过氧化氢对肠上皮细胞线粒体功能及细胞凋亡的影响

目的 :探讨活性氧在体外对肠上皮细胞线粒体功能和膜电位 (ΔΨmt)的影响及其与细胞凋亡的关系。方法 :肠上皮细胞株 (SW - 4 80 ) ,采用活性氧 (reactiveoxygenspecies,ROS)的代表物 -过氧化氢 (H2 O2 )损伤模型 ,用 5 0 μmmol/L ,10 0 μmmol/L ,2 0 0 μmmol/L ,4 0 0 μmmol/L和 4mmol/L作用 1,3,6 ,12及 2 4h。线粒体功能采用噻唑蓝法 (MTT法 ) ;用罗丹明 (Rhodamme- 12 3)荧光探针检查活细胞线粒体膜电位变化 ;用Annexin -V荧光探针 ,流式细胞仪检测早期凋亡细胞。结果 :H2 O2 在低浓度 (5 0 μmmol/L ,10 0 μmmol/L ,2 0 0 μmmol/L)时线粒体功能未见明显改变 ,在高浓度 (40 0 μmmol/L ,4mmol/L)时可导致线粒体功能下降 ,同时使线粒体膜电位显著降低 ,细胞凋亡率显著增加。结论 :线粒体参与了H2 O2 诱导肠上皮细胞的早期程序性死亡及随后的细胞死亡 ,这种损伤作用与线粒体功能和膜电位下降密切相关。     

过氧化氢对肠上皮细胞线粒体编码基因mRNA的影响

目的：观察过氧化氢处理对体外培养肠上皮细胞株SW－480线粒体编码基因mRNA的影响。方法：以400μmol/L和4mmol/L的过氧化氢处理人肠上皮细胞细胞株（SW－480)3h后，分离RNA,应用RT－PCR检测ATPase6、ATPase8、COI、COII及COIII mRNA的变化。结果：过氧化氢对肠上皮细胞线粒体编码基因mRNA的表达具有明显影响，但是这种改变不与过氧化氢的剂量呈现出一种一致的变化。结论：过氧化氢引起肠上皮细胞线粒体编码基因mRNA的明显改变。     

过氧化氢对原代心肌细胞及H9c2细胞的损伤作用

目的:考察过氧化氢对H9c2心肌细胞及原代心肌细胞损伤作用的相似性。方法:选用H9c2心肌细胞与新生大鼠原代心肌细胞,应用MTT法测定不同浓度过氧化氢对H9c2心肌细胞及原代心肌细胞活性的影响,观察两株细胞对过氧化氢损伤的敏感性。结果:600～1 600μmol/L的过氧化氢对H9c2心肌细胞及原代心肌细胞所造成的氧化损伤均具有浓度依赖性,1 200μmol/L的过氧化氢使H9c2心肌细胞的存活率降低40%～60%(P<0.01),表现出与原代心肌细胞相似的H2O2损伤敏感性(P>0.05)。结论:H9c2心肌细胞与原代心肌细胞对过氧化氢氧化损伤具有相似的作用和浓度依赖性。     

嗅鞘细胞上清液对抗过氧化氢诱导的星形胶质细胞损伤的线粒体机制

目的： 研究嗅鞘细胞上清液（olfactory ensheathing cell conditioned medium, OECCM）对星形胶质细胞的保护作用及其线粒体机制。方法： 先用500 μmol/L H₂O₂ 损伤星形胶质细胞20 min;再以50%的OECCM继续培养细胞24 h。MTT法检测星形胶质细胞的活性,Hoechst 33342 染色法和蛋白质印迹法检测细胞凋亡及凋亡相关蛋白caspase-3的表达;用JC-1染色法检测线粒体的膜电位。结果： OECCM能减少H₂O₂诱导的细胞凋亡,减少caspase-3的表达,并且使线粒体膜电位增高。结论： OECCM可以对抗500 μmol/L H₂O₂诱导的星形胶质细胞凋亡,其机制可能与稳定线粒体膜电位有关。     

