对人黏液表皮样癌细胞系（MEC-1）的抑制增殖作用及与细胞凋亡的关系,为化疗与生物治疗联合应用治疗粘液表皮样癌提供实验依据。方法将人黏液表皮样癌细胞系（MEC-1）和对照组原代培养鼠肺成纤维细胞（LFB）分为9组,每组给予不用药物浓度作用72h。3H-TDR法检测细胞增殖抑制率;流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞周期改变;透射电镜观察凋亡细胞形态变化。结果联合用药组的细胞增殖抑制率显著高于单独用药组（P〈0.05）。LFB细胞各组的细胞增殖抑制率显著低于MEC-1细胞（P〈0.05）。结论TNF-α联合紫杉醇对MEC-1细胞增殖的抑制作用以及诱导凋亡具有协同作用。     

生存素、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3在口腔癌前病变及口腔癌中的表达

目的 探讨生存素(survivin)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)在口腔癌发生中的作用,以期为口腔癌的监测和治疗提供参考.方法 选取首都医科大学口腔医学院病理科存档石蜡标本45例,其中口腔白斑伴上皮轻-中度异常增生16例,口腔白斑伴上皮重度异常增生12例,口腔高-中分化鳞状细胞癌17例;正常口腔黏膜组织10例.采用免疫组化SP法对生存素、caspase-3的表达进行检测;脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的原位缺口末端标记法对细胞凋亡指数进行检测.结果 生存素表达在正常黏膜、白斑伴上皮轻-中度异常增生、白斑伴上皮重度异常增生及口腔癌中逐渐增加,阳性细胞率分别为(1.05±1.21)%、(6.06 ±4.87)%、(12.49 ±8.41)%和(21.89±10.45)%;caspase-3的表达在3个病例组中逐渐下降,正常对照、白斑伴上皮轻-中度异常增生、白斑伴上皮重度异常增生及口腔鳞状细胞癌组阳性细胞率分别为(12.37 ±5.48)%、(19.51 ±13.15)%、(9.76±7.83)%和(6.08 ±6.91)%;正常对照、白斑伴轻-中度异常增生、白斑伴重度异常增生及口腔鳞状细胞癌组凋亡指数分别为(0.89 ±0.46)%、(1.29 ±0.63)%、(0.65 ±0.40)%和(0.21 ±0.12)%,前3组与口腔鳞状细胞癌组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 生存素在口腔癌的发生过程中起重要作用,随着生存素表达的增加,caspase-3和凋亡指数呈下降趋势;生存索可能通过抑制caspase-3的表达,从而抑制细胞的凋亡,促进口腔癌的发生.     

生存素反义寡核苷酸对血管瘤血管内皮细胞增殖及Caspase-3活性影响研究

目的 观察生存素(Survivin)反义寡核苷酸(ASODN)对人血管瘤血管内皮细胞凋亡的影响,并初步探讨其作用机制.方法 实验于2007年12月至2010年2月完成.以靶向Survivin基因中与Caspase-3结合的部位为模板,设计合成ASODN并通过脂质体将其转染至人血管瘤血管内皮细胞中.MTT观察Surv...     

苯丁酸钠对人舌鳞状细胞癌细胞凋亡影响机制的探讨

目的 探讨苯丁酸钠对人舌鳞状细胞癌Tca8113和TCSSA细胞株的生长、凋亡的影响及其分子机制,为临床治疗提供理论依据.方法 应用甲基噻唑基四唑(MTT)法检测苯丁酸钠对人舌鳞状细胞癌细胞株的抑制作用,采用流式细胞仪研究苯丁酸钠对人舌鳞状细胞癌细胞株的细胞周期阻滞和诱导凋亡作用,应用蛋白质印迹法和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测p21和生存素基因的转录和表达.结果 苯丁酸钠对两种细胞株增殖均有明显的抑制作用;流式细胞仪检测显示苯丁酸钠诱导细胞株G1期阻滞,碘化丙啶-异硫氰酸荧光素标记的磷脂酰结合蛋白双标结果表明,苯丁酸钠能诱导细胞株凋亡,使p21的mRNA及蛋白质表达升高,与对照组比较,Tca8113细胞株的p21 mRNA及蛋白质分别增加0.09±0.08和0.72±0.10,TCSSA细胞株的p21mRNA及蛋白质分别增加1.34 4±0.12和1.56±0.09(P<0.05).生存索的mRNA及蛋白质表达下降.与对照组比较,Tca8113细胞株的生存素mRNA及蛋白质分别降低1.10±0.05和1.14±1.10,TCSSA细胞株的生存素mRNA及蛋白质分别降低1.02±0.08和0.94±0.09(P<0.05).苯丁酸钠诱导p21表达上升和生存素表达下降,二者的mRNA水平变化呈显著负相关(rs=-0.532,P<0.001),蛋白表达变化同样呈显著负相关(rs=-0.564,P<0.001).结论 苯丁酸钠能抑制人舌鳞状细胞癌细胞株增殖,诱导细胞G1期阻滞和细胞凋亡.     

17β-雌二醇对涎腺黏液表皮样癌高转移细胞Mc3黏附、侵袭和移动力的影响

目的研究17β-雌二醇对涎腺黏液表皮样癌高转移细胞Mc3黏附、侵袭和移动力的作用。方法采用细胞体外黏附实验、体外移动实验、化学趋化性实验以及明胶底物SDS—PAGE凝胶电泳对基质金属蛋白酶（MMP）活性测定的方法研究17β-雌二醇对Mc3细胞黏附、侵袭和移动力可能存在的作用，用免疫组化的办法检测Mc3细胞的雌激素受体的表达。结果不同浓度（10^-9、10^-8、10^-7、10^-6mol／L）的17β-雌二醇处殚Mc3细胞72h后，其黏附率分别为38．3％、50．4％、69．2％、91．1％；而对照组为25．0％；作用48h后，10^-9、10^-8、10^-7、10^-6mol／L的17β-雌二醇对Mc3细胞在纤维连接蛋白（FN）上的移动促进率分别为16．9％、40．9％、36．4％、38．8％。在10^-6mol／L的17β-雌二醇的作用下，其对FN的化学趋化性增加60．3％。10^-9、10^-8、10^-7、10^-6mol／L的17β-雌二醇均可不同程度的促进Mc3细胞基质金属蛋白酶（MMP-2）的活性，在10^-6mol／L时尤为显著。在Mc3细胞中有雌激素核受体的表达。结论生理浓度的雌激素可促进Mc3细胞的黏附、侵袭和移动力。     

采用RNA干扰技术沉默survivin基因对口腔鳞状细胞癌细胞凋亡的影响

目的 应用RNA干扰（RNAi）技术抑制口腔鳞状细胞癌细胞株HSC-3细胞凋亡抑制因子survivin基因的表达，促进HSC-3细胞的凋亡。方法 合成针对survivin基因的小干扰RNA（siRNA），转染对数生长期的HSC-3细胞。采用半定量逆转录聚合酶链反应检测HSC-3细胞中survivin mRNA的表达，MTT法测定细胞活性，tunnel分析和流式细胞术检测HSC-3细胞的凋亡，并设阴性对照组和空白对照组。结果 转染siRNA组survivin mRNA的表达明显低于阴性对照组和空白对照组；MTT法测定细胞活性，阴性对照组和空白对照组没有明显差别，但siRNA组的细胞活性明显下降；tunnel分析显示，转染siRNA组的凋亡细胞明显多于阴性对照组和空白对照组；流式细胞术分析，转染siRNA组的凋亡率（24.99％±1.33％）明显高于阴性对照组（1.24％±0.13％）和空白对照组（0.10％±0.02％）。结论 采用siRNA沉默survivin基因能促进口腔鳞状细胞癌细胞的凋亡，survivin siRNA基因治疗有可能成为口腔鳞状细胞癌治疗的新技术。     

裸鼠体内原位移植法筛选粘液表皮样癌高转移细胞

目的：筛选高转移人涎腺粘液表皮样癌细胞。方法：用人涎腺粘液表皮样癌细胞Mc3经裸鼠涎腺移植、鼠间原位移植、细胞培养技术获取所需细胞,用相差显微镜、电子显微镜、细胞计数法、染色体显示法、流式细胞术、软琼脂克隆形成法以及癌细胞裸鼠尾静脉注射法研究其生物学特性。结果：经4次鼠间原位移植,肺转移率为3／10。取转移灶行细胞培养,获得形态均一、生长旺盛的上皮样细胞,命名为M3SP4。M3SP4细胞所致肺肿瘤显示粘液表皮样癌组织学特征,细胞染色体为亚二倍体,仍保持人类染色体形态。M3SP4与Mc3形态相似,群体倍增时间（h）分别为23.9和25.9,S期细胞（％）分别占细胞周期26.8和15.3,克隆形成率（％）分别为54.6和30.2,经尾静脉注射后M3SP4细胞引起的肺转移结节比Mc3多35％。结论：M3SP4是转移力强于Mc3的人涎腺粘液表皮样癌细胞系,Mc3细胞经裸鼠涎腺移植、鼠间原位移植后转移力有所提高。     