过氧化氢对K562细胞凋亡的影响

目的：探讨活性氧对K562细胞凋亡的影响。方法：用过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)作用于对数生长期的K562细胞。结果：Hoechst 33258染色法观察到K562细胞明显凋亡；caspase活性定量测定及Western Blotting检测显示caspase-3，-8，-9同时被激活。结论：H2O2可诱导K562细胞凋亡，且通过同时激活线粒体途径和死亡受体途径起作用。     

内毒素对过氧化氢引起的神经胶质瘤C6细胞损伤的影响

目的：观察内毒素(LPS)对过氧化氢(H₂O₂)诱导的神经胶质瘤C6细胞损伤的影响,探讨其相关机制。方法：C6细胞按处理方法不同分为空白对照组、100 μmol•L^-1 LPS组、1 000 μmol•L^-1 H₂O₂组及1 000 μmol•L^-1 H₂O₂与100μmol•L^-1 LPS联合应用组。药物作用C6细胞6 h,取培养液上清与细胞沉淀,利用LDH检测试剂盒,采用紫外分光光度法检测乳酸脱氢酶(LDH)释放率;原位末端标记技术(TUNEL)检测细胞凋亡率;应用RT-PCR检测相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表达;Western blotting检测Bcl-2、Bax、Caspase-3、细胞色素C(Cyt-C)及CLIC4蛋白水平。结果：与空白对照组比较, 100 μmol•L^-1 LPS组C6细胞凋亡率及LDH释放率增加(P<0.05),在mRNA水平上Bcl-2、Bax表达率未见明显改变(P>0.05),而Caspase-3表达率升高(P<0.05);在蛋白水平上,与空白对照组比较,Bcl-2、Bax、CLIC4及胞浆Cyt-C蛋白水平未见明显变化(P>0.05) ,而Caspase-3蛋白水平高于空白对照组(P<0.05)。与空白对照组比较,1 000 μmol•L^-1 H₂O₂组C6细胞凋亡率及LDH释放率增加(P<0.05);在mRNA水平上Bcl-2表达率低于空白对照组(P<0.05),Bax、Caspase-3表达率高于空白对照组(P<0.05);在蛋白水平上,Bcl-2蛋白表达低于空白对照组(P<0.05),Bax、Caspase-3、CLIC4及胞浆Cyt-C蛋白水平明显高于空白对照组(P<0.05)。与H₂O₂组和LPS组比较,LPS与H₂O₂联合作用组细胞凋亡率及LDH释放率明显增加(P<0.05),在mRNA水平上Bcl-2表达率下降(P<0.05),Bax、Caspase-3表达率升高(P<0.05);在蛋白水平上,Bcl-2蛋白表达低于对照组(P<0.05),Bax、Caspase-3及胞浆Cyt-C蛋白水平明显高于对照组(P<0.05),而CLIC4蛋白水平变化不明显(P>0.05)。结论：单独应用LPS能够激活Caspase-3信号通路,引起C6细胞早期凋亡,同时LPS能促进H₂O₂引起的C6细胞损伤,其机制可能与凋亡相关的Bcl-2/Bax及Caspase-3途径过度激活有关。线粒体氯通道蛋白CLIC4在此过程中作用不明显。     

白藜芦醇对Gc-1 spg细胞氧化应激损伤的作用研究

目的 观察白藜芦醇（RES）对过氧化氢H₂O₂诱导的小鼠精原细胞（Gc-1 spg）氧化应激损伤的作用。方法 H₂O₂复制Gc-1 spg细胞氧化应激损伤模型,设置空白组、H₂O₂组（800 μmol/L）、H₂O₂ +5 μmol/L RES组、H₂O₂ +10 μmol/L RES组和H₂O₂+15 μmol/L RES组。检测超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、乳酸脱氢酶（LDH）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平,CCK-8法检测细胞活力,JC-1试剂盒检测线粒体膜电位,Mito Tracker^?? Green FM试剂盒检测活细胞线粒体水平,Hoechst 33342染色检测细胞核凋亡率,Western blotting检测凋亡蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3表达。结果 浓度为800 μmol/L H₂O₂处理Gc-1 spg细胞6 h时达到实验要求（P <0.05）。与空白组比较,各H₂O₂组细胞活力降低（P <0.05）,与H₂O₂组比较,H₂O₂ +5 μmol/L RES组、H₂O₂+10 μmol/L RES组、H₂O₂ +15 μmol/L RES组细胞活力升高（P <0.05）。与空白组比较,各H₂O₂组的GSH-Px和SOD水平降低（P <0.05）,LDH和MDA水平升高（P <0.05）;与H₂O₂组比较,H₂O₂ +5 μmol/L RES组、H₂O₂+10 μmol/L RES组、H₂O₂ +15 μmol/L RES组GSH-PX和SOD水平降低（P <0.05）,LDH和MDA水平升高（P <0.05）。与空白组比较,H₂O₂组细胞的红/绿荧光比值降低,提示线粒体膜电位降低（P <0.05）;与H₂O₂组比较,H₂O₂+5 μmol/L RES组、H₂O₂ +10 μmol/L RES组、H₂O₂ +15 μmol/L RES组JC-1红/绿荧光比值升高（P <0.05）。与空白组比较,H₂O₂组细胞线粒体数明显减少（P <0.05）;与H₂O₂组比较,H₂O₂ +5 μmol/L RES组、H₂O₂+10 μmol/L RES组、H₂O₂ +15 μmol/L RES组细胞荧光强度升高（P <0.05）。与空白组比较,H₂O₂组大量细胞核皱缩、碎裂,染色程度明显增强,细胞凋亡严重;与H₂O₂组比较,H₂O₂ +5 μmol/L RES组、H₂O₂+10 μmol/L RES组、H₂O₂ +15 μmol/L RES组细胞凋亡率降低（P <0.05）。与空白组比较,H₂O₂组凋亡蛋白Bax和Caspase-3相对表达量增加（P <0.05）,Bcl-2相对表达量减少（P <0.05）;与H₂O₂组比较,H₂O₂ +5 μmol/L RES组、H₂O₂ +10 μmol/L RES组、H₂O₂ +15 μmol/L RES组Bax和Caspase-3相对表达量降低（P <0.05）,Bcl-2相对表达量增加（P <0.05）。结论 RES对H₂O₂诱导的Gc-1 spg细胞氧化应激损伤具有保护作用,这种保护作用与RES浓度有关。     

过氧化氢酶对SW480细胞线粒体和凋亡的影响

OBJECTIVE: To investigate the effects of catalase on the mitochondria and apoptotic behavior of SW480 cells treated by lipopolysaccharide (LPS), and the changes in intracellular expression of nuclear factor kappaB (NF-kappaB). METHODS: LPS-stimulated SW480 cells were treated with catalase and the changes in their mitochondria and apoptotic behavior were observed by transmission electron microscopy. The expression of NF-kappaB was detected by immunohistochemical method. RESULTS: Mitochondria damages and apoptosis were slightly diminished in the LPS-stimulated cells with catalase pretreatment, and the NF-kappaB expression was also decreased. CONCLUSION: Catalase protect the mitochondria of SW480 cells from damages by LPS and inhibit the cell apoptosis, possibly due to the activation of NF-kappaB.     

线粒体和细胞凋亡

线粒体在能量代谢和自由基代谢过程中占有十分重要的地位.线粒体产生大量超氧阴离子,并通过链式反应形成活性氧(reactive oxygen species,ROS),当ROS水平较低时,可促进细胞增生;而当ROS水平较高时,使得线粒体MPTP开放,不仅导致跨膜电位崩溃,也使细胞包素C外漏[1].     