新辅助化疗对口腔鳞状细胞癌Survivin表达影响及意义

目的研究新辅助化疗对口腔鳞状细胞癌组织中Survivn蛋白表达的影响。方法选择18例活检病理确诊为口腔鳞癌的临床病例,予DFP方案行术前新辅助化疗2个疗程,分别取新辅助化疗前、后肿瘤组织,另取唇裂修补术中切除的多余的唇组织为口腔正常组织对照组10例,共3组,进行免疫组化染色检测Survivin表达。结果正常口腔组织、新辅助化疗前、后肿瘤组织Survivin阳性细胞表达率分别为(14.50±1.96)%、(57.78±3.39)%、(45.72±2.32)%,组间比较F=814.37,P<0.05。Survivin平均吸光度值为12.75±1.13、77.90±12.64、47.17±15.08,组间比较F=90.98,P<0.05。结论 Survivin在DFP方案新辅助化疗后表达显著降低。     

神经钙黏素表达下调对舌鳞状细胞癌细胞生物学能力的影响

目的 研究神经钙黏素(N-cadherin)表达下调对舌鳞状细胞癌Tca8113细胞增殖、细胞周期、凋亡以及迁移的影响,并探讨其可能的分子机制.方法 利用LipofectamineTM2000将神经钙黏素siRNA转染舌鳞状细胞癌Tca8113细胞,将细胞分为3组:①未处理组;②对照siRNA组;③神经钙黏素siRNA组.分别收集转染后48 h的细胞,采用新型的细胞计数试剂盒(cell counting kit,CCK)8试剂分析转染神经钙黏素siRNA后对细胞增殖能力的影响;运用流式细胞术检测下调神经钙黏素表达对Tca8113细胞周期及细胞凋亡的影响;采用Boyden 小室实验分析下调神经钙黏素对舌鳞状细胞癌细胞Tca8113细胞迁移能力的影响;进一步采用蛋白质印迹法检测神经钙黏素表达下调对细胞增殖、细胞周期以及细胞迁移相关基因表达的影响.结果 神经钙黏素siRNA能明显下调舌鳞状细胞癌Tca8113细胞中神经钙黏素蛋白的表达,并显著抑制Tca8113细胞的增殖(P<0.05).细胞周期结果显示,神经钙黏素siRNA组中在G0/G1的细胞比率[(65.41±0.92)%]明显高于未处理组[(41.59±1.43)%]和对照siRNA组[(43.70±2.08)%],差异有统计学意义(F=216.839,P＝0.000).神经钙黏素siRNA组中细胞凋亡的比率[(25.66±1.36)%]明显高于未处理组[(2.38±0.14)%]和对照siRNA组[(2.81±0.12)%],差异有统计学意义(F=850.364,P=0.000).Boyden 小室体外侵袭实验结果表明,与未处理组和对照siRNA组相比,神经钙黏素siRNA组中Tca8113细胞的迁移能力显著下降,差异有统计学意义(F=140.858,P=0.000).蛋白质印迹法结果表明,与未处理组和对照siRNA组相比,神经钙黏素siRNA组中的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)2和MMP-9明显下调,而p21明显上调,且差异有统计学意义(P<0.05).结论 神经钙黏素在舌鳞状细胞癌的发生发展中可能具有重要的作用.

Abstract：

Objective To investigate the effect of downregulation of N-cadherin expression on cell proliferation, cell cycle, cell apoptosis and cell migration in tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113 cells. Methods N-cadherin siRNA was transfected into tongue squamous cell carcinoma cell line Tca8113 cells and Tca8113 cells were divided into three groups: untreated group, control siRNA group and N-cadherin siRNA group. The cells were harvested 48 h after transfection with N-cadherin siRNA. Cell proliferation of Tca8113 cells was examined by cell counting kit(CCK)-8 after transfection with N-cadherin, and the effects of downregulation of N-cadherin on cell cycle and cell apoptosis of Tca8113 cells were investigated by flow cytometry.The effect of downregulation of N-cadherin expression on cell migration of Tca8113 cells was observed by Boyden chamber experiment, and further expression changes of gene-related cell proliferation, cell cycle and cell migration were detected by Western blotting. Results N-cadherin siRNA downregulated the N-cadherin expression and significantly inhibited cell proliferation of Tca8113 cells (P<0.05). The results of cell cycle revealed that the percentage of G0/G1 phase in N-cadherin group [(65.41±0.92) %] was significantly higher than that in untreated group [(41.59±1.43)%] or control siRNA group [(43.70±2.08)%], and there was significant difference among the three groups (F=216.839,P＝0.000).The percentage of cell apoptosis in N-cadherin group [(25.66±1.36)%] was significantly higher than that in untreated group [(2.38±0.14)%] or control siRNA group [(2.81±0.12)%], and there was significant difference among the three groups (F=850.364,P=0.000). The cell number migrated into memebrane in N-cadherin group was significantly lower than that in untreated group and control siRNA group, and there was significant difference among the three groups (F=140.858,P=0.000). Further, compared with untreated group and control siRNA group, the expressions of matrix metalloproteinase(MMP)-2 and MMP-9 proteins were significantly downregulated and expression of p21 protein was significantly upregulated (P<0.05). Conclusions N-cadherin may play a role in occurrence and development of tongue squamous cell carcinoma.