线粒体细胞色素c释放抑制剂对大鼠全脑缺血再灌注损伤炎症反应的作用

目的探讨线粒体细胞色素c抑制剂对大鼠全脑缺血再灌注后脑损伤的作用,分析线粒体乙醛脱氢酶2（ALDH2）和炎症反应在其中的机制。方法通过四血管阻断法模拟大鼠全脑缺血再灌注损伤（I/R）模型,雄性SD大鼠随机分为假手术组（Sham组）、I/R组、ALDH2激动剂Alda-1+I/R组、Bax介导的线粒体细胞色素c释放抑制剂（Bcb）+I/R组。HE染色观察海马CA1区细胞形态学的变化;免疫组织化学观察海马CA1区ALDH2及炎症小体关键蛋白NLRP3表达水平,Western blotting检测海马CA1区4-HNE、NLRP3、IL-1β、IL-18及ALDH2的蛋白水平变化。结果与Sham组比较,I/R组再灌注7 d后,I/R组海马CA1区细胞存活率明显下降;与I/R组比较,Alda-1+I/R组、Bcb+I/R组的海马CA1区神经元存活率增高（P < 0.01）。与I/R组相比,Bcb+I/R组、Alda-1+I/R组海马CA1区ALDH2蛋白表达增加,海马CA1区NLRP3、IL-1β、IL-18、4-HNE蛋白表达下降（P < 0.01）。结论大鼠全脑缺血再灌注损伤模型中,海马CA1区NLRP3表达增高;Bcb可以通过促进线粒体ALDH2的表达、降低炎症反应发挥保护作用。     

过氧化氢对K562细胞凋亡的影响

目的 :探讨活性氧对K5 6 2细胞凋亡的影响。方法 :用过氧化氢 (hydrogenperoxide ,H2 O2 )作用于对数生长期的K5 6 2细胞。结果 :Hoechst 332 5 8染色法观察到K5 6 2细胞明显凋亡 ;caspase活性定量测定及WesternBlotting检测显示caspase 3, 8, 9同时被激活。结论 :H2 O2 可诱导K5 6 2细胞凋亡 ,且通过同时激活线粒体途径和死亡受体途径起作用。     

过氧化氢对关节软骨细胞过氧化损伤效应及中药黄芪干预实验研究

目的 观察过氧化氢对体外培养兔膝关节软骨细胞过氧化损伤效应及中药黄芪(astragalus)的干预作用,探讨黄芪抗氧化损伤作用机制.方法 兔膝关节软骨细胞原代培养,采用Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光法进行鉴定.分为正常对照组(正常组)、过氧化氢损伤对照组(损伤组)和过氧化氢损伤加黄芪干预组(黄芪组).损伤组采用终浓度 0.2mmol/L的过氧化氢制造体外软骨细胞过氧化损伤模型,黄芪组将终浓度分别为 0.02、0.1、0.5g/L的黄芪于过氧化氢损伤前 60min加入.测定各组细胞活力(MTT法)、细胞凋亡率(流式细胞术)、蛋白含量(考马斯亮蓝法)、培养上清液中丙二醛(MDA)含量(硫代巴比妥酸法)和SOD活性(邻苯三酚自氧化法).结果 与正常组比较,损伤组细胞活力显著降低、细胞凋亡率增加、蛋白含量下降、培养上清液中MDA水平显著上升、SOD活性和蛋白含量显著下降.黄芪组与损伤组比较,细胞活性显著升高、培养上清液中MDA水平显著降低、SOD活性和蛋白含量显著上升.结论 过氧化氢能造成体外软骨细胞显著的过氧化损伤,黄芪能抵抗体外软骨细胞过氧化损伤.     

丹参对体外关节软骨细胞抗过氧化氢损伤实验研究

目的观察过氧化氢(H2O2)对体外培养关节软骨细胞的损伤效应及丹参(salvia miltiorrhiza,SM)的干预作用。方法兔原代膝关节软骨细胞培养,Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光检测鉴定。将培养的软骨细胞随机分为正常组、损伤对照组(损伤组)和丹参组。损伤组用0.1mmol/L过氧化氢(终浓度)制造体外软骨细胞损伤模型,丹参组将不同浓度的丹参(终浓度0.01g/L、0.05g/L、0.25g/L)于过氧化氢损伤前30min加入,分别测定各组细胞活力(MTT法)、培养液上清中丙二醛(MDA)含量(硫代巴比妥酸法)、总蛋白含量(考马斯亮蓝法)及细胞DNA合成计数(氚标记脱氧嘧啶核苷酸法,3H-TdR法)。结果损伤组细胞活力显著降低、培养液上清MDA含量显著上升、蛋白含量及细胞DNA合成显著下降。丹参组细胞活性较损伤组显著升高、培养液上清MDA水平显著降低、蛋白含量及细胞DNA合成显著上升。结论丹参能抵抗过氧化氢造成的体外软骨细胞损伤。     

低浓度H2O2对HL-60细胞增殖的影响

目的探讨低浓度H2O2对同步化处理或未经处理的HL-60细胞作用的时间效应关系. 方法将培养的HL-60细胞进行同步化处理或取对数生长期细胞,施加不同浓度梯度的H2O2影响,作细胞计数,四唑盐（MTT）比色试验检测细胞生存率,流式细胞技术测定细胞周期分布. 结果低浓度H2O2作用组HL-60活细胞数明显高于未施加影响组,尤以H2O2终浓度为2 μmol*L-1组作用明显（P<0.01）,细胞周期也有轻度改变. 结论低浓度H2O2作用HL-60细胞可使细胞数增加,其影响有时间效应关系,机制可能同其影响细胞周期有关.     

过氧化氢通过内质网应激信号通路对Hela细胞自噬和凋亡的诱导作用

目的:利用过氧化氢(H₂O₂)构建人宫颈癌Hela细胞体外氧化应激模型,观察其对Hela细胞自噬和凋亡的影响,并探讨H₂O₂与内质网应激(ERS)信号通路之间的关系。方法:以1 mmol·L^-1 H₂O₂构建体外氧化应激模型;实验分为对照组、H₂O₂ 4 h组、H₂O₂ 8 h组和H₂O₂ 12 h组,各组细胞分别以H₂O₂作用0、4、8及12 h后,利用Western blotting法检测各组Hela细胞中ERS及凋亡、自噬相关蛋白表达。结果:与对照组比较,各H₂O₂组Hela细胞中Cleaved Caspase-3表达水平升高(P<0.05),Cleaved Caspase-4表达水平亦明显升高(P<0.05);各H₂O₂ 组Hela细胞中LC3-Ⅱ表达水平高于对照组(P<0.05),GRP78表达水平亦高于对照组(P<0.05);随着H₂O₂作用时间的延长,各H₂O₂组Hela细胞中IRE1a表达水平明显升高(P<0.01),p-JNK表达水平明显高于对照组(P<0.05)。结论:在H₂O₂所构建的体外氧化应激模型中H₂O₂能够诱导Hela细胞发生自噬和凋亡,且该诱导作用由ERS信号通路介导。     

热休克蛋白抑制过氧化氢所致C2C12细胞凋亡的机制

目的：探讨热休克蛋白抑制活性氧所致C2C12细胞凋亡的分子机制。方法：采用热休克对体外培养的C2C12细胞进行预处理,以诱导热休克蛋白的表达;Hoechst33258染色观察过氧化氢（H2O2）所致的C2C12细胞凋亡;凋亡蛋白酶活性检测试剂盒和Western-blotting检测凋亡蛋白酶-3,8,9的活性;细胞组分分离后Western-blotting检测细胞色素C的释放。结果：热休克预处理导致C2C12细胞热休克蛋白70,αB-晶状体蛋白表达明显增加,同时显著抑制过氧化氢所致细胞色素C从线粒体释放,抑制凋亡蛋白酶-3,8,9活化及随后的C2C12细胞凋亡。结论：热休克蛋白通过干预线粒体信号通路与死亡受体通路的活化抑制过氧化氢导致的C2C12细胞凋亡,从而为临床防治心血管疾病提供了新的信息。     

过氧化氢联合低频超声波诱导卵巢癌A2780/DDP细胞凋亡的研究

目的探讨过氧化氢联合超声波诱导人卵巢癌A2780/DDP细胞凋亡的效果。方法体外培养人卵巢癌A2780/DDP细胞,MTT法研究过氧化氢对卵巢癌A2780/DDP细胞生长抑制情况,选择过氧化氢对A2780/DDP细胞作用的合适作用参数;实验分为对照组,0.5 W/cm2、30 s超声组,10μmol/L过氧化氢组,10μmol/L过氧化氢联合0.5 W/cm2、30 s超声组;不同因素作用A2780/DDP细胞24 h后,Hoechst33258染色观察细胞形态变化;流式细胞仪检测各处理因素作用A2780/DDP细胞的凋亡率;Western blot检测各组细胞caspases-9蛋白表达量的改变。结果对照组,0.5 W/cm2、30 s超声组和10μmol/L过氧化氢组无明显凋亡改变,而10μmol/L过氧化氢联合0.5 W/cm2、30 s超声组与对照组之间比较,差异具有显著性(P<0.05)。结论过氧化氢联合超声波能增强诱导人卵巢癌A2780/DDP细胞凋亡的作用。     

刺五加叶皂苷B对过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡的抑制作用

目的：探讨刺五加叶皂苷B（C-B）对过氧化氢（H₂O₂）诱导的乳鼠心肌细胞凋亡的影响,阐明其对氧化应激损伤所致的心肌细胞凋亡的抑制作用。方法：乳鼠心肌细胞行原代培养,取自主搏动良好的心肌细胞随机分为正常对照组、H2O2 损伤组(200 μmol•L^-1H2O2诱导心肌细胞凋亡)、100 mg•L^-1C-B 组和200 mg•L^-1 C-B 组,倒置相差显微镜观察细胞形态,MTT法检测细胞存活率,AnnexinⅤ-FITC 流式细胞术检测凋亡率,分光光度法检测Caspase-3活性,免疫印迹法检测细胞Caspase-3、PARP、Bcl-2和Bax蛋白表达。结果：与正常对照组比较,200 μmol•L^-1H₂O₂组心肌细胞有损伤性改变,细胞
存活率明显降低（P<0.001）,凋亡率升高（P<0.001）,Caspase-3活性增加（P<0.01）,细胞Bcl-2蛋白表达减少,Caspase-3及Bax蛋白表达增多,PARP蛋白降解增多。与H2O2损伤组比较,100及200 mg•L^-1C-B组心肌细胞损伤性改变均减轻,细胞存活率增加（P<0.05或P<0.01）,凋亡率降低（P<0.001）,Caspase-3活性降低（P<0.05或P<0.01）,细胞Bcl-2蛋白表达增加,Bax蛋白表达和Caspase-3蛋白表达减少,PARP蛋白降解减少（依据电泳条带的宽窄及明暗度判断蛋白表达程度）,且200 mg•L^-1C-B组的作用更明显。结论：C-B对H₂O₂诱导的心肌细胞凋亡有一定的抑制作用,可能与其调节细胞内凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2、Bax的表达有关。     

NF-кB/Ⅰ-кB在过氧化氢所致心肌细胞损伤中的作用

目的探讨氧化应激损伤心肌细胞的分子机制.方法采用0.5 mmol/L过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)作用于原代培养的新生大鼠心肌细胞;末端标记检测细胞凋亡;Westernblot检测蛋白质含量;免疫组化检测NF-κB在细胞内的分布.结果①H2O2损伤3 h,心肌细胞死亡率和乳酸脱氢酶(LDH)释放率均较对照组明显升高(P＜0.01);②H2O2损伤24 h,末端标记发现大量凋亡细胞;Westemblot示NF-κB内源性抑制蛋白I-KB(inhibitor KB,I-KB)在H2O2损伤5 min即减少,15 min时减至最低,而后逐渐恢复;免疫组化显示H2O2损伤0.5 h可引起心肌细胞中NF-κB从胞浆向胞核移位;与单纯损伤组比,NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)能明显降低心肌细胞LDH释放率(P＜0.01).结论在H2O2所致心肌细胞损伤中,既有坏死,又有凋亡的发生,而NF-κB/I-κB信号通路的激活可能介导了H2O2所致的心肌细胞损伤